Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

L'obiettivo di questa procedura è quello di coltivare neuroni primari in presenza di uno strato di glia che ne supporta la crescita. Questi neuroni possono essere successivamente isolati come una popolazione pura di neuroni per l'analisi. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule gliali primarie.

Il secondo passo consiste nella sottocoltura delle cellule gliali su una superficie che si opporrà ai neuroni coltivati. Quindi gli strati di cellule gliali neuronali vengono combinati in un sistema di co-coltura stabile. In definitiva, l'analisi citochimica mostra lo sviluppo di uno strato puro di neuroni maturi.

Ciao, mi chiamo Anna T e sono una studentessa del laboratorio Dr.Olympia Muci della Drexel University. Qui dimostreremo come coltivare i neuroni corticali in presenza di uno strato di alimentazione gliale. Si tratta di una tecnica che è stata originariamente sviluppata da Gary Banker e colleghi e appresa dal laboratorio del Dr.Muci e Richard Miller presso l'Università di Chicago, che abbiamo poi adattato alle nostre esigenze sperimentali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla coltura neuronale pura è che i fattori trofeo rilasciati dalla glia supportano la crescita e la differenziazione neuronale. Mentre i neuroni possono essere successivamente isolati come una popolazione pura. Per prepararsi alla dissezione, posizionare gli strumenti sterili in etanolo al 70%, aggiungere quattro millilitri di dissezione a freddo, piatti da medi a 60 millimetri, quindi scongelare il 2,5% di trip e il DNA sul ghiaccio.

Dopo aver decapitato i cuccioli di due o quattro giorni, metti le teste in un piatto sterile da 100 millimetri per ogni testa. Fai un taglio della linea mediana attraverso la pelle e tira indietro la pelle per esporre il cranio. Quindi usa un paio di forbici curve per eseguire un taglio sulla linea mediana e due tagli laterali attraverso il cranio senza danneggiare il tessuto cerebrale sottostante.

Successivamente, rimuovere la parte superiore del cranio per esporre il cervello, quindi estrarre il cervello e metterlo nel piatto da 60 millimetri con quattro millilitri di dissezione a freddo, mezzo preparato in precedenza sotto uno stereomicroscopio. Separare gli emisferi, rimuovere il mesencefalo e staccare le meningi. Raccogli tutte le cortecce cerebrali sezionate in un nuovo piatto da 60 millimetri con terreno di dissezione freddo fresco.

Quindi tritare il fazzoletto con un paio di forbici ricurve. Successivamente trasferire il fazzoletto macinato in una provetta sterile da 15 millilitri. Portare il volume a 4,5 millilitri con il terreno di dissezione a freddo e aggiungere 500 microlitri di 2,5% di viaggi.

Quindi avvolgere il tubo in pellicola para e metterlo a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Nel frattempo mescolate capovolgendo il tubetto ogni cinque minuti. Quindi, trasferire il tessuto in una nuova provetta da 15 millilitri e cercare di ridurre al minimo il trasferimento del mezzo di dissezione contenente tripsy nella provetta.

Ora portare il volume finale a 4,8 millilitri con terreno di dissezione fresco e aggiungere 200 microlitri di DNA a una concentrazione finale di 60 microgrammi per millilitro. Quindi triturare delicatamente con una pipetta sterile da cinque millilitri circa 20 volte e aggiungere 10 millilitri di terreno di placcatura gli. Attendere quattro o cinque minuti affinché i grandi pezzi di tessuto si depositino sul fondo.

Successivamente, trasferire l'80% superiore della sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri. Quindi ripetere la durata del tessuto con altri due o tre millilitri di placcatura GL. Medio. Ancora una volta, lascia che il tessuto si depositi.

Trasferisci successivamente l'80% superiore alla collezione precedente. Portare il volume totale a 20 millilitri. Quindi, centrifugarlo per 15 minuti a 280 volte G.Successivamente, aspirare il supinato e risospendere la tavolozza cellulare in cinque-sette millilitri di terreno di placcatura ggl.

Quindi aggiungere ulteriore piastra, da medio a 10 millilitri per ogni cervello sezionato e mescolare bene le cellule. Piastra 10 millilitri di sospensione cellulare in ogni pallone quadrato da 75 centimetri. Successivamente, incubare il pallone di coltura a 37 gradi Celsius.

Cambiare il terreno di coltura dopo 24-48 ore, quindi ogni tre o quattro giorni per preparare i vetrini di copertura Therman. I vetrini di copertura in plastica utilizzati un gin secondario di coltura aggiungono tre piccole gocce di cera para plast fusa attorno alla circonferenza di ciascun thermadox lavato e sterilizzato in autoclave. Le celle saranno placcate su questo lato del thermadox.

I nostri thermon sono inserti riutilizzabili da 60 millimetri fatti a mano con fori di circa 52 millimetri. Sebbene disponibili in commercio, possono essere utilizzati anche inserti per pozzi di coltura. Il passaggio successivo consiste nel lavare due volte il ggl primario con PBS.

Agitare energicamente ogni pallone per rimuovere eventuali cellule non attaccate. Ogni fiaschetta con ggl primario confluente fornirà circa 10 milioni di astroglia. Pertanto, spesso utilizziamo da due a quattro fiasche per esperimento.

