Name: Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Scopri la ramificazione assonale talamocorticale e la formazione sinaptica in coculture organotipiche di ratto. Questo metodo consente l'osservazione simultanea della crescita assonale e dello sviluppo sinaptico in cellule viventi.

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Ringraziamo anche Gabriel Hand per lettura critica.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida stabilite dalle commissioni sul benessere degli animali dell'Università di Osaka e il Giappone Neuroscience Society.
1. organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale
Nota: Per la procedura dettagliata, vedere l'originale pubblicazioni7,8,13. Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. Ratti Sprague-Dawley (deviazione standard) sono utilizzati per colture neuronali.
<ol><li>
Preparazione dei reagenti Nota: Volumi dei seguenti reagenti sono per il cervello di un ratto.<ol>
<li>
Preparare 10 x modificate N2 supplemento 13: insulina (50 μg/mL), progesterone (200 nM), idrocortisone (200 nM), selenito di sodio (300 nM), transferrina (1 mg/mL), putrescina (1 mM), glucosio (60 mg/mL)</li>
		<li>
Terreno di coltura contenente siero preparare (10 mL): 85% DMEM/F12, supplemento del 10% x 10 per volta N2, 5% siero bovino fetale (FBS)</li>
		<li>
Mezzo di coltura privo di siero preparare (20 mL): 90% DMEM/F12, supplemento del 10% x 10 per volta N2</li>
		<li>Preparare soluzione collagene coda di ratto (0,5 mL). In breve, prendere fibre tender da una coda di topo in condizioni sterili e incubare in soluzione di acido acetico durante la notte. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante (pochi mg/mL) e conservare in un frigorifero13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di piatti di cultura
	<ol>
<li>Collocare un inserto di membrana in una capsula di Petri da 35 mm.</li>
		<li>Aggiungere 40-50 μL di soluzione di collagene di ratto coda alla membrana e diffondere la soluzione di collagene intorno al centro.</li>
		<li>La membrana completamente in un banco pulito asciugare all'aria.</li>
		<li>Mettere 1,5-2 mL di terreno di coltura contenente siero nel piatto, in modo che la membrana è impregnata con il mezzo.</li>
		<li>Posizionare la piastra di coltura in un incubatore (37 ° C, aria umidificata 95% e 5% CO2) prima di placcatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di fette corticali
	<ol>
<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% per 10 minuti o più.</li>
		<li>Sezionare l'intero cervello rapidamente da un giorno postnatale (P) 2 ratto sotto anestesia ghiacciata (immerso in cubetti di ghiaccio per pochi minuti).</li>
		<li>Posto il cervello in un 100mm di Petri contenente 100 mL di freddo Hanks soluzione salina equilibrata.</li>
		<li>Rimuovere la materia di pia dal cervello con una pinzetta e tagliare fette corticali (300-400 μm di spessore) dalla corteccia visiva e somatosensoriale con microsurgical forbici (per dettagli, vedere la Figura 1). Nota: Lo spessore delle fette corticali è circa dalla scala di griglie sotto un microscopio binoculare. Nota: In alternativa, fette corticali possono essere fatta con una vibratome in condizioni sterili.</li>
		<li>Trasferire alcune fette corticali sul modulo di membrana con una pipetta di plastica monouso.</li>
		<li>Regolare le posizioni delle fette vicino al centro dell'inserto cultura con una pipetta di Pasteur lucidati a fuoco (per dettagli, Vedi8,13) e rimuovere l'eccesso del prodotto dall'inserto. Nota: Regolare il livello del mezzo leggermente sotto la superficie delle fette di modo che le fette possano ricevere un approvvigionamento sufficiente di gas sia medio. Questo è fondamentale per la vitalità cellulare.</li>
		<li>Mantenere le fette nel terreno di coltura contenente siero a 37 ° C in un ambiente di umidificata 95% aria e 5% CO2e cultura da solo per un giorno prima di un blocco thalamic è preso e messo accanto ad essa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di blocchi thalamic
	<ol>
<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% per 10 minuti o più.</li>
		<li>Anestetizzare un ratto incinto (giorno 15) tramite l'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50 mg/kg) contenenti anestetico.</li>
		<li>Sezionare ogni embrione da corni uterini e inserire gli embrioni in un 100mm di Petri contenente 100 mL di soluzione salina bilanciata di freddo Hanks'.</li>
		<li>Sotto un microscopio binoculare, rimuovere il cervello da ogni embrione e tagliare i blocchi thalamic che contengono prevalentemente il nucleo genicolato laterale e complesso (circa 0,5 mm x 3) ventrobasale7 utilizzando forbici microsurgical (Vedi Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura e mantenere organotipiche cocultures
	<ol>
<li>Utilizzando una pipetta Pasteur, posizionare il blocco thalamic accanto la superficie ventricolare della fetta corticale che è stato messo sulla membrana filtrante.</li>
		<li>Mantenere i cocultures nel terreno di coltura contenente siero a 37 ° C in un ambiente di aria umidificata 95% e 5% CO2.</li>
