Name: Valutazione del processo di migrazione e linvasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Impara a valutare la migrazione e l'invasione cellulare con il test di Boyden e il saggio di scratch a microscopio video. Questi metodi offrono confronti riproducibili per studiare la guarigione tissutale.

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Queste tecniche sono state sviluppate con il supporto di LabEx primi (ANR-11-LABX-0063), il piano di Contrat-Etat-regione (CPER) nel quadro scientifico di ETOILE (CPER 2009-2013) e Lyric Grant INCa-DGOS-4664.

Nota: I saggi di camera e zero di Boyden senza inclusione di ECM sono indicati come il test di migrazione, e la stesse analisi con l'ECM è indicato come l'analisi di invasione.
1. analisi della camera di Boyden
Nota: Questo protocollo è adattato per la linea cellulare SQ20B, che è derivata da un cancro laringeo ricorrente, testa e collo Carcinoma di cellule Squamous (HNSCC) ed è stata ottenuta da John Little (Boston, MA, USA).
1 ° giorno
<ol><li>
Semina cellulare
	<ol>
<li>Semi 2 106 SQ20B cellule in 12 mL di terreno di coltura (CM) in un matraccio da2 di 175 cm 72 ore prima del primo giorno e permettono alle cellule di crescere alla confluenza di 80% delle cellule.<ol>
<li>Per preparare CM SQ20B cellule, supplemento medium di Eagle per di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% siero fetale di vitello (FCS), idrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sotto cappa a flusso laminare, tripsinizzano le cellule. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con soluzione salina sterile tampone fosfato (PBS) e aggiungere 2,5 mL di acido etilendiamminotetracetico tripsina (ed) (0,5 g/L). Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C e quindi interrompere la reazione con l'aggiunta di 12,5 mL di CM riscaldato a 37 ° C. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule.</li>
		<li>Seme le cellule in un pallone da2 di 25 cm a una densità delle cellule delle cellule5 6 10 per ogni condizione da valutare. Incubare le cellule per 24 h in 3 mL di CM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ° giorno
<ol start="2"><li>
Inedia delle cellule e preparazione delle camere rivestite di
	<ol>
<li>Morire di fame le cellule sostituendo il mezzo in ciascuna beuta con 3 mL di terreno di siero bovino fetale-basso (FBS) utilizzando 0,1% albumina di siero bovino (BSA) invece di FBS. Morire di fame le cellule per 24 h in incubatrice.<ol>
<li>Per preparare la fame CM (s-CM), supplemento DMEM con 0.1% BSA, idrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per il dosaggio di migrazione, passare al punto 1.3.</li>
		<li>Per il dosaggio di invasione, 12 h prima del giorno 3, preparare gli alloggiamenti rivestiti di Boyden aggiungendo 500 μL di s-CM per ogni alloggiamento rivestito. Utilizzare preparato commercialmente rivestito Boyden chambers e conservare a 4 ° C prima dell'uso. Posizionare ogni camera di Boyden nella piastra di compagno e impostarlo in incubatore a 37 ° C durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 ° giorno
<ol start="3"><li>
Semina nella camera di Boyden cellulare
	<ol>
<li>Utilizzare la piastra di compagno per preparare il chemoattractant. Riempire ogni bene della piastra 24 pozzetti compagno con 750 μL di terreno completo con 10% FBS, idrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.<ol>
<li>Adattare il fattore chemiotattico per ogni linea cellulare e ciascuna condizione di trattamento. Per preparare il chemoattractant CM (ca-CM), supplemento DMEM con 10% FCS, idrocortisone 0,4 mg/mL, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 0,1 g/L.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trasferire la camera superiore nella piastra del compagno preriempita, avendo cura di evitare bolle.</li>
		<li>Per il dosaggio di invasione, rimuovere con cautela μL 450 di CM da ogni camera di Boyden.</li>
		<li>Sotto cappa a flusso laminare, tripsinizzano le cellule. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS sterile, aggiungere 0,5 mL di tripsina EDTA (0,5 g/L) e poi incubare le cellule per 5 min a 37 ° C. Fermare la reazione aggiungendo CM riscaldato a 37 ° C. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule.</li>
		<li>Cellule di 10 34 SQ20B di seme in 500 μL di 0,1% medio di BSA, dando una diluizione finale di 10 64 cellule/mL. Nota: La concentrazione delle cellule dovrebbe essere adattata per ogni linea cellulare.</li>
		<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C per 24 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 ° giorno
<ol start="4"><li>
Fissazione delle cellule e la macchiatura
	<ol>
<li>Fissare le cellule prima il tempo di raddoppiamento specifico per quella linea cellulare. Difficoltà SQ20B cellule prima di 24 ore.</li>
