Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

L'obiettivo generale di questa analisi RNASeq su campioni di larve di zebrafish è identificare i profili di espressione genica negli embrioni e nelle larve di zebrafish e formulare affermazioni quantitative comparative sui cambiamenti nell'espressione genica tra i campioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in qualsiasi campo in cui embrioni o larve di zebrafish siano informativi, ad esempio in che modo la soppressione di un gene bersaglio determini cambiamenti nell'espressione genica o un'interruzione di determinati percorsi rispetto ad altre condizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che lo zebrafish si presta facilmente alla produzione di un elevato numero di animali e i dati del trascrittoma dell'intero organismo possono essere ottenuti con facilità.

Inoltre, l'isolamento di tipi cellulari specifici può essere facilmente ottenuto mediante il sorting di animali transgenici. A dimostrare le procedure saranno Lain Hostelley, una studentessa laureata, e Jessica Nesmith, una ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare gli embrioni fino all'età di tre mesi, che corrisponde alla maturità riproduttiva.

Separare due pesci maschi adulti e tre femmine della linea desiderata in vasche di accoppiamento divise contenenti acqua fresca del sistema la sera precedente il prelievo degli embrioni. La mattina seguente, dopo l'accensione delle luci, rimuovere il divisore e permettere ai pesci di accoppiarsi naturalmente fino a quando non si osservano embrioni sul fondo della vasca. Raccogliere gli embrioni a intervalli di 30 minuti in piastre di Petri separate contenenti mezzo per embrioni, fino a quando non si è ottenuto il numero desiderato.

Per determinare lo stadio degli embrioni, coltivarli in gruppi di 50-75 per ogni piastra di Petri da 10 centimetri, al fine di promuovere un'evoluzione temporale dello sviluppo uniforme per tutti gli embrioni. Successivamente, mantenere le piastre a 28,5 gradi Celsius. Misurare l'età degli embrioni in base al numero di somiti dopo la segmentazione, fino a circa 24 ore dopo la fecondazione (HPF), e separare gli embrioni in base all'età dello sviluppo.

Dopo l'eutanasia degli embrioni allo stadio desiderato secondo il protocollo descritto nel testo, trasferire un gruppo di 20 embrioni in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro etichettato. Successivamente, rimuovere il mezzo in eccesso dagli embrioni presente nel tubo microcentrifuga. Aggiungere 200 microlitri di reagente di lisi al tubo.

E utilizzare un pestello per omogeneizzare meccanicamente gli embrioni. Quindi, aggiungere ulteriori 800 microlitri di reagente di lisi per portare il volume totale a un millilitro. Per estrarre l'RNA, aggiungere il reagente di lisi al campione raccolto e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.

Aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio per ogni 1 millilitro di reagente di lisi utilizzato e capovolgere i tubi manualmente per 15 secondi. Dopo aver incubato i campioni a temperatura ambiente per due o tre minuti, centrifugare i campioni a 12.000 ×g e 4 gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire la fase acquosa separata in un tubo nuovo e aggiungere 0,5 millilitri di isopropanolo per ogni 1 millilitro di reagente di lisi utilizzato.

Dopo aver incubato i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti, centrifugare i campioni per 10 minuti. Successivamente, aggiungere etanolo al 75% all'RNA e centrifugare i tubi a 7.500 × g e 4 gradi Celsius per 5 minuti. Rimuovere completamente il soprannatante e lasciare asciugare il campione all'aria a temperatura ambiente.

Quindi, risospendere l'RNA in 15-30 microlitri di acqua trattata con DEPC. Per purificare un RNA di alta qualità dopo l'estrazione del pellet e il lavaggio del campione secondo il protocollo indicato nel testo, utilizzare uno spettrofotometro ad assorbimento per determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA estratto. Assicurarsi che il valore di assorbimento a 260 nm su 230 nm sia circa 2,0 prima di inviare i campioni di RNA a un fornitore o a un laboratorio per l'analisi mediante RNASeq e per lo studio delle variazioni nell'espressione genica basata sulla quantificazione delle sequenze ottenute.

Per confrontare una singola condizione sperimentale con un controllo, aprire i dati dei geni differenzialmente espressi in un software di gestione dei fogli elettronici. Selezionare la freccia a discesa accanto al pulsante di ordinamento e scegliere "ordinamento personalizzato" all'interno del foglio elettronico. Nella finestra che appare, selezionare la casella sotto la colonna e scegliere di ordinare in base alla colonna LFC.

Nella colonna di ordinamento, assicurarsi che sia selezionato "valori". Nella colonna ordine, selezionare l'ordinamento dal più grande al più piccolo e fare clic su OK. Per determinare i geni espressi in modo differenziale in due condizioni sperimentali, nella tabella sperimentale rispetto al controllo, selezionare la prima cella in una colonna vuota.

Quindi, digitare la seguente equazione nella cella. Premere Invio per eseguire l'equazione. Selezionare la cella contenente l'equazione e fare clic sulla casella nell'angolo in basso a destra della cella.