		<li>Cambio di metà del mezzo con il mezzo di coltura privo di siero dopo due giorni di cultura. Da allora in poi, scambiare il mezzo ogni 2-3 giorni. Nota: Il livello del mezzo dovrebbe essere controllato dopo il cambio medio, quanto è importante per la sopravvivenza delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. elettroporazione
Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili.
Nota: Eseguire l'elettroporazione un giorno dopo la preparazione dei blocchi thalamic per evitare il distacco dei blocchi.
<ol><li>
Plasmidi
	<ol>
<li>Fare una miscela di plasmidi come segue: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL. Nota: Purificare entrambi plasmidi utilizzando un kit di Maxiprep privo di endotossina e sciogliere in soluzione salina bilanciata di Hanks'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installazione di apparecchiature di elettroporazione Gli strumenti elettrici come uno stimolatore e un isolatore devono essere collegati come mostrato nella Figura 2.<ol>
<li>Collegare lo stimolatore del sezionatore bifase.</li>
		<li>Collegare un elettrodo (un diametro di 0,2 mm di filo d'argento) al terminale negativo dell'isolatore.</li>
		<li>Collegare un elettrodo (un diametro di 1 mm di filo d'argento) in serie ad un resistore da 100 Ω e il terminale positivo dell'isolatore.</li>
		<li>Collegare l'amplificatore all'oscilloscopio per monitorare se correnti elettriche vengono passate attraverso il resistore misurando la tensione con l'amplificatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle pipette in vetro Nota: Due tipi di pipette in vetro vengono utilizzati per espulsione della soluzione plasmide e l'applicazione di impulsi elettrici.<ol>
<li>Rendere le pipette da capillari di vetro con un estrattore di elettrodo.</li>
		<li>Rompere la punta per la pipetta di espulsione (il diametro della punta dovrebbe essere 20-50 μm).</li>
		<li>Levigare e lucidare la punta della pipetta elettrodo con carta vetrata seguita da fuoco-lucidatura (diametro interno dovrebbe essere 50-200 μm). Nota: La punta dell'elettrodo deve essere piana e liscia, come tocca direttamente il tessuto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura di elettroporazione
	<ol>
<li>Collegare le pipette di espulsione e l'elettrodo per i manipolatori.</li>
		<li>Inserire un filo d'argento (0,2 mm di diametro) nella pipetta elettrodo.</li>
		<li>Allegare la pipetta di espulsione per una siringa da 1 mL con un tubo di plastica.</li>
		<li>Prendere > 5 μL di soluzione di plasmide nella pipetta espulsione di aspirazione di siringa.</li>
		<li>Mettere il coculture sul palco di elettroporazione e inserire l'elettrodo di diametro 1 mm nel terreno di coltura.</li>
		<li>Luogo della pipetta di espulsione il explant thalamic.</li>
		<li>Spingere manualmente la siringa dopo la punta tocca la superficie del blocco thalamic. Nota: Circa 0,5 μL del plasmide soluzione è usato solitamente per un blocco thalamic.</li>
		<li>Inserire la pipetta elettrodo sul blocco thalamic subito dopo retrazione della pipetta espulsione.</li>
		<li>Fornire impulsi elettrici (50-400 μA, treni di 3-5 di 200 impulsi quadrati di durata di 1 ms a 200 Hz). Monitorare l'ampiezza e il numero dei treni sull'oscilloscopio. Nota: L'ampiezza delle correnti elettriche dipende dal diametro interno di un elettrodo pipetta13.</li>
		<li>Ritrarre la pipetta di elettrodo e riporre la piastra nell'incubatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osservazione al microscopio
	<ol>
<li>Mettere la piastra di coltura su un palco al microscopio di un microscopio confocale verticale dotato di due set di filtri per EGFP (eccitazione, 488 nm; emissione, 515 nm) e DsRed (eccitazione, 514 nm; emissione, 565 nm).</li>
		<li>Prendere le immagini di 10-25 sezioni ottiche dimensioni µm-passo 1-7 con un 20 X lungo-lavoro distanza lente dell'obiettivo. Selezionare singolarmente distinguibili con etichettati assoni che esprimono sia DsRed e SYP-EGFP. Nota: L'area osservata è di circa 0,7 x 0,7 mm (corrispondente a 1024 x 1024 pixel, cioè, 0.68 μm/pixel).</li>
		<li>Catturare immagini ogni 24 h per l'imaging quotidiana. Completare entro 10 min a temperatura ambiente e restituire le culture nell'incubatore. Imaging di decadenza breve intervallo di tempo, per mantenere la cultura in un alloggiamento della coltura, che mantiene che l'ambiente di umidificata 95% aria e 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
<li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+development%3A+how+are+we+going+to+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li>
<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
<li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dynamics.</a> Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li>
<li>Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation%3A+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li>
<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo attuale è anche un potente strumento per studiare aspetti inerenti allo sviluppo della crescita assoni diversi da quelli dei TC proiezione11. Per esempio, una combinazione di cultura corticale fetta e la tecnica di elettroporazione consente di visualizzare singola axonal morfologia dei neuroni corticali e a lungo termine osservazione9,18.
Utilizzando il protocollo attuale, i ruoli dei geni interess...

