Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche
28 marzo 2018
Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione simultanea delle thalamocortical assone ramificazione e sinapsi formazione in organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale. Thalamocortical singoli assoni e loro terminali presinaptici sono visualizzati mediante una tecnica di elettroporazione di singola cellula con DsRed e lo synaptophysin GFP-etichettato.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare i cambiamenti morfologici dinamici della ramificazione degli assoni e della formazione delle sinapsi nella proiezione talamocorticale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come la formazione di nuovi circuiti neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'osservazione simultanea della crescita degli assoni e della formazione delle sinapsi nelle singole cellule viventi.
Questo metodo può fornire informazioni sulla relazione tra la ramificazione degli assoni e la formazione delle sinapsi nelle proiezioni talamocorticali. Può anche essere applicato ad altri circuiti neurali, come la connessione intrinseca nella corteccia cerebrale. Per iniziare questa procedura, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% per 10 minuti o più.
Successivamente, seziona rapidamente l'intero cervello da un ratto postnatale del secondo giorno in anestesia ghiacciata. Quindi, metti il cervello in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 40 millilitri di soluzione salina bilanciata fredda di Hank. Sotto un microscopio binoculare, rimuovere con cura la materia pia con una pinza fine e tagliare la corteccia visiva e somatosensoriale primaria in fette spesse da 300 a 400 micron usando le forbici microchirurgiche.
Successivamente, trasferire le fette corticali sul filtro a membrana dell'inserto di coltura utilizzando una pipetta di plastica monouso. Regolare le posizioni delle fette vicino al centro dell'inserto di coltura con la pipetta di plastica monouso e rimuovere il terreno in eccesso dall'inserto. Mantenere le fette nel terreno di coltura contenente siero a 37 gradi Celsius e coltivarle da sole per un giorno prima di posizionare un blocco talamico da un embrione E15 accanto ad esso.
Regolare il livello del fluido leggermente al di sotto della superficie della fetta, in modo che le fette possano ricevere un apporto sufficiente sia di gas che di fluido. Questo è fondamentale per la vitalità delle fette. In questa fase, realizzare i capillari di vetro con un estrattore di elettrodi.
Quindi rompere le punte dei capillari di vetro per l'iniezione di plasmidi. Per le pipette degli elettrodi, macinare e lucidare le punte dei capillari di vetro con carta vetrata. E poi lucidarli a fuoco per ottenere un diametro interno da 50 a 200 micron.
Quindi, collegare la pipetta dell'elettrodo e la pipetta di espulsione ai manipolatori. Trasferire cinque microlitri di soluzione plasmidica in una capsula di Petri. Quindi aspirare la soluzione nella pipetta dell'elettrodo con azione capillare.
Inserire l'elettrodo di 0,2 millimetri di diametro nella pipetta dell'elettrodo. Dopo aver collegato la pipetta di eiezione a una siringa da un millilitro con un tubo di plastica, trasferire nuovamente cinque microlitri di soluzione plasmidica in una capsula di Petri. Quindi aspirare lentamente la soluzione nella pipetta di eiezione utilizzando la siringa.
Successivamente, trasferire la cocoltura nella fase di elettroporazione e inserire l'elettrodo di un millimetro di diametro nel terreno di coltura. Successivamente, posizionare la pipetta di espulsione sul blocco talamico coltivato. Spingere manualmente la siringa dopo che la punta tocca la superficie del blocco talamico.
Posizionare la pipetta dell'elettrodo sul blocco talamico subito dopo la retrazione della pipetta di eiezione. Ora, eroga gli impulsi elettrici. Monitora l'ampiezza e il numero di treni sull'oscilloscopio.
Successivamente, ritrarre la pipetta dell'elettrodo e rimettere la piastra nell'incubatrice. Per osservare il campione, posizionare il piatto di coltura sul tavolino di un microscopio confocale verticale dotato di due set di filtri per EGFP e DsRed. Quindi scatta immagini da 10 a 25 sezioni ottiche, con incrementi da uno a sette micron, con un obiettivo a lunga distanza di lavoro 20x.
Seleziona assoni marcati individualmente distinguibili, che esprimono sia DsRed che Syp-EGFP. Qui è mostrata una cocoltura organotipica di fette talamiche e corticali dopo 12 DIV. Ecco un'immagine ingrandita della regione in scatola.
Ed ecco una cellula talamica marcata con DsRed che estende un assone nella fetta corticale e forma rami negli strati superiori. Queste immagini mostrano l'assone talamocorticale marcato con DsRed e i puncta Syp-EGFP. È stato osservato un discreto accumulo di Syp-EGFP lungo un singolo assone talamocorticale.
I plasmidi DsRed e Syp-EGFP sono stati introdotti in cellule talamiche in coltura a un DIV mediante elettroporazione. Questo assone è stato ripreso quotidianamente per quattro giorni. La ramificazione degli assoni e la formazione delle sinapsi erano dinamiche, con addizione ed eliminazione.
Seguendo queste procedure, l'elettroporazione con geni interessanti insieme a Syp-EGFP e DsRed può essere eseguita al fine di studiare il ruolo del gene nella ramificazione degli assoni e nelle formazioni sinapsiche. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare i meccanismi dei cambiamenti dinamici dei circuiti neurali.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per l'acquisizione simultanea della ramificazione degli assoni talamocorticali e della formazione delle sinapsi in colture organotipiche di cocultura tra talamo e corteccia cerebrale. Si concentra sui cambiamenti morfologici dinamici della proiezione talamocorticale, fornendo informazioni sulla formazione di nuovi circuiti neurali e sulla relazione tra crescita assonale e sviluppo sinaptico.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Neuroscienze
- Neurobiologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Le proiezioni talamocorticali svolgono un ruolo fondamentale nell'elaborazione sensoriale.