		<li>Rimuovere ogni inserto dalla piastra compagno e rimuovere delicatamente le cellule dalla camera superiore utilizzando un tampone di cotone. È particolarmente importante rimuovere tutte le celle posizionate nella camera superiore.</li>
		<li>Difficoltà e macchia ogni inserto singolarmente per ottenere di colorazione May-Grunwald Giemsa9 utilizzando il kit di colorazione fornito. In alternativa, utilizzare paraformaldeide al 4% in un altro piatto di compagno per una fissazione di 30 min.</li>
		<li>Mantenere gli inserti in un piatto vuoto 24 pozzetti compagno sotto una cappa di laboratorio per asciugare ogni camera.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Giorno 5
<ol start="5"><li>
Analisi al microscopio
	<ol>
<li>Inserire la piastra compagno con gli inserti su un microscopio a contrasto di fase 20 e contare ogni cella migrato nella parte inferiore della membrana. Ottimizzare la posizione giusta messa a fuoco spostando l'obiettivo dalla parte inferiore alla parte superiore e la posizione di arresto sulla parte inferiore della membrana.</li>
		<li>Calcolare il rapporto tra i numeri delle cellule migrate e cellule seminate. Ogni numero di ripetizioni per ciascuna condizione di trattamento in triplice copia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. zero ferita Assay: Migrazione cellulare
Nota: Le istruzioni devono essere adattate per ogni tipo di cellula.
1 ° giorno
<ol><li>
Semina cellulare
	<ol>
<li>Semi 2 x 106 SQ20B cellule in 12 mL di CM in un pallone da2 di 175 cm 72 ore prima del primo giorno e permettono alle cellule di crescere alla confluenza di 80% delle cellule.</li>
		<li>Sotto cappa a flusso laminare, tripsinizzano le cellule. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS sterile, aggiungere 2,5 mL di tripsina EDTA (0,5 g/L) e incubare le cellule per 5 min a 37 ° C. Fermare la reazione con l'aggiunta di 12,5 mL di CM riscaldato a 37 ° C. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule.</li>
		<li>Generare un campione prediluito ad una densità di cella di 4 x 105/ml, pari ad una densità finale di 10 44 cellule per 100 μL in ogni pozzetto. Questa concentrazione deve essere adattata per ogni linea cellulare e dovrebbe essere nella gamma di 1 x 104 10 64 celle.</li>
		<li>Celle di seme in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da depositare 100 μL della soluzione preparata al punto 2.1.2.</li>
		<li>Lasciare la piastra a temperatura ambiente per 5 min disperdere le cellule in modo uniforme sul fondo dei pozzetti.</li>
		<li>Posizionare la piastra in incubatrice e permettono alle cellule di aderire alla piastra per 12-16 h (massima) a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ° giorno
<ol start="2"><li>
Scratch test ferita
	<ol>
<li>Rimuovere le piastre preparate al punto 2.1 dall'incubatrice.</li>
		<li>Sotto il cofano, fare una ferita utilizzando il dispositivo ferentesi commerciale secondo il protocollo del produttore.</li>
		<li>Rimuovere immediatamente il mezzo da ogni pozzetto usando una pipetta con una punta conica adattata, avendo cura di non per toccare la ferita.</li>
		<li>Lavare le cellule due volte da ripetere l'aspirazione e l'utilizzo di 100 μL di CM riscaldato a 37 ° C per ciascun pozzetto.</li>
		<li>Rimuovere il CM utilizzando una pipetta con una punta conica adattata dopo i passaggi di lavaggio.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di mezzo specifico per ciascuna condizione di trattamento in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Se si tenta di evitare la creazione di eventuali bolle nei pozzetti. Una tecnica di pipettaggio inverso può essere utile qui. In alternativa, è possibile rimuovere le bolle con un ago di siringa.</li>
		<li>Collocare la piastra nel rack adattato del microscopio video.</li>
		<li>Per migliorare la qualità dell'immagine, fate la piastra calda per almeno 15 minuti prima della prima scansione per evitare formazione di condensa sul lato inferiore della piastra.</li>
		<li>Programma per la pianificazione delle scansioni, utilizzando il software di video microscopio in una sola immagine per pozzetto. Un intervallo di 2-h massimo è richiesto per un esperimento di invasione-migrazione. Se l'obiettivo dell'esperimento è quello di produrre un video, un intervallo di 30 min massimo è preferito.</li>
		<li>Alla fine dell'esperimento, lavare accuratamente la ferita periferica e seguire ognuno dei quattro passaggi di lavaggio indicati dal produttore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Giorni 3, 4 e 5
<ol start="3"><li>
Analisi di migrazione utilizzando il microscopio video
	<ol>
<li>Per un minimo di 24 h e fino a 5 giorni, monitorare e controllare la migrazione delle cellule.</li>
		<li>Utilizzare una maschera di cella appropriata adattata per ogni tipo di cellula per analizzare la migrazione cellulare. Per ottenere una maschera di cella adattata per ogni linea cellulare, generare una cella definizione dal software utilizzando una collezione di immagini di celle specifico di elaborazione.</li>
