Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

L'obiettivo generale di questa analisi RNASeq in campioni larvali di zebrafish è identificare i profili di espressione genica per embrioni e larve di zebrafish e fare dichiarazioni comparative quantitative sui cambiamenti di espressione genica tra i campioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in qualsiasi campo per il quale gli embrioni o le larve di zebrafish sono informativi, come ad esempio il modo in cui la soppressione di un gene bersaglio provoca cambiamenti nell'espressione genica o un'interruzione di determinati percorsi rispetto ad altre condizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i pesci zebra sono suscettibili alla produzione di un gran numero di animali e i dati del trascrittoma dell'intero animale possono essere facilmente ottenuti.

Inoltre, l'isolamento di specifici tipi di cellule può essere ottenuto con facilità utilizzando lo smistamento di animali transgenici. A dimostrare le procedure saranno Lain Hostelley, uno studente laureato, e Jessica Nesmith, un post-doc del mio laboratorio. Per iniziare, coltiva gli embrioni fino a tre mesi di età, che è la maturità riproduttiva.

Segregatare due pesci maschi adulti e tre femmine del ceppo desiderato in vasche di accoppiamento divise di acqua fresca del sistema la sera prima della raccolta degli embrioni. La mattina seguente, dopo che le luci si sono accese, rimuovere il divisorio e lasciare che i pesci si accoppino naturalmente fino a quando non si osservano embrioni sul fondo della vasca. Raccogliere gli embrioni a intervalli di 30 minuti in piastre di Petri separate del terreno embrionale fino a quando non viene raccolto il numero desiderato.

Per mettere in scena gli embrioni, coltivarli in gruppi da 50 a 75 per piastra di Petri da 10 centimetri per promuovere tempi di sviluppo coerenti di tutti gli embrioni. Quindi, mantieni le piastre a 28,5 gradi Celsius. Misurare l'età dell'embrione utilizzando il numero di somite dopo la segmentazione fino a circa 24 ore dopo la fecondazione, o HPF, e separare gli embrioni in base all'età di sviluppo.

Dopo l'eutanasia degli embrioni nella fase desiderata secondo il protocollo di testo, trasferire un pool di 20 embrioni in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettata. Quindi, rimuovere il terreno embrionale in eccesso dalla provetta per microcentrifuga. Aggiungere 200 microlitri di reagente di lisi alla provetta.

E usa un pestello per omogeneizzare meccanicamente gli embrioni. Quindi, aggiungere altri 800 microlitri di reagente di lisi per portare il volume totale a un millilitro. Per estrarre l'RNA, aggiungere il reagente di lisi al campione raccolto e incubarlo a temperatura ambiente per 5 minuti.

Aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio per ogni 1 millilitro di reagente di lisi utilizzato e capovolgere le provette a mano per 15 secondi. Dopo aver incubato i campioni a temperatura ambiente per due o tre minuti, centrifugare i campioni a 12.000 volte G e 4 gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire la fase acquosa separata in una provetta nuova e aggiungere 0,5 millilitri di isopropanolo per ogni 1 millilitro di reagente di lisi utilizzato.

Dopo aver incubato le provette a temperatura ambiente per 10 minuti, centrifugare i campioni per 10 minuti. Quindi, aggiungere il 75% di etanolo all'RNA e centrifugare le provette a 7, 500 volte G e 4 gradi Celsius per 5 minuti. Rimuovere completamente il surnatante e lasciare asciugare il campione all'aria a temperatura ambiente.

Quindi, risospendere l'RNA in 15-30 microlitri di acqua trattata con DEPC. Per purificare l'RNA di alta qualità dopo aver estratto il pellet e lavato il campione secondo il protocollo di testo, utilizzare uno spettrofotometro ad assorbimento per dosare la concentrazione e la purezza dell'RNA estratto. Assicurarsi che il valore 260 su 230 sia circa 2,0 prima di inviare i campioni di RNA a un fornitore o a un corpo per l'analisi RNASeq e del cambiamento dell'espressione genica in base alla quantificazione delle letture di sequenziamento.

Per confrontare una singola condizione sperimentale con un controllo, aprire i dati dei geni espressi in modo differenziale in un software di gestione di fogli di calcolo. Seleziona la freccia a discesa accanto al pulsante di ordinamento e seleziona l'ordinamento personalizzato all'interno del foglio di calcolo. Nella finestra che si apre, seleziona la casella sotto la colonna e scegli di ordinare in base alla colonna LFC.

Nella colonna Ordina in base a verificare che i valori siano selezionati. Nella colonna dell'ordine, selezionare l'ordinamento dal più grande al più piccolo e fare clic su OK. Per determinare i geni differenzialmente espressi trovati in due condizioni sperimentali, sul foglio di calcolo sperimentale rispetto a quello di controllo, selezionare la prima cellula in una colonna vuota.

Quindi, digita la seguente equazione nella cella. Premi Invio o Invio per eseguire l'equazione. Seleziona la cella contenente l'equazione e fai clic sulla casella nell'angolo in basso a destra della cella.