Quindi, staccare le celle con lo 0,05% di viaggi in EDTA. Combinare le celle di due fiasche in una provetta conica da 50 millilitri e aggiungere una quantità uguale di terreno di placcatura ggl, quindi centrifugare per 15 minuti a 280 volte la gravità. Aspirare il supinato e sciogliere i pellet GL in pochi millilitri di placcatura GL. Medio.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare secondo necessità. Quindi piastra 500, 000 celle su piastre da 60 millimetri o su vetrini di copertura termici utilizzando il mezzo di placcatura GL per la piastra thermon. 600 microlitri di cellule su ciascun vetrino coprioggetto in modo goccia a goccia e, dopo due ore, capovolgere ogni thermadox per immergere le cellule nel mezzo di placcatura gliale.

Se si preparano piastre da 60 millimetri di glia secondaria per vetrini di copertura neuronali, cambiare il mezzo per terminare due la sera prima della dissezione neuronale. In questa procedura, per preparare i vetrini coprivetri da 15 millimetri, aggiungere tre piccole gocce di para blast fusi. Cerare intorno alla circonferenza di ogni vetrino coprioggetto sterile per separare fisicamente gli strati cellulari e prevenire il raschiamento delle cellule.

Il coperchio scivola tutte le piastre da 60 millimetri con 0,5 milligrammi per millilitro di polilisina per due ore o durante la notte. Quindi lavarli con acqua sterile due o tre volte e lasciarli asciugare completamente Per preparare la dissezione neuronale. Eutanasia di un ratto incinta di 17 giorni.

Spruzzalo con etanolo al 70% e taglialo medialmente attraverso la pelle per esporre l'utero. Dopodiché, rimuovi tutti i feti e mettili in un piatto sterile da 100 millimetri. Dopo aver rapidamente sezionato e decapitato ogni feto, posizionare ogni testa in un piatto da 60 millimetri con quattro millilitri di terreno di dissezione freddo sotto lo stereomicroscopio.

Usa un paio di pinze per isolare le cortecce cerebrali aprendo la pelle e il cranio, estraendo il cervello, separando gli emisferi e rimuovendo il mesencefalo e le meningi. Raccogli tutte le cortecce sezionate in un piatto fresco da 60 millimetri con mezzo di dissezione freddo. Quindi tritare il fazzoletto con un paio di forbici curve in pezzi di circa un millimetro.

Trasferire il fazzoletto macinato in una provetta sterile da 15 millilitri. Portare il volume a 4,5 millilitri con il terreno di dissezione a freddo e aggiungere 500 microlitri di viaggi al 2,5% nel tessuto. A seguito di ciò.

Avvolgere il tubo in pellicola para e metterlo a bagnomaria a 36 gradi Celsius per 15 minuti. Nel frattempo mescolate capovolgendo il tubetto ogni cinque minuti. Successivamente, trasferire il tessuto in una nuova provetta da 50 millilitri e cercare di ridurre al minimo il trasferimento del mezzo di dissezione contenente tripsina nella provetta.

Portare il volume a 4,8 millilitri con terreno di dissezione fresco e aggiungere 200 microlitri di D Ns a una concentrazione finale di 60 microgrammi per millilitro. Quindi triturare circa 10 volte con una pipetta sterile da cinque o due millilitri. Ripetere questo passaggio se necessario.

Utilizzando una pipetta per pasta lucidata a fuoco per dissociare la maggior parte del tessuto, lasciare che i pezzi di tessuto rimanenti si depositino sul fondo per quattro o cinque minuti. Successivamente, rimuovere la sospensione superiore a singola cellula lasciando dietro di sé i pezzi di tessuto depositati. Trasferirlo in una nuova provetta con un volume uguale di terreno di placcatura neuronale e mescolarli delicatamente.

Quindi contare le cellule utilizzando un emocitometro e piastarle su vetrini coprioggetti da 15 millimetri come circa 35.000 cellule in 200 microlitri o su piastre da 60 millimetri come circa 1 milione di cellule in tre millilitri. Incubare le cellule a 36,5 gradi Celsius per tre o quattro ore dopo l'incubazione. Combina lo strato neuronale e il ggl secondario per i neuroni su piatti da 60 millimetri.

Lavare le celle con DMEM caldo. Cambiare il terreno a quattro millilitri di N due terreni e aggiungere un thermon con ggl a ciascuna piastra. Con il GL rivolto verso i neuroni per i vetrini coprioggetti neuronali, trasferire da tre a cinque vetrini coprioggetti su ogni piatto da 60 millimetri di ggl secondario con i neuroni rivolti verso il basso 24 ore dopo la placcatura i neuroni aggiungono 10 micromolari di citosina Beta D Arab azi a ciascun piatto per prevenire la proliferazione gliale mostrato qui come esempio di neuroni della neuroglia mediante co-coltura laminare.

Cinque ore dopo i processi di placcatura continuano ad allungarsi in questa fase. Ecco un esempio di neuroni provenienti dalla co-coltura della neuroglia bi lanar 12 giorni dopo la piastra. In questa fase, gli assoni e le niti estesi delle cellule sono chiaramente visibili.

Man mano che i neuroni maturano, gli ABA dendritici diventano più elaborati e sviluppano contatti sinaptici circa due o tre settimane dopo la placcatura. Molte spine dendritiche sono visibili, come mostrato in questa figura. Durante l'esecuzione di questa tecnica, è importante lavorare rapidamente e mantenere la sterilità di ogni reagente è una mancanza di antibiotici nella nostra coltura.

I terreni rendono le cellule molto suscettibili alla contaminazione.