Name: Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Impara l'analisi RNASeq in Danio rerio per identificare profili di espressione genica e confrontare cambiamenti quantitativi tra campioni. Questo metodo supporta la ricerca in biologia dello sviluppo e neuroscienza.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'approccio descritto in questo protocollo offre una strategia relativamente rapida ed economica per livello transcriptome analisi di animali interi o popolazioni di specifiche cellule ordinato. Zebrafish fornisce un modello vantaggioso per questo tipo di studio per la facilità e la rapidità nel generare grandi quantità di avvio materiale, la facilità di implementazione genetico o ambientale condizioni sperimentali e la disponibilità di un grande spettro delle linee transgeniche reporter consentendo per isolamento di tip...

Analisi comparativa dell'espressione genica globale sono uno strumento prezioso per identificare nuovi geni che contribuiscono ai fenotipi osservati. Tali analisi in genere si basano sulla valutazione quantitativa dell'abbondanza di trascrizione rispetto tra sperimentale e campioni di controllo. Approcci mirati, ad esempio qRT-PCR sono relativamente rapida ed accurata indagine dei cambiamenti di espressione del singolo gene. Sequenziamento di RNA (RNASeq) offre un approccio ampio, privo di ipotesi per identificare i cambiamenti significativi nell'espressione genica tra campioni, rendendo ora lo standard per tali indagini attraverso sistemi sperimentali.
Zebrafish sono emersi come un modello prominente in molte aree di malattia. Originariamente sviluppato per la loro utilità negli studi di biologia dello sviluppo, grazie alla loro alta fecondità e relativamente basso costo di manutenzione, uso sperimentale di zebrafish è evoluto per includere una vasta gamma di fenotipi da embrionali a stadi adulti pure come un vasta gamma di molecolare dosaggi1,2,3. Infatti, questi vantaggi rendono molecolari studi meccanicistici rapido e conveniente a causa della facilità di acquisizione di grandi quantità di materiale combinato con la facilità di manipolazione sia genetica che ambientale in tutte le fasi della vita. Inoltre, la natura trasparente di zebrafish embrioni e le larve lo rendono ideale per la generazione di linee transgeniche reporter cellula - e tessuto-specifico permettendo visualizzazione in vivo di cella discreti popolazioni4. Lo sfruttamento di tali linee permette analisi di espressione genica globale in tipi di cellule isolate specifico basati sull'espressione del gene reporter.
Qui presentiamo un protocollo completo per l'analisi di espressione genica globale utilizzando RNASeq dopo la coltura degli embrioni di zebrafish. Manipolazioni genetiche sperimentali, tra cui morpholino (MO)-atterramento base gene transitoria o editing genomico CRISPR-mediata, sono state presentate altrove5,6,7. Abbiamo pertanto concentrarsi su un protocollo dettagliato per l'isolamento di RNA da interi embrioni o ordinato transgenici esprimenti reporter cells seguita da semplici analisi computazionale di RNASeq risultati utilizzando strumenti di percorso e termini di gene ontology (GO). Infine, abbiamo incluso una strategia per la validazione dei cambiamenti di espressione genica di quantitativi d'inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli sono applicabili agli embrioni di zebrafish sottoposti a una vasta gamma di condizioni sperimentali, compreso il raffronto di mutanti genetici o condizioni ambientali.

<table><tbody><tr><td>Reagenti commerciali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>Reagente per lisi</td><td>15596026</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>tampone di dissociazione 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>tampone di dissociazione 2</td></tr><tr><td>acqua trattata con DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td> di <td>conversione cDNA</td><td>FirstStrand Thermo Scientific</td><td>K1621</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>tampone FACS Fisher</td><td>Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>acetato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><<td></td></tr><tr><td>strong> Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Zebrafish Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 micron filtro cellulare</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>tubo FACS</td><td>Emocitometro 352063</td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td></td><td>Falcon Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di accoppiamento 1.0L Crossing Tank Set</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>tubo FACS 5 mL tubo rigido in polipropilene</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consensus Path DB</td><td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GO Analisi dell'arricchimento</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su rnaseq dallo zebrafish

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

L'analisi dei cambiamenti di espressione genica globale è uno strumento prezioso per identificare nuove vie sottostanti fenotipi osservati. Zebrafish è un eccellente modello per la valutazione rapida dell'intero trascrittoma da popolazioni di cellule intero animale o singoli a causa della facilità di isolamento di RNA da un gran numero di animali. Qui è presentato un protocollo per l'analisi di espressione genica globale negli embrioni di zebrafish mediante sequenziamento di RNA (RNASeq). Descriviamo la preparazione di RNA da interi embrioni o da popolazioni di cellule ottenute mediante cella ordinamento negli animali transgenici. Inoltre descriviamo un approccio per l'analisi dei dati di RNASeq per identificare percorsi arricchiti e termini di Ontology del Gene (vada) in insiemi di dati di espressione genica globale. Infine, forniamo un protocollo per la convalida dei cambiamenti di espressione genica utilizzando quantitativi d'inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli possono essere utilizzati per l'analisi comparativa di controllo e set sperimentali di zebrafish per identificare i cambiamenti di espressione del gene novello e forniscono la comprensione molecolare nei fenotipi di interesse.

