Valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di riportare e confrontare i due saggi utilizzati per studiare l'invasione e la migrazione cellulare, il saggio della camera di Boyden e un saggio ottimizzato della ferita da graffio basata su video microscopio in vitro. Questi esperimenti possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo di studio dell'invasione e della migrazione, come la scelta del metodo più pertinente. Il vantaggio principale di questo test ottimizzato per la ferita da graffio basato sulla videomicroscopia in vitro è che fornisce un confronto riproducibile e preciso tra le condizioni di trattamento.

Sebbene questo metodo possa valutare la migrazione e l'invasione cellulare, può essere applicato anche ad altri campi di studio come la guarigione o la rigenerazione dei tessuti. Preparare le cellule SQ20B 72 ore prima del primo giorno del saggio seminando due volte 10 su 1/6 di cellule in 25 millilitri di terreno di coltura in un matraccio da 175 centimetri quadrati. Lasciare che le cellule crescano fino all'80% di confluenza cellulare a 37 gradi Celsius.

Il primo giorno dopo la tripsinizzazione e la conta cellulare, seminare le cellule in un pallone di 25 centimetri quadrati a una densità cellulare di sei volte 10 in 1/5 di cellule in tre millilitri di terreno di coltura per ogni condizione da valutare. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno seguente, affamare le cellule sostituendo il terreno in ogni fiaschetta con tre millilitri di siero fetale bovino basso.

Affamare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per il test di invasione, preparare le camere di Boyden rivestite 12 ore dopo l'inizio della carenza di cellule. Posiziona ogni camera di Boyden nel piatto di accompagnamento.

Aggiungere 500 microlitri di terreno di cella di digiuno a ciascuna camera rivestita. Il giorno successivo, il terzo giorno, utilizzare la piastra di accompagnamento per preparare il chemioattrattivo. Riempire ogni pozzetto della piastra di accompagnamento a 24 pozzetti con 750 microlitri di terreno completo con il 10% di FBS, idrocortisone, penicillina e streptomicina.

Trasferire la camera superiore nella piastra di accompagnamento preriempita facendo attenzione a evitare bolle. Per il test di invasione, rimuovere con cura 450 microlitri di terreno di coltura da ciascuna camera di Boyden. Dopo la tripsinizzazione e il conteggio delle cellule SQ20B affamate, seminare tre volte 10 in 1/4 di cellule in 500 microlitri di terreno BSA allo 0,1% dando una diluizione finale di sei volte 10 a 1/4 di cellule per millilitro.

Posizionare la camera di Boyden nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il quarto giorno rimuovere ciascun inserto dalla piastra di accompagnamento e rimuovere con cura le cellule dalla camera superiore utilizzando un batuffolo di cotone. Successivamente fissare e colorare ogni inserto singolarmente per ottenere la colorazione May-Grunwald Giemsa utilizzando un kit di colorazione secondo le istruzioni del produttore.

Eseguire l'analisi microscopica il quinto giorno. Inserire la piastra di accompagnamento con gli inserti su un microscopio a contrasto di fase 20X e contare ogni cellula migrata sulla parte inferiore della membrana. 72 ore prima del primo giorno del saggio seme due volte 10 alle cellule 1/6 SQ20B in 25 millilitri di terreno di coltura in un pallone di 175 centimetri quadrati e lasciare che le cellule crescano fino all'80% di confluenza cellulare.

Il primo giorno dopo la tripsinizzazione e la conta cellulare, generare un campione pre-diluito delle cellule SQ20B a una densità di quattro volte 10 per 1/5 di cellule per millilitro. Erogare 100 microlitri di soluzione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ottenere una densità finale di quattro volte 10 a 1/4 di cella per 100 microlitri in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e lasciare che le cellule aderiscano alla piastra per 12-16 ore.

Il giorno seguente portare la placca al cappuccio per l'inferocimento utilizzando un dispositivo di avvolgimento commerciale. Rimuovere la parte superiore della macchina per ferite e metterla nella soluzione del lavabarche. Inserire la piastra nel supporto della piastra di base e rimuovere il coperchio della piastra.

Riposizionare il blocco perno guidando i tasselli posteriori del blocco perno nei fori posteriori della piastra di base. Spingere e tenere premuta la leva nera e sollevare il blocco del perno continuando a tenere premuta la leva nera. Utilizzando una pipetta con punta conica adattata, rimuovere immediatamente il terreno da ciascun pozzetto, facendo attenzione a non toccare la ferita.