		<li>Tracciare le curve ed esportare i dati in un foglio di calcolo, che può essere utilizzato per analizzare e confrontare i risultati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. scratch ferita Assay: L'invasione delle cellule
Nota: Le istruzioni devono essere adattate per ogni tipo di cellula.
1 ° giorno
<ol><li>
Semina cellulare
	<ol>
<li>Utilizzare lo stesso protocollo per la semina delle cellule come descritto al punto 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ° giorno
<ol start="2"><li>
Preparando l'ECM
	<ol>
<li>Sbrinamento la matrice di per almeno 12 ore prima dell'uso a 4 ° C. Assicurarsi che non aggregati sono visibili. Se gli aggregati sono visibili, è possibile mantenere la matrice a 4 ° C per un periodo più lungo, fino a far scompaiono gli aggregati. Tenere la matrice sul ghiaccio. Utilizzare puntali preraffreddato. Nota: La matrice solidificherà se non conservato a 4 ° C.</li>
		<li>Raffreddare la microcentrifuga sul ghiaccio per 5 min.</li>
		<li>Prendere CM raffreddato a 4 ° C dal frigorifero e diluire la matrice nelle provette microcentrifuga preraffreddato per ottenere una concentrazione finale di 300 μg/mL.</li>
		<li>Restituire le provette microcentrifuga con matrice prediluito in frigorifero a 4 ° C. Nota: Una cremagliera di raffreddamento adattata per microcentrifuga è utile per mantenere i tubi a 4° C in tutto l'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ° giorno
<ol start="3"><li>
Gratta e Vinci ferita analisi e trattamento del ECM
	<ol>
<li>Rimuovere la piastra preparata al punto 3.1 dall'incubatrice.</li>
		<li>Sotto il cofano, rendere la ferita usando il dispositivo ferentesi commerciale secondo il protocollo del produttore.</li>
		<li>Rimuovere immediatamente il mezzo da ogni pozzetto usando una pipetta con una punta conica adattata facendo attenzione a non per toccare la ferita.</li>
		<li>Lavare le cellule due volte, ripetere la procedura di aspirazione e utilizzando 100 μL di CM riscaldato a 37 ° C.</li>
		<li>Dopo il secondo lavaggio, collocare la piastra sull'incubatore di 4 ° C a equilibrare la temperatura per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il fluido freddo da ogni pozzetto con la pipetta di aspirazione con una punta conica, avendo cura di Pipettare attentamente dal bordo e di evitare di toccare la ferita.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL di matrice prediluito ad ogni pozzetto utilizzando punte coniche preraffreddati a 4 ° C.</li>
		<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C per 30 min. Nota: Un rack di supporto preriscaldato a 37 ° C è utile per accelerare il riscaldamento della piastra 96 pozzetti.</li>
		<li>Rimuovere la piastra dall'incubatrice e aggiungere 100 μL della CM adattato ad ogni pozzetto come indicato per ciascuna condizione di trattamento.</li>
		<li>Se si tenta di evitare la creazione di eventuali bolle nei pozzetti. Una tecnica di pipettaggio inverso può essere utile qui. In alternativa, è possibile rimuovere le bolle con un ago di siringa.</li>
		<li>Collocare la piastra nel rack adattato al microscopio dei video.</li>
		<li>Per migliorare la qualità dell'immagine, fate la piastra calda per almeno 15 minuti prima della prima scansione per evitare formazione di condensa sul lato inferiore della piastra.</li>
		<li>Programmare la pianificazione delle scansioni, utilizzando il software di video microscopio in una sola immagine per pozzetto, nella modalità di scansione Scratch ferita. Un intervallo massimo di 2 h in necessaria per un esperimento di invasione-migrazione. Se l'obiettivo dell'esperimento è quello di produrre un video, un intervallo di 30 min massimo è preferito.</li>
		<li>Alla fine dell'esperimento, lavare accuratamente la ferita periferica e seguire ognuno dei quattro passaggi di lavaggio indicati dal produttore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Giorni 3, 4 e 5
<ol start="4"><li>
Analisi di invasione delle cellule usando un microscopio video.
	<ol>
<li>Ripetere il punto 2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
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<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
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<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Segnaliamo qui due diverse modalità per studiare il processo di invasione e migrazione cellulare. L'analisi di questo processo è importante per comprendere i fattori coinvolti nella ricorrenza metastatica, che potrebbe essere spiegato con aumentata motilità di una sottopopolazione delle cellule di cancro chiamato cancro cellule staminali10,11.
L'esperimento di camera di Boyden è uno il più delle volte usato invasione e migrazione delle...