Tenere premuto il pulsante del mouse e trascinare l'area selezionata lungo tutta la colonna fino a includere l'ultimo ID di funzionalità, in modo da copiare l'equazione in ogni cella della colonna. Selezionare nuovamente l'ordinamento personalizzato e aggiungere un secondo livello di ordinamento facendo clic sull'icona con il segno più nell'angolo in basso a sinistra. Nel primo livello, sotto colonna, selezionare duplicato.

In corrispondenza di "Ordina per", selezionare "valori" e in corrispondenza di "Ordine", selezionare da Z a A. A livello secondario, in corrispondenza di "poi per", sotto "Colonna", selezionare LFC. In corrispondenza di "Ordina per", selezionare "valori" e in corrispondenza di "Ordine", selezionare dal più grande al più piccolo, quindi fare clic su OK. Per rimuovere eventuali parentesi dalla colonna dei simboli genici prima di procedere, selezionare l'intera colonna contenente i simboli genici.

Selezionare modifica, quindi sostituisci nel menu a discesa del file. Digitare parentesi aperta, asterisco, parentesi chiusa nella barra "trova cosa" della finestra di sostituzione e lasciare la barra "sostituisci con" vuota. Selezionare "sostituisci tutto" per rimuovere tutte le istanze delle parentesi.

Per determinare i percorsi arricchiti, copiare i simboli genici desiderati negli appunti. Accedere a ConsensusPathDB, quindi selezionare l'analisi del set di geni nella barra laterale sinistra della pagina web, seguita dall'analisi di sovra-rappresentazione. Nella casella Incolla un elenco di identificatori genici e proteici, incollare l'elenco dei geni.

Selezionare il simbolo del gene nella casella del tipo di identificatore genico/proteico e fare clic su procedi. Nella sezione insiemi basati su percorsi, selezionare la casella accanto a percorsi definiti da database di percorsi. Selezionare trova insiemi arricchiti per ottenere l'elenco dei percorsi che contengono geni presenti nell'elenco di input.

Selezionare tutti i percorsi arricchiti da visualizzare in una rete di percorsi, selezionando ciascuna casella accanto ai nomi dei percorsi oppure, nella colonna di selezione nell'intestazione sopra le caselle di selezione, fare clic su "tutti". Quindi, selezionare "visualizza insiemi selezionati". Regolare i filtri di sovrapposizione relativa e di candidati condivisi selezionando una delle caselle nella parte superiore centrale della pagina e inserendo la percentuale desiderata, la sovrapposizione relativa o il numero di candidati condivisi, quindi selezionare "applica".

Per determinare le ontologie geniche arricchite, copiare i simboli genici del rispettivo gruppo negli appunti. Accedere allo strumento di analisi di arricchimento GO del Gene Ontology Consortium. Sul lato sinistro della pagina, nella sezione "inserisci qui gli ID genici", incollare l'elenco dei simboli genici nella casella.

Sotto la casella degli ID genici, selezionare il termine GO, processo biologico. Quindi, selezionare danio rerio sotto la casella dei termini GO e fare clic su Invia. Eseguire la QRT PCR e confrontare con RNASeq, secondo il protocollo descritto nel testo.

Il sequenziamento dell'RNA estratto da larve iniettate con Morpholino contro alms1 o bbs1 ha rivelato i geni che erano unicamente sovra- e sottoregolati nei modelli di Alstrom e BBS, oltre ai geni significativamente modificati in entrambi i modelli. Per chiarire meglio il profilo molecolare del modello di Alstrom, sono stati identificati i percorsi e le ontologie geniche arricchiti nei geni differenzialmente espressi. Come mostrato qui, un totale di 31 percorsi era sovraregolato.

Oltre al raggruppamento generale del metabolismo, i percorsi maggiormente influenzati erano quelli del sistema immunitario innato e adattativo, con rispettivamente 32 e 20 geni. Anche gli eventi di segnalazione downstream del recettore delle cellule B risultavano arricchiti. Diversi percorsi di segnalazione risultavano inoltre arricchiti tra i geni upregolati, in accordo con l'associazione della sindrome di Alström a un malfunzionamento della ciglia primaria.

Inoltre, tre vie associate alla secrezione di insulina sono state regolate positivamente: acidi grassi legati a GPR40, acidi grassi liberi e acetilcolina. Infine, sei termini GO sono risultati arricchiti tra i geni regolati positivamente nel modello di Alstrom, inclusi differenziamento degli eritrociti, omeostasi degli eritrociti, omeostasi delle cellule mieloidi e processi omeostatici. Una volta acquisita padronanza, l'analisi delle vie metaboliche e dei termini GO può essere completata in meno di un'ora.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la scelta dei parametri del percorso e dei valori di cutoff rappresenta l'aspetto più importante nell'interpretazione dei risultati dei confronti di espressione ottenuti con RNASeq. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'utilizzo di linee mutanti e l'analisi del trascrittoma di tipi cellulari singoli, al fine di rispondere ad ulteriori domande, come il profilo del trascrittoma dei tipi cellulari e le variazioni dell'espressione genica sotto il controllo di geni specifici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare i dati trascrittomisti di pesce zebra generati mediante RNASeq per l'identificazione di variazioni significative dell'espressione genica tra campioni sperimentali.