- Comprendere la ramificazione degli assoni e la formazione delle sinapsi è essenziale per ottenere informazioni sulla formazione dei circuiti neurali.
- I metodi attuali presentano limitazioni nell'osservare contemporaneamente questi cambiamenti a livello cellulare.
- Lo studio migliora le tecniche di imaging in contesti di cellule vive.
Scopo dello studio
- Studiare i cambiamenti morfologici dinamici durante la ramificazione dell'assone e la formazione delle sinapsi.
- Fornire un metodo che consenta l'osservazione di singole cellule vive in coltura co-coltivata.
- Valutare la relazione tra la crescita dell'assone e lo sviluppo sinaptico nei neuroni talamocorticali.
Metodi Utilizzati
- Sono state utilizzate colture cocliniche organotipiche di fette talamiche e corticali.
- Il tessuto di ratto del secondo giorno postnatale è stato utilizzato per creare il modello biologico.
- È stata eseguita l'elettroporazione per introdurre marcatori fluorescenti per l'analisi mediante imaging.
- Le colture sono state mantenute a 37 gradi Celsius ed osservate in specifici punti temporali dello sviluppo.
- L'analisi mediante imaging è stata effettuata utilizzando un microscopio confocale per catturare la dinamica assonale.
Risultati principali
- Sono stati osservati cambiamenti dinamici nella ramificazione degli assoni e nella formazione delle sinapsi, evidenziando la plasticità delle proiezioni talamocorticali.
- È stata notata un'accumulazione discreta di marcatori sinaptici lungo gli assoni, indicativa di uno sviluppo sinaptico in corso.
- La tecnica ha permesso l'osservazione in tempo reale di cambiamenti morfologici in singole cellule.
- I risultati sottolineano il potenziale per lo studio del ruolo dei geni nella dinamica degli assoni e delle sinapsi.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un nuovo metodo per esplorare la dinamica e la plasticità dei circuiti neurali.
- Fornisce informazioni sull'accoppiamento tra la crescita dell'assone e la formazione delle sinapsi.
- I risultati hanno implicazioni per la comprensione dei meccanismi di connettività neurale e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la visualizzazione simultanea della ramificazione assonica e della formazione delle sinapsi in circuiti neurali viventi, affrontando una lacuna meccanicistica fondamentale nella validazione degli obiettivi nello sviluppo neurologico. Fornendo dati dinamici con risoluzione a livello di singola cellula sulla plasticità strutturale, esso aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, in cui la riduzione del rischio meccanicistico relativamente a target sinaptici è cruciale. L'approccio garantisce una continuità traslazionale dal chiarimento meccanicistico alla valutazione preclinica di fenotipi a livello di circuito in modelli di malattie neuropsichiatriche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche che collegano la morfologia dell'assone alla connettività sinaptica nei percorsi talamocorticali.
- Valore operativo: Preserva l'architettura laminare e la viabilità neuronale per l'osservazione longitudinale di cambiamenti strutturali dinamici.
- Valore scientifico: Favorisce la riduzione del rischio biologico chiarificando le relazioni causali tra crescita strutturale e sinaptogenesi funzionale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative e multiplex di ramificazione assonale e accumulo di marcatori presinaptici per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Consente la preparazione di sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi in percorsi di neurosviluppo.
- Valore operativo: Facilita flussi di lavoro di imaging scalabili e riproducibili, compatibili con letture fluorescenti multiplex.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: È in linea con sistemi rilevanti per le malattie in cui la disconnessione talamocorticale contribuisce a fenotipi sensoriali e cognitivi.
- Valore operativo: Garantisce continuità dallo screening meccanicistico nella fase di scoperta alla validazione preclinica del ripristino a livello di circuito.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio, collegando la dinamica strutturale agli esiti sinaptici funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo l'osservazione diretta della plasticità strutturale che precede i risultati dei saggi funzionali nei modelli di circuiti neurali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su geni che regolano la dinamica della ramificazione assonica e la formazione di siti sinaptici in circuiti viventi.
- Screening: Fornisce dati morfologici e di punti fluorescenti quantitativi pronti per saggi, utili per il profilo degli effetti dei composti.
- Analisi: Permette il confronto statistico della frequenza di ramificazione e della densità sinaptica tra diverse condizioni sperimentali nel tempo.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a modelli preclinici di disturbi dello sviluppo neurologico caratterizzati da alterazioni delle vie talamocorticali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per la valutazione multiparametrica della neuritogenesi e della sinaptogenesi in diversi modelli neurali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità nelle relazioni struttura-funzione durante l'assemblaggio dei circuiti neurali.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro di imaging a doppio canale per un monitoraggio coerente e longitudinale della dinamica assonale e sinaptica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze meccanicistiche sull'interazione del bersaglio con i percorsi di plasticità strutturale.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, basandosi su effetti validati sull'accoppiamento assone-sinapsi in circuiti rilevanti per l'uomo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manutenzione di colture cocellulari organotipiche, nell'elettroporazione e nella microscopia confocale.
- Dipende da strumentazione chirurgica sterile, dalla preparazione delle micropipette e dalla qualità del DNA plasmidico per un'efficace trasfezione.
- Necessita di un controllo ambientale a 37°C e di un mezzo contenente siero per mantenere la vitalità delle sezioni per diversi giorni.
- L'adattamento a circuiti neurali alternativi richiede la validazione della compatibilità del tessuto e dell'efficienza dell'elettroporazione.
- I limiti pratici includono la variabilità dell'efficienza di trasfezione e la necessità di un'analisi post hoc delle immagini per quantificare la dinamica della ramificazione e delle puncta.
