Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le caratteristiche di migrazione delle cellule in ambienti 3D fisiologicamente rilevanti. Ciò si ottiene seminando prima le cellule in un gel di collagene interno che viene poi racchiuso in un gel di collagene esterno privo di cellule con le proprietà della matrice desiderate. Successivamente, le cellule possono invadere e migrare nel gel esterno, durante il quale possono essere monitorate e analizzate quantitativamente.

In definitiva, questo saggio su gel concentrico viene utilizzato per mostrare come il comportamento di migrazione cellulare sia influenzato dalle proprietà biofisiche della matrice extracellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il saggio di trasferimento o il saggio scratch, è che la migrazione della cellula avviene in un ambiente fisiologico rilevante le cui proprietà strutturali e biofisiche sono molto facili da controllare. La dimostrazione visiva di questo metodo è piuttosto essenziale perché la formazione del sistema di gel del router interno concentrato è piuttosto delicata.

Un'interfaccia gel adeguata è molto importante per il successo di questo esperimento, che a volte può essere un po' difficile da realizzare. Iniziare con una coltura di MD MBA 2 31 cellule pronte per essere prelevate da fiasche T 25 all'80% di fluenza. La prima tripsina è costituita dalle cellule che utilizzano un millilitro di soluzione per pallone.

Quindi raccogliere le cellule come un pellet usando 200 G di forza per quattro minuti, scartare la trappola e risospendere le cellule in cinque millilitri di coltura. Media. Ora misura la densità cellulare utilizzando un emocitometro e determina il volume necessario per 100 milioni di cellule per millilitro. Quindi centrifugare le celle a 200 g per quattro minuti.

Rimuovere il surnatante e risospendere accuratamente il pellet nel volume richiesto di terreno di coltura privo di siero. Questa sospensione è 10 volte la concentrazione finale del sedile. Per iniziare a raccogliere le soluzioni madre necessarie in un secchiello per il ghiaccio, includono 10 XPBS milq di acqua e 0,1 molari di idrossido di sodio.

Raffreddare anche diverse provette da microcentrifuga sotto una cappa, mantenendo la tecnica sterile, aliquotare la quantità di collagene desiderata per 50 microlitri di 2,4 milligrammi per millilitro di soluzione di gel interno. Quindi aggiungere lentamente cinque microlitri di 10 XPBS al collagene misurato. Agitare il tubo man mano che viene aggiunto il PBS, ma evitare di fare bolle.

Quindi, regolare il pH della miscela a 7,4 con la soluzione di base. Di solito cinque microlitri faranno il lavoro. Una guida alla risoluzione dei problemi è fornita nel protocollo di testo.

Infine, portare il volume a 45 microlitri con terreno di coltura privo di siero lasciando spazio per le 10 sospensioni cellulari. Per iniziare, aggiungi cinque microlitri di 10 x sospensione cellulare alla soluzione di collagene e risospendi accuratamente le cellule nella soluzione senza formare bolle d'aria. Ora a un preriscaldamento su piastra inferiore in vetro, aggiungere 20 microlitri di sospensione al centro.

Formare bene una gocciolina a forma di cupola, se si forma una bolla, romperla rapidamente o risucchiarla senza fare un pasticcio. Lanciare il gel nel modo giusto può essere molto complicato, soprattutto con soluzioni molto viscose come il collagene. Cerca di evitare il più possibile la produzione di bolle e non agitare la soluzione una volta che è pronta per polimerizzare, perché il rigonfiamento potrebbe provocare l'allineamento artificiale delle fibre.

Ora rimetti la piastra nell'incubatrice per 45 minuti per far polimerizzare lo strato interno 15 minuti prima della fine dell'incubazione. Preparare 200 microlitri di soluzione esterna di gel di collagene con ghiaccio. Innanzitutto, aliquote il volume richiesto di collagene di riserva.

In secondo luogo, aggiungere lentamente 20 microlitri di 10 XPBS con un leggero vortice. Quindi regolare il pH a 7,4 come prima e portare la soluzione fino a 200 microlitri con acqua Milli Q. Ora rimuovi il piatto dall'incubatrice e aggiungi delicatamente 180 microlitri della soluzione di gel esterna sopra la cupola interna del gel.

Questo dovrebbe coprire completamente la soluzione interna e riempire il pozzo. Non mescolare la soluzione ed evitare di toccare la soluzione di gel interna. Se si forma una bolla durante l'espulsione della soluzione esterna, rompere rapidamente la soluzione o risucchiarla nella pipetta.