Tieni premuto il mouse e trascina l'area selezionata fino in fondo alla colonna fino a selezionare l'ultimo ID funzione per copiare l'equazione in ogni cella della colonna. Seleziona di nuovo l'ordinamento personalizzato e aggiungi un secondo livello di ordinamento facendo clic sull'icona più nell'angolo in basso a sinistra. Nel primo livello, ordina per, sotto colonna, seleziona duplica.

In Ordina in base a selezionare i valori e in Ordine selezionare Z per A.In il secondo livello, quindi in base alla colonna selezionare LFC. In Ordina in base a selezionare i valori e in Ordine selezionare dal più grande al più piccolo e selezionare OK. Per rimuovere eventuali parentesi dalla colonna dei simboli genetici prima di procedere, selezionare l'intera colonna contenente i simboli genetici.

Seleziona modifica, quindi sostituisci nel menu a discesa dei file. Digita parentesi aperta, stella, parentesi chiusa, nella barra di ricerca della finestra di sostituzione e affitta la barra di sostituzione con vuota. Selezionare Sostituisci tutto per rimuovere tutte le istanze delle parentesi.

Per determinare i percorsi arricchiti, copiare i simboli genetici desiderati negli appunti. Vai su ConsensusPathDB, quindi seleziona Analisi del set di geni nella barra laterale sinistra della pagina web, seguita da Analisi della sovrarappresentazione. Nella casella Incolla un elenco di identificatori di geni e proteine incollare l'elenco dei geni.

Selezionare il simbolo del gene nella casella del tipo di identificatore del gene/proteina e fare clic su Procedi. Nella sezione insiemi basati su percorsi, selezionare la casella accanto a percorsi definiti dai database dei percorsi. Selezionare Trova set arricchiti per ottenere l'elenco dei percorsi contenenti geni nell'elenco di input.

Selezionare tutti i percorsi arricchiti da visualizzare in una rete di percorsi selezionando ciascuna casella accanto ai nomi dei percorsi oppure, in Seleziona nell'intestazione di colonna sopra le caselle di selezione, fare clic su tutti. Quindi, selezionare Visualizza set selezionati. Regola i filtri di sovrapposizione relativa e candidati condivisi selezionando una delle caselle in alto al centro della pagina e inserendo la percentuale, la sovrapposizione relativa o il numero di candidati condivisi desiderati, quindi seleziona Applica.

Per determinare le ontologie geniche arricchite, copiare i simboli genici del rispettivo gruppo negli appunti. Vai allo strumento di analisi dell'arricchimento GO nel Consorzio di Ontologia Genetica. Sul lato sinistro della pagina, sotto i tuoi ID geni qui, incolla l'elenco dei simboli genetici nella casella.

Sotto la casella ID geni, seleziona il termine go, processo biologico. Quindi, seleziona danio rerio sotto la casella dei termini di accesso e fai clic su Invia. Eseguire la QRT PCR e confrontarla con RNASeq, secondo il protocollo di testo.

Il sequenziamento dell'RNA estratto da larve iniettate con Morpholinos contro alms1 o bbs1 ha rivelato i geni che erano unicamente sovraregolati e sottoregolati nei modelli Alstrom e BBS, nonché i geni che erano significativamente modificati in entrambi i modelli. Per chiarire più chiaramente il profilo molecolare del modello di Alstrom, sono stati identificati i percorsi e le ontologie geniche arricchite nei geni differenzialmente espressi. Come mostrato qui, 31 vie totali sono state sovraregolate.

A parte l'ampio raggruppamento del metabolismo, le vie più colpite sono state il sistema immunitario innato e adattativo, rispettivamente con 32 e 20 geni. Anche gli eventi di segnalazione del recettore delle cellule B a valle sono stati arricchiti. Diverse vie di segnalazione sono state anche arricchite tra i geni sovraregolati, coerentemente con l'associazione della sindrome di Alstrom con la disfunzione primaria del cilio.

Inoltre, tre vie associate alla secrezione di insulina sono state sovraregolate: gli acidi grassi legati a GPR40, gli acidi grassi liberi e l'acetilcolina. Infine, sei termini OB sono stati arricchiti tra i geni sovraregolati nel modello di Alstrom, tra cui la differenziazione eritrocitaria, l'omeostasi eritrocitaria, l'omeostasi delle cellule mieloidi e i processi omeostatici. Una volta padroneggiato, il percorso e l'analisi dei termini GO possono essere eseguiti in meno di un'ora.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la selezione dei parametri del percorso e dei valori di cutoff sono le considerazioni più importanti nell'interpretazione dei risultati dei confronti delle espressioni RNASeq. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'applicazione con linee mutanti e l'analisi del trascrittoma di singoli tipi di cellule, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come la profilazione del trascrittoma dei tipi di cellule e i cambiamenti dell'espressione genica sotto il controllo di geni specifici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i dati trascrittomici di zebrafish generati da RNASeq per l'identificazione di cambiamenti significativi nell'espressione genica tra campioni sperimentali.