La proiezione di thalamocortical (TC) nel cervello dei mammiferi è un sistema adatto per studiare assone di orientamento e di meccanismi di targeting. Durante lo sviluppo, assoni sensoriali TC crescono nella placca corticale e rami di forma e sinapsi preferenzialmente in strato IV delle aree sensoriali primarie in corteccia cerebrale1,2. Anche dopo l'istituzione di collegamenti fondamentali, pergolati assonale e terminali sinaptici sono state rimodernate a seconda dei cambiamenti ambientali3,4. Tuttavia, come la morfologia dell'assone TC dinamicamente è alterata è capita male. Uno dei motivi principali è la mancanza di un'adeguata tecnica di osservare i cambiamenti strutturali a livello di singola cellula. Anche se recenti sviluppi nella microscopia, come il microscopio a due fotoni, hanno permesso l'osservazione diretta dei neuroni corticali vivente in vivo, non ci sono limitazioni ancora tecniche per catturare il generale TC traiettorie5, 6. Pertanto, metodi in vitro per l'imaging dal vivo degli assoni TC sarebbero forniscono potenti strumenti per le analisi strutturali della formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone.
Il nostro gruppo per la prima volta stabilito un metodo di coltura slice statico con membrana permeabile7. Utilizzando questo metodo, una fetta di corticali del ratto è stato cocultured con un blocco sensoriale talamico e connessioni TC della lamina specifiche erano ricapitolate in questo organotipiche cocultures7,8. Etichettatura di tipo sparse con una proteina fluorescente ulteriormente ci ha permesso di osservare la crescita assonale TC e ramo formazione9,10,11. Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la rappresentazione simultanea di ramificazione e formazione di sinapsi di singoli assoni di TC nell'organotipiche cocultures12. Per visualizzare contemporaneamente TC assoni e siti presinaptici, DsRed e lo synaptophysin EGFP-etichetta (SYP-EGFP) erano co-trasfettate in un piccolo numero di neuroni talamici mediante elettroporazione del coculture organotipiche. Il metodo corrente facilita l'analisi morfologica degli assoni di TC e permette per l'osservazione a lungo termine, che può essere utilizzato per mostrare la relazione causale tra formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma& nbsp;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Wako Puro Chemical Industries</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Inserto Millicell-CM Millipore</td><td></td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm</td><td>BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>Piastra di Petri sterrile</td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K210006</tr><tr><td>Pipette sterili monouso in</td><td></td> plastica <td>202-IS</td><td>pipette di trasferimento sterili</td></tr><tr><td>Capillare in vetro: OD 1,2 mm</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; Diametro interno G-1.2</td><td>, 1,2 mm</td></tr><tr><td>Filo d'argento: 0,2 e 1 mm</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (diametro, 0,2 mm), AG-401485 (diametro, 1,0 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore&nbsp;</td><td>A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>Isolatore bifasico&nbsp;</td><td>BAK ELECTRONICS</td> Amplificatore <td>BSI-2</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>Modello 1800</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Supporto universale Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td></td>Sistema di illuminazione <td>Olympus</td><td>SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>Light&nbsp;</td>Estrattore di elettrodi <td>Olympus</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>Digital eclipse C1 laser</td><td></td></tr><tr><td>x20 obiettivo</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Camera di coltura</td><td>Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) ratto</td><td>Giappone SLC e Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici per microchirurgia</td><td>Natsume&nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione di thalamocortical axon ramificazione e synapse formazione in cocultures organotipiche

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone sono processi cruciali per stabilire precisi circuiti neuronali. Durante lo sviluppo, gli assoni sensoriali thalamocortical (TC) formano rami e sinapsi in livelli specifici della corteccia cerebrale. Nonostante l'evidente correlazione spaziale tra formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone, la relazione causale tra di loro è capita male. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato un metodo per l'acquisizione simultanea delle formazione ramificazione e sinapsi dei singoli assoni di TC in cocultures organotipiche.
Questo protocollo descrive un metodo che consiste di una combinazione di un coculture organotipiche e l'elettroporazione. Organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale facilitare la manipolazione del gene e l'osservazione dei processi di axonal, preservando le strutture caratteristiche come configurazione laminare. Due plasmidi distinti codifica DsRed e lo synaptophysin EGFP-etichetta (SYP-EGFP) sono state co-trasfettate in un piccolo numero di neuroni talamici da una tecnica di elettroporazione. Questo metodo ci ha permesso di visualizzare singole axonal morfologie dei neuroni di TC e loro siti presinaptici simultaneamente. Il metodo attivato anche l'osservazione a lungo termine che ha rivelato il rapporto causale fra formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone.