Lavare le cellule aggiungendo ad ogni pozzetto 100 microlitri di terreno cellulare riscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una pipetta con una punta conica adattata per aspirare il mezzo cellulare. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di terreno specifico per ogni condizione di trattamento a ciascun pozzetto, assicurandosi di evitare di creare bolle nei pozzetti.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti nell'apposito rack del videomicroscopio. Utilizzando il software del microscopio video, programma il programma delle scansioni a un'immagine per pozzetto. Per un esperimento di invasione migratoria è richiesto un intervallo massimo di due ore.

Se l'obiettivo dell'esperimento è quello di produrre un video, è preferibile un intervallo massimo di 30 minuti. Monitorare e controllare la migrazione cellulare per un minimo di 24 ore e fino a cinque giorni utilizzando una maschera cellulare appropriata adattata per ogni tipo di cellula per analizzare la migrazione cellulare. Per ottenere una maschera cellulare adattata per ogni linea cellulare, generare una definizione di elaborazione cellulare dal software utilizzando una specifica raccolta di immagini cellulari.

Traccia le curve ed esporta i dati in un foglio di calcolo che può essere utilizzato per analizzare e confrontare i risultati. Per prepararsi al test di invasione cellulare, seminare le cellule SQ20B nello stesso modo in cui è stato dimostrato per il test di migrazione cellulare e incubare la piastra a 96 pozzetti nell'incubatore. Il secondo giorno del test preparare la matrice extracellulare.

Scongelare la matrice a quattro gradi Celsius per almeno 12 ore prima dell'uso e assicurarsi che non siano visibili aggregati. Raffreddare le provette della microcentrifuga con ghiaccio per cinque minuti. Diluire la matrice con punte coniche pre-raffreddate a quattro gradi Celsius nelle provette da microcentrifuga pre-raffreddate con mezzo cellulare raffreddato a quattro gradi Celsius per ottenere una concentrazione finale di 300 microgrammi per millilitro.

Conservare le provette per microcentrifuga con matrice prediluita in frigorifero a quattro gradi Celsius. Recuperare la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore. Sotto il cofano realizzare la ferita utilizzando il dispositivo di avvolgimento commerciale secondo il protocollo del produttore, come dimostrato in precedenza.

Utilizzare una pipetta con una punta conica adattata per rimuovere immediatamente il terreno da ciascun pozzetto e fare attenzione a non toccare la ferita. Lavare le cellule due volte utilizzando 100 microlitri di terreno cellulare riscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo il secondo lavaggio, mettere la piastra sul ghiaccio per cinque minuti per equilibrarne la temperatura.

Togliere il mezzo freddo da ogni pozzetto avendo cura di pipettare con cura dal bordo e di evitare di toccare la ferita. Utilizzando punte coniche pre-raffreddate a quattro gradi Celsius, aggiungere 50 microlitri di matrice pre-diluita a ciascun pozzetto. Mettere la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, aggiungere 100 microlitri del terreno cellulare adattato a ciascun pozzetto, come indicato per ogni condizione di trattamento. Posizionare la piastra nell'apposito rack del videomicroscopio. Successivamente programmare le scansioni ed eseguire l'analisi al microscopio video come dimostrato per il saggio di migrazione cellulare.

Vengono mostrati i risultati rappresentativi di una membrana di Boyden dopo la fissazione cellulare. La membrana sub-ottimale presenta grappoli cellulari sul lato superiore della membrana e risultati non interpretabili. Al contrario, la membrana ottimale ha cellule numerabili nella parte inferiore della membrana colorate di blu.

Un risultato ottimale del test della ferita da graffio è illustrato da queste immagini della guarigione della ferita all'ora zero, 15 ore e 30 ore. I criteri per un esperimento di qualità sono una ferita lineare, nessun frammento di cellula osservato nella ferita e una confluenza cellulare ottimale. La confluenza del 90% è la densità cellulare ottimale per il test di guarigione delle ferite, come mostrato nel pannello A. Il pannello C mostra un esempio di bassa densità cellulare e il pannello B mostra i cluster cellulari causati da un lavaggio insufficiente del pellet cellulare.

Questa rappresentazione grafica della guarigione delle ferite ottenuta utilizzando il software del microscopio video mostra la quantificazione dei parametri della confluenza delle cellule della ferita in base al tempo per quattro condizioni di trattamento. È stato osservato che il trattamento combinato riduce significativamente la migrazione cellulare. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come valutare la migrazione cellulare e il processo di invasione.