Migrazione e l'invasione delle cellule sono coinvolti nella diffusione delle cellule tumorali, che è la causa principale di resistenza al trattamento1 e può portare a locoregionale o ricorrenza metastatica dopo cancro trattamento2. La transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) è il processo iniziale di invasione-migrazione delle cellule in cui il cancro cellule passare da un epiteliali ad un fenotipo mesenchimale. E-caderina è un marcatore extracellulare del fenotipo epiteliale3, e l'espressione aumentata di N-caderina e il vimentin è caratteristico del fenotipo mesenchimale4. Migrazione dipende anche la capacità intrinseca delle cellule tumorali ad invadere la matrice extracellulare (ECM) attraverso l'azione di metalloproteasi di matrice5.
Questo meccanismo di invasione – migrazione è stata descritta per il cancro in molti luoghi, particolarmente in testa e del collo cancro6. Molti ricercatori si sono concentrati sui processi di migrazione e invasione di capire meglio come le cellule tumorali diffondere nella speranza che questa conoscenza porterà a nuove strategie di trattamento. È fondamentale che questi studi sono effettuati usando le analisi affidabili e riproducibili.
Analisi in vitro della motilità cellulare può essere impegnativo. Sviluppato molti anni fa, l'analisi della camera di Boyden è considerato lo standard per l'invasione – migrazione analisi7. Tuttavia, è che richiede tempo e spesso è impreciso. Un secondo test è la guarigione dosaggio8, che consiste nel fare un graffio su una coltura monostrato cellulare e acquisizione di immagini di invasione delle cellule e la migrazione ad intervalli di tempo. Questa tecnica è stata ampiamente criticata a causa delle grandi variazioni tra i risultati di due prove consecutive. Tuttavia, l'applicazione delle moderne tecnologie, soprattutto in microscopia, ha migliorato la riproducibilità del dosaggio zero ferita. I microscopi video possono essere facilmente introdotto nelle incubatrici e in grado di generare immagini in tempo reale della migrazione cellulare. Questi dispositivi registrano dati microscopici e forniscono analisi automatica della confluenza delle cellule della ferita nel tempo. Lo scopo di questa carta è di descrivere le analisi della camera di Boyden e il dosaggio ottimizzato ferita gratta e Vinci e per discutere i vantaggi e le debolezze di ogni approccio.

