Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Questo video presenta una serie di quattro esperimenti utilizzati per identificare i motivi funzionali della proteina HIV one NPH e per lo sviluppo di inibitori a base di peptidi. Specifici peptidi corti derivati da motivi trovati in proteine a lunghezza intera, mantengono la loro funzione biologica e inibiscono in modo competitivo la funzione della proteina a lunghezza intera per identificare i motivi apoptotici. Nell'HIV una cellula di gatto jerk NEF è esposta a peptidi di scansione NEF e viene eseguito un test apoptotico a tunnel per identificare i peptidi che inducono l'apoptosi.

Una seconda serie di peptidi contenenti variazioni su un motivo di secrezione NEF. La regione di modificazione della secrezione o SMR viene trasfettata nelle cellule insieme alla perdita di funzione della GFP NPH a causa dell'inibizione competitiva indicata dalla diminuzione della secrezione di nph. La GFP viene valutata mediante fluorometria per identificare i fattori cellulari che interagiscono con la regione di modificazione della secrezione o SMR di nef.

Le precipitazioni del coun vengono eseguite utilizzando SMR wild type NPH come esca. Infine, per verificare se queste interazioni influenzano la secrezione, gli anticorpi contro i partner di legame identificati vengono trasfettati nelle cellule. Per valutare se antagonizzano la secrezione del motivo NF, i risultati ottenuti identificano due motivi funzionali apoptotici in NEF e un peptide inibitore che antagonizza un motivo funzionale di secrezione di NEF e i suoi partner di legame cellulare necessari per la secrezione.

L'obiettivo generale di questa serie di quattro esperimenti è quello di accelerare l'identificazione di motivi funzionali nelle proteine bersaglio e quindi utilizzare tali dati per sviluppare inibitori peptidici di base di questi motivi funzionali. Questo insieme di protocolli è stato utile per il nostro gruppo nell'aiutarci a rispondere a domande chiave relative alla patogenesi dell'HIV, come la comprensione del ruolo della secrezione guidata da neph nella patogenesi e nel decifrare i meccanismi alla base della capacità del neff di manipolare la via del traffico esosomiale. Oggi a dimostrare le procedure sarà il Dr.Ming Bo Huang, che è un istruttore di ricerca nel mio laboratorio.

Iniziare questa procedura con una serie di peptidi che scansionano la regione di interesse per questo esperimento. 20 peptidi mer con una sovrapposizione di 10 aminoacidi che coprono l'intera proteina HIV 1 NPH sono stati ottenuti dal programma di reagenti per l'AIDS. Per identificare i motivi apoptotici NPH, eseguire un saggio di apoptosi utilizzando i peptidi di scansione NEF singolarmente come segue, aggiungere un millilitro di terreno di coltura contenente 10 nanogrammi per millilitro di peptide per piastra da 35 millimetri di jerk hat, colture cellulari e incubare le colture per 24 ore a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, eseguire un DUTP mediato da desossinucleotide transferasi terminale, nick della biotina e marcatura o saggio a tunnel per valutare l'apoptosi. Per fare ciò, prima lavare le cellule con PBS, quindi aspirare il PBS e aggiungere il 4% di aldeide paraforma in PBS, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule, dopo aver fissato le cellule, lavarle con PBS e aggiungere Triton X 100, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per permearle. Dopo il fissaggio e la permeabilità delle cellule, aggiungere il reagente tunnel e incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius dopo il permeabile.

Sciacquare le celle due volte con PBS. Quindi determinare la percentuale di cellule colorate mediante epifluorescenza su un sistema di microscopia controllato da computer. Dopo aver sezionato le cellule jca con NPH, plasmide GFP e diverse varianti del peptide SMR utilizzando il kit di reagenti per la somministrazione di proteine chariot come descritto nel documento di accompagnamento, raccogliere il terreno per determinare l'efficienza di trasfezione mediante microscopia a fluorescenza.

Acquisisci immagini fluorescenti e in campo chiaro e determina la percentuale di cellule. Trasfettato quindi per valutare l'inibizione della secrezione di NPH GFP, trasferire 100 microlitri del terreno condizionato privo di cellule in pozzetti individuali di una piastra per microtitolazione nera a 96 pozzetti. Utilizzare un fluorimetro con lunghezza d'onda di eccitazione 485 nanometri e lunghezza d'onda di emissione 515 nanometri per misurare la fluorescenza GFP nel mezzo in unità di fluorescenza relative