L'esperimento qui descritto mira a rivelare la relazione tra formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone TC. Per visualizzare contemporaneamente axonal traiettorie e posizioni dei siti presinaptici, singoli o poche cellule thalamic in cocultures organotipiche transfected con due plasmidi codifica SYP-EGFP e DsRed usando l'elettroporazione. Durante la seconda settimana di cultura, gli assoni TC individualmente distinguibili erano chiaramente etichettati da DsRed (<strong class="xfig"...

Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione simultanea delle thalamocortical assone ramificazione e sinapsi formazione in organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale. Thalamocortical singoli assoni e loro terminali presinaptici sono visualizzati mediante una tecnica di elettroporazione di singola cellula con DsRed e lo synaptophysin GFP-etichettato.

Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare i cambiamenti morfologici dinamici della ramificazione degli assoni e della formazione delle sinapsi nella proiezione talamocorticale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come la formazione di nuovi circuiti neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'osservazione simultanea della crescita degli assoni e della formazione delle sinapsi nelle singole cellule viventi.Questo metodo può fornire informazioni sulla relazione tra la ramificazione degli assoni e la formazione delle sinapsi nelle proiezioni talamocorticali. Può anche essere applicato ad altri circuiti neurali, come la connessione intrinseca nella corteccia cerebrale. Per iniziare questa procedura, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% per 10 minuti o più.Successivamente, seziona rapidamente l'intero cervello da un ratto postnatale del secondo giorno in anestesia ghiacciata. Quindi, metti il cervello in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 40 millilitri di soluzione salina bilanciata fredda di Hank. Sotto un microscopio binoculare, rimuovere con cura la materia pia con

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Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.

Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizzo di metodologie combinate per definire il ruolo del rilascio della membrana plasmatica durante la ramificazione degli assoni e la morfogenesi neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra una tecnica di imaging dal vivo che utilizza la microscopia a contrasto interferenziale differenziale (DIC) per osservare la ramificazione assonale in tempo reale nei neuroni corticali. I video time-lapse catturano gli effetti del trattamento con netrina-1, una molecola...

Imaging in vitro in tempo reale della ramificazione assonale nei neuroni corticali di topo

Il organotipico coculture fetta cervello con cellule di carcinoma consente la visualizzazione cambiamenti morfologici mediante fluorescenza e campo chiaro (video) microscopia durante il processo di carcinoma invasione delle cellule del tessuto cerebrale. Questo modello di sistema permette anche approcci di scambio cellulare e di rifornimento e offre una vasta gamma di manipolazioni e analisi.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

L'utilizzo di più angoli per tagliare il cervello di topo cucciolo, miglioriamo su una fetta cerebrale acuto precedentemente descritto, che cattura le connessioni tra le maggiori strutture mesencefalo e proencefalo uditive.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

Qui vi presentiamo un protocollo che si basa su fette midollo spinale coltivate su array multi-elettrodo per studiare la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali in vitro.

Indagare rigenerazione funzionale in organotipiche midollo spinale Co-culture Grown in array multi-elettrodo

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per ottenere sezioni appiattite tangenziale da cortecce dei mammiferi e visualizzare moduli corticali usando istochimiche e immunohistochemical metodi.

Visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite

In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell'attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Le interazioni neurone-glia nella neurodegenerazione non sono ben comprese a causa di strumenti e metodi inadeguati. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per ottenere neuroni indotti, cellule precursori degli oligodendrociti e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti umane e forniamo esempi dei valori di questi metodi nella comprensione dei contributi specifici del tipo di cellula nella malattia di Alzheimer.

Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Le aree sensoriali primarie nella neocorteccia mostrano attività spontanee uniche durante lo sviluppo. Questo articolo descrive come visualizzare le attività dei singoli neuroni e le aree sensoriali primarie per analizzare le attività sincrone area-specifiche nei topi neonatali in vivo.

Visualizzazione in vivo dell'attività spontanea nella corteccia sensoriale del topo neonatale con risoluzione di un singolo neurone

Scopri la ramificazione assonale talamocorticale e la formazione sinaptica in coculture organotipiche di ratto. Questo metodo consente l'osservazione simultanea della crescita assonale e dello sviluppo sinaptico in cellule viventi.

Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche

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