L'ordinamento di differenzialmente espressi geni:
Per identificare geni differenzialmente espressi nella fase larvale di zebrafish modelli di sindrome di Alström e sindrome di Bardet-Biedl (BBS), siamo presi di mira sia alms1 o trascrizioni di bbs1 iniettando convalidato in precedenza della giuntura-blocco MOs in selvaggio-tipo zebrafish embrioni16,17. 5 g...

Questo protocollo presenta un approccio per l'analisi del trascrittoma intero da embrioni di zebrafish, larve, o ordinato cells. Includiamo isolamento di RNA, analisi dei percorsi dei dati RNASeq e convalida qRT-PCR-basata di cambiamenti di espressione genica.

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

L'obiettivo generale di questa analisi RNASeq su campioni di larve di zebrafish è identificare i profili di espressione genica negli embrioni e nelle larve di zebrafish e formulare affermazioni quantitative comparative sui cambiamenti nell'espressione genica tra i campioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in qualsiasi campo in cui embrioni o larve di zebrafish siano informativi, ad esempio in che modo la soppressione di un gene bersaglio determini cambiamenti nell'espressione genica o un'interruzione di determinati percorsi rispetto ad altre condizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che lo zebrafish si presta facilmente alla produzione di un elevato numero di animali e i dati del trascrittoma dell'intero organismo possono essere ottenuti con facilità.Inoltre, l'isolamento di tipi cellulari specifici può essere facilmente ottenuto mediante il sorting di animali transgenici. A dimostrare le procedure saranno Lain Hostelley, una studentessa laureata, e Jessica Nesmith, una ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare gli embrioni fino all'età di tre mesi, che corrisponde alla maturità riproduttiva.Separare due pes

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L'isolamento di alta qualità, intatto RNA è un passo essenziale in molti protocolli di laboratorio. In questo studio dimostriamo estrazione di RNA da embrioni di zebrafish tutto e sintesi del DNA per la successiva applicazione in diverse procedure sperimentali inclusa l'analisi microarray di espressione genica.

Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l&#39;analisi di espressione genica

Microarray gene sono strumenti potenti in profili di espressione genica a livello di genoma. Questa tecnologia ha applicazioni in una varietà di discipline biologiche tra cui la biologia dello sviluppo e tossicologia. In questo video, abbiamo dettaglio un protocollo per l'analisi globale dell'espressione genica utilizzando una completa piattaforma microarray di oligonucleotidi per il pesce zebra.

Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

L'articolo descrive un protocollo per generare embrioni di zebrafish attraverso l'accoppiamento naturale e l'ordinamento delle loro fasi di sviluppo. Il protocollo viene utilizzato ulteriormente per l'analisi delle cellule β pancreatiche utilizzando pesci transgenici.

Accoppiamento e stadiazione delle uova: un metodo per generare embrioni e ordinarli per fase di sviluppo

Per analizzare i profili di espressione genica cardiaco durante lo sviluppo del cuore zebrafish, RNA totale deve essere estratto dai cuori isolati. Qui, vi presentiamo un protocollo per la raccolta funzionali / cuori che battono per una rapida dissezione manuale da embrioni di zebrafish per ottenere mRNA specifici cardiaco.

Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l&#39;analisi trascrizionale

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Vi presentiamo un protocollo per isolare i neuroni, i macrofagi e microglia da cervelli di zebrafish larvale in condizioni fisiologiche e patologiche. All'isolamento, RNA è Estratto da queste cellule per analizzare il loro profilo di espressione genica. Questo protocollo consente la raccolta di RNA di alta qualità per l'esecuzione dell'analisi a valle come qPCR e trascrittomica.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

Qui, presentiamo un protocollo per tubercolosi umana modello in un adulto zebrafish utilizzando la sua naturale agente patogeno Mycobacterium marinum. Estratti di DNA e RNA da organi interni di zebrafish infetto può essere utilizzato per rivelare che il totale micobatterico carichi nel pesce e le risposte immunitarie dell'ospite con qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) è un metodo basato sulla biologia chimica per lo studio della segnalazione reattiva di piccole molecole. Questa tecnica può essere applicata a pesci vivi di diversi stadi di sviluppo. Qui, abbiniamo saggi standard nel pesce zebra con Z-REX per l'analisi del percorso di segnalazione.

Monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - Z-REX smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti

Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Impara l'analisi RNASeq in Danio rerio per identificare profili di espressione genica e confrontare cambiamenti quantitativi tra campioni. Questo metodo supporta la ricerca in biologia dello sviluppo e neuroscienza.

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

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