La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata

L'obiettivo generale di queste procedure di ferita artificiale su colture cellulari epiteliali è quello di studiare la migrazione cellulare sia da una prospettiva quantitativa che qualitativa, consentendo la valutazione degli effetti di specifici trattamenti di interesse sulla guarigione delle ferite. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della guarigione delle ferite, in quanto consente la caratterizzazione precisa dei ruoli di specifici processi di migrazione durante la disgregazione epiteliale. Il vantaggio principale di questo approccio è che consente la correlazione delle misure di migrazione cellulare con i cambiamenti nel comportamento di marcatori molecolari rilevanti.

Le implicazioni di queste tecniche si estendono verso una terapia delle ferite cliniche, in quanto offrono una configurazione conveniente per i test farmacologici precoci e per la chiusura delle ferite. Generalmente in questo metodo inizierà a causa delle difficoltà nell'ottenere una riproducibilità coerente nelle ferite con una generazione. Per un test di graffio artificiale della ferita, iniziare seminando ogni pozzetto di una piastra di coltura con due millilitri di cellule epiteliali di interesse in un terreno completo.

Colture le cellule a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per due o tre giorni fino al 100% di confluenza. Quando le cellule sono pronte, lavarle due volte con un terreno fresco privo di siero, seguite da 24 ore di coltura in terreno fresco privo di siero. Il giorno successivo, posizionare la piastra in un'area di lavoro sterile e trascinare due volte l'estremità stretta di una punta sterile per micropipette sul fondo di ciascun pozzetto per generare una ferita a forma di croce.

Uno spazio costante nella ferita si ottiene applicando una pressione costante e decisa mentre si muove dolcemente la punta lungo la superficie epiteliale. Una pressione eccessiva deformerà la punta, causando un raggio della ferita irregolare. Rimuovere delicatamente il surnatante per scartare le cellule staccate e aggiungere con cura un terreno fresco privo di siero ai pozzetti.

Utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito collegato a una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica, allineare il bordo del campo del microscopio con l'intersezione adiacente dei graffi per ottenere fino a quattro immagini di riferimento pre-trattamento dello spazio di graffio in ciascun pozzetto. Una volta acquisite tutte le immagini, sostituire il terreno nei pozzetti di trattamento designati con un terreno fresco, integrato con trattamenti selezionati di interesse, e rimettere le piastre nell'incubatore per colture cellulari. Quando almeno una condizione raggiunge circa il 90% di chiusura dello spazio di chiusura, sostituire delicatamente il surnatante con un millilitro di formalina al quattro percento in PBS per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi lavare delicatamente le cellule con PBS almeno tre volte per rimuovere l'eccesso di formalina e visualizzare i pozzetti come appena dimostrato, utilizzando gli stessi parametri di imaging nelle aree di riferimento originali catturate dopo il graffio. Per analizzare le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini appropriato, aprire l'immagine di interesse registrata e pre-trattamento e nel menu Immagine, impostare il tipo di immagine su 8 bit. Nel menu Processo, selezionare il sottomenu Filtri e applicare il filtro Varianza.

Nel menu Immagine, aprire il sottomenu Regola e impostare la Soglia su bianco e nero. Nel menu Processo, selezionare il sottomenu Binario e applicare Riempi fori. Nel menu Analizza, selezionare Imposta misurazioni e attivare Area.

Quindi disegna l'area misurabile, seguendo il contorno del bordo in migrazione per delimitare lo spazio. Nel menu Analizza, selezionare Analizza particelle e registrare i valori totali dell'area per la superficie dell'area disegnata. Per quantificare la migrazione assoluta per ogni set di singoli campioni come differenza tra le misurazioni della superficie della fessura, esportare i valori dell'area totale della superficie della fessura pre e post-trattamento in un foglio di calcolo e tracciare i risultati della quantificazione.

Per un saggio frontale di migrazione artificiale, in condizioni sterili, aggiungere uno strato di un massimo di 33 vetrini coprioggetto rotondi sterilizzati in piastre di coltura vuote da 10 centimetri. Quando la superficie della piastra è completamente coperta, seminare delicatamente le cellule epiteliali di interesse a una concentrazione che consenta il 100% di confluenza dopo due o tre giorni di coltura. Se necessario, premere delicatamente i sorsi coprioggetto con una punta per micropipetta sterile per evitare che galleggi.

Quando le cellule raggiungono la confluenza, sostituire il surnatante con un terreno privo di siero per altre 24 ore di coltura. Quindi, utilizzare una pinzetta sterile per trasferire con cura un vetrino coprioggetti in una nuova lastra da 10 centimetri contenente terreno fresco privo di siero, avendo cura di tenere il vetrino lungo la sua periferia. Per creare le ferite artificiali, trascinare una lama di rasoio sterilizzata avanti e indietro su ciascun vetrino coprioggetti per creare una linea trasversale di tre o quattro millimetri sopra il centro di ciascuna coltura cellulare per rimuovere completamente la striscia centrale del monostrato.

Fare attenzione a posizionare il bordo della lama del rasoio pesantemente sulla superficie del vetrino coprioggetti quando si esegue la ferita per proteggersi da una forma irregolare del bordo e dalla generazione di porzioni epiteliali cadenti. Trasferire fino a quattro vetrini coprioggetti della ferita, con le cellule rivolte verso l'alto, in pozzetti individuali di una piastra a sei pozzetti, contenente almeno due millilitri di terreno privo di siero, e lavare delicatamente ogni pozzetto due volte con terreno fresco privo di siero per rimuovere eventuali cellule staccate. Quando tutte le cellule staccate sono state scartate, sostituire delicatamente il terreno di lavaggio con un terreno fresco integrato con i trattamenti di interesse e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari.

Al termine del periodo sperimentale appropriato, fissare le cellule con il quattro percento di formalina in PBS come appena dimostrato e colorare le cellule con gli appropriati anticorpi coniugati fluorescenti di interesse. Quindi visualizzare i cambiamenti strutturali che si verificano sul bordo anteriore migrante mediante microscopia a fluorescenza in base ai parametri sperimentali di interesse. In questo esperimento, le lacune della ferita sono state misurate prima e dopo il trattamento con il fattore di crescita epidermico, un noto induttore della proliferazione e della migrazione delle cellule epiteliali.

La migrazione assoluta è stata quindi calcolata come la differenza tra le aree superficiali delle fessure pre e post-trattamento. Il trattamento con fattore di crescita epidermico potenzia la dinamica del citoscheletro cellulare, come osservato in queste immagini al microscopio a scansione laser della colorazione con F-actina delle cellule di controllo e stimolate dal fattore di crescita. Inoltre, si osserva una sovraespressione di c-Jun con un aumento dell'espressione della proteina evidente nelle cellule adiacenti al fronte migratorio.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di controllare l'integrità dei bordi della ferita per la presenza di lembi di cellule epiteliali che possono interrompere la quantificazione della migrazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare sia quantitativamente che qualitativamente il comportamento migratorio del