<table><tbody><tr><td>Siero fetale di vitello Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone solubile in acqua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>La soluzione deve essere preparata appena prima dell'uso perché è molto instabile</td></tr><tr><td>Z1 coltro particella</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Linea cellulare CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B</td><td>Regalo da John Little' s Produttore</td><td></td> di ferite da laboratorio <td></td></tr><tr><td></td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>Conservare in luogo sicuro e asciutto</td></tr><tr><td>Piastra ImageLock a 96 pozzetti</td><td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>Sistema CoolBox 96F con CoolSink 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox con sistema M30</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Inserto</td> <td>BoydenDominique Dutcher</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Boyden Inserto rivestito</td><td>Dominique Dutcher</td><td>354483</td><td>negozio a -20 &deg C</td></tr><tr><td>Companion Piastra a 24 pozzetti</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel standard</td><td>BD BioScience</td><td>BD 354234</td><td>Store a -20 gradi C.</td></tr><tr><td>Kit di colorazione RAL 555</td><td>Diagnostica RAL</td><td>&nbsp; 361550</td><td>Conservare in luogo sicuro e asciutto</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>33511</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello scratch video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di boyden

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Le capacità di migrazione e invasione delle cellule del tumore sono contributori principali a ricorrenza e progressione del cancro. Molti studi hanno esplorato le capacità di migrazione e invasione di capire come diffondere le cellule tumorali, con l'obiettivo di sviluppare nuove strategie di trattamento. Analisi delle basi cellulari e molecolari di queste abilità ha portato per la caratterizzazione della mobilità delle cellule e le proprietà fisico-chimiche del citoscheletro e microambiente cellulare. Per molti anni, l'analisi della camera di Boyden e il dosaggio di ferita gratta e Vinci sono stati le tecniche standard per studiare la migrazione e l'invasione delle cellule. Tuttavia, queste due tecniche hanno limitazioni. L'analisi della camera di Boyden è difficile e richiede tempo, e il saggio di gratta e Vinci della ferita ha scarsa riproducibilità. Lo sviluppo delle moderne tecnologie, soprattutto in microscopia, ha aumentato la riproducibilità del dosaggio zero ferita. Utilizzando sistemi di analisi potente, un microscopio video "in incubatrice" utilizzabile per fornire analisi automatica e in tempo reale di invasione e migrazione cellulare. Lo scopo di questa carta è di segnalare e confrontare i due dosaggi usati per studiare la migrazione e l'invasione delle cellule: l'analisi della camera di Boyden e un ottimizzato in vitro dei video basati su microscopio zero ferita dosaggio.

Segnaliamo qui due metodi diversi per analizzare la migrazione e l'invasione delle cellule. La figura 1 Mostra la Boyden esperimento di camera. Gli inserti vengono inseriti in una piastra di compagno con chemoattractant medio, e le cellule sono seminate in CM. La membrana può essere non patinata (test di migrazione) o verniciato (analisi di invasione). Cellule sono seminate nella camera superiore in s-CM. La camera bassa è riempita di CM come un fattore chemi...

Questo studio segnala due diversi metodi per l'analisi di migrazione e l'invasione delle cellule: l'analisi della camera di Boyden e l'in vitro dei video microscopio analisi basata a guarigione. Vengono descritti i protocolli per questi due esperimenti, e vengono confrontati i loro vantaggi e svantaggi.

Valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di riportare e confrontare i due saggi utilizzati per studiare l'invasione e la migrazione cellulare, il saggio della camera di Boyden e un saggio ottimizzato della ferita da graffio basata su video microscopio in vitro. Questi esperimenti possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo di studio dell'invasione e della migrazione, come la scelta del metodo più pertinente. Il vantaggio principale di questo test ottimizzato per la ferita da graffio basato sulla videomicroscopia in vitro è che fornisce un confronto riproducibile e preciso tra le condizioni di trattamento.Sebbene questo metodo possa valutare la migrazione e l'invasione cellulare, può essere applicato anche ad altri campi di studio come la guarigione o la rigenerazione dei tessuti. Preparare le cellule SQ20B 72 ore prima del primo giorno del saggio seminando due volte 10 su 1/6 di cellule in 25 millilitri di terreno di coltura in un matraccio da 175 centimetri quadrati. Lasciare che le cellule crescano fino all'80% di confluenza cellulare a 37 gradi Celsius.Il primo giorno dopo la tripsinizzazione e la conta cellulare, seminare le cellule in un pallone di 25 ce