Un altro passo importante è assicurarsi di ottenere un'interfaccia gel adeguata. La chiave di questo passaggio è aggiungere la soluzione di gel esterna. Quando il gel interno deve ancora certificare.

La cinetica di gelificazione può variare in base alle condizioni di polimerizzazione ed è essenziale ottimizzare questa condizione in anticipo: per consentire al gel esterno di polimerizzare, rimettere la piastra nell'incubatore per 45 minuti. Dopo 45 minuti, il gel dovrebbe essere abbastanza solido, ma può ancora essere rimosso con cura, aggiungere due millilitri di terreno caldo per immergere completamente il gel. Questo completa la coltura di gel concentrico fornita con terreno fresco ogni due o tre giorni.

Entro pochi giorni, le cellule inizieranno a migrare nella matrice esterna per osservare la loro migrazione, colorare le cellule con un tracciatore fluorescente. Sostituire i due millilitri di terreno con un terreno fresco contenente cinque microlitri di colorante e incubare per 30 minuti dopo il periodo di incubazione, lavare la coltura utilizzando un millilitro di PB S3 volte per due o tre minuti per lavaggio. Dopo i lavaggi, riempire nuovamente il piatto con i normali supporti.

Quindi posiziona il piatto su un microscopio a controllo ambientale. Ora usa un'impostazione del volume di utilizzo per scansionare le regioni esterne del gel accanto all'interfaccia del gel. In genere si esegue la scansione in viste quadrate da 647 micron con uno spessore di 100 micron, utilizzando intervalli di cinque micron sullo stack ZS.

Quindi scansiona le regioni intermedie e infine scansiona la periferia del gel. Escludi le regioni entro 50 micron dalle superfici inferiore, superiore o laterale per evitare che le celle possano soffrire di un effetto bordo. Per analizzare il movimento delle celle dai dati raccolti, apri prima i file immagine in un software di analisi dei dati come imas.

Per iniziare, selezionare il comando superamento, quindi la superficie di comando. In questo modo viene visualizzata l'opzione per tenere traccia delle superfici. Nel tempo, selezionare la regione di interesse all'interno del set di dati, ovvero le coordinate cartesiane e l'intervallo di tempo.

Quindi, sottrai lo sfondo dalla regione di interesse. Per evitare di perdere una cella a causa dell'eliminazione dello sfondo, seleziona la sfera più grande che si adatta all'oggetto. Ora, dividi gli oggetti collegati selezionando il diametro del punto di partenza e procedi con la classificazione di tutti i punti di partenza.

Il passaggio successivo consiste nel classificare manualmente la superficie. Raggruppare i punti di partenza che puntano allo stesso oggetto. Fallo tra tutti i punti temporali nella regione di interesse.

Infine, traccia gli oggetti al termine del tracciamento, classifica le tracce degli oggetti e quindi emetti il set di dati quantitativi da analizzare utilizzando un foglio di calcolo. Dopo alcuni giorni di colture concentriche su gel, le cellule hanno violato l'interfaccia interna esterna del gel e hanno iniziato a invadere il gel esterno. La popolazione cellulare si diffonde verso l'esterno in direzione prevalentemente radiale.

È stato confrontato il movimento delle cellule nel gel esterno di varie densità di collagene. L'imaging è stato eseguito per un periodo di otto ore e da ciascun campione sono state calcolate circa 200 traiettorie cellulari. Le cellule nella matrice più sottile si sono spostate alla distanza minore.

Questo calcolo ha preso in considerazione tutte le cellule, non solo le cellule che migrano radialmente verso l'esterno. In tutti i casi, la distanza totale percorsa era maggiore dello spostamento netto. Come previsto, la persistenza è stata calcolata come rapporto tra spostamento e distanza.

Il valore di persistenza di 0,4 suggerisce che queste cellule avevano una migrazione direzionale intrinsecamente debole. I calcoli della velocità media hanno mostrato che la densità del collagene non ha influenzato la velocità delle cellule. È possibile che la dimensione dei pori della matrice e la densità del collagene, che sono inversamente correlate, abbiano avuto l'effetto opposto sulla velocità di migrazione e quindi si siano compensate a vicenda.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire un sistema di gel concentrico e di come studiare questa migrazione di cellule in ambiente 3D. Seguendo questa procedura, è possibile fare molte altre cose come l'estrazione cellulare, l'analisi di microarray, dove si può provare a rispondere a domande aggiuntive come quanto alcune proteine sono espresse durante i diversi punti temporali della migrazione.