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Comunemente utilizzati, sono descritti metodi altamente accessibili per l'esame migrazione cellulare e l'invasione in vitro. Il primo metodo è il saggio chiusura della ferita cella che misura la motilità cellulare. Il secondo metodo è il transwell migrazione e invasione test che valuta la chemiotassi e la capacità invasiva delle cellule.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

L'indagine sulla migrazione precoce delle cellule endoteliali (EEC) è importante per comprendere la fisiopatologia di alcune malattie e per identificare potenzialmente nuove strategie per l'intervento terapeutico. Il seguente protocollo descrive le tecniche per valutare la migrazione cellulare che sono state adattate per lo studio della CEE.

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Dettagli Questo protocollo un metodo personalizzabile per misurare la migrazione delle cellule in risposta a fattori chemiotattici che possono anche essere utilizzati per determinare la velocità di diffusione di un farmaco da una matrice polimerica.

Una camera per la migrazione delle cellule di misura personalizzabile

Questo protocollo descrive un'analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.

Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Questo manoscritto descrive come incisione-come le lesioni fatta su monostrati di cellule epiteliali in coltura convenientemente modello ferita curativa in vitro, che consente per l'imaging di confocal o microscopia di esame del laser, e che in grado di fornire alta qualità dati quantitativi e qualitativi per studiare il comportamento delle cellule sia i meccanismi coinvolti nella migrazione.

La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata

Qui descriviamo una procedura per verificare la migrazione cellule in vitro con un microscopio ottico automatizzato fotocamera. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato ampiamente usato dove la chiusura del graffio è seguita per un periodo determinato. Il microscopio ottico consente un rilevamento affidabile e a buon mercato della migrazione cellulare.

Ottimizzato Scratch test per test In Vitro della migrazione cellulare con una fotocamera ottica automatizzata

Qui, descriviamo le tecniche di imaging di cellule vive per misurare quantitativamente la migrazione e l'invasione delle cellule staminali tumorali di glioblastoma del cervello nel corso del tempo e sotto condizioni multiple di trattamento.

Analisi Live Cell Imaging Studio Glioblastoma cerebrale tumore cellule staminali migrazione e invasione

L'attuale protocollo descrive un metodo integrato, indagando la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione su un'unica piattaforma in tempo reale, fornendo un'opzione facilmente riproducibile e tempo efficiente per studiare la morfologia e la mobilità delle cellule.

Un flusso di lavoro semplice migrazione/invasione utilizzando un Imager di vivere-cella automatizzata

Qui, presentiamo un protocollo per un saggio in vitro graffio utilizzando fibroblasti primari e per un saggio di guarigione della ferita della pelle in vivo nei topi. Entrambi i test sono metodi semplici per valutare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo.

Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite

Presentiamo un metodo conveniente per il test di migrazione dei graffi che fornisce un nuovo approccio per determinare la migrazione cellulare senza l'uso di metodi ad alta intensità di apparecchiature. Mentre i fibroblasti sono stati utilizzati in questo protocollo, possono essere adattati e utilizzati per studiare ulteriori tipi di cellule e influenze sulla migrazione cellulare.

Un saggio di migrazione dei graffi economico e adattabile

Questo studio presenta il saggio bidimensionale (2D) di migrazione della ferita da graffio e il saggio tridimensionale (3D) di germinazione degli sferoidi, insieme ai rispettivi metodi di analisi a valle, tra cui l'estrazione dell'RNA e l'immunocitochimica, come saggi adatti per studiare l'angiogenesi in vitro.

Indagine sull'angiogenesi a livello funzionale e molecolare sfruttando il saggio di migrazione della ferita da graffio e il saggio di germinazione sferoidale

Impara a valutare la migrazione e l'invasione cellulare con il test di Boyden e il saggio di scratch a microscopio video. Questi metodi offrono confronti riproducibili per studiare la guarigione tissutale.

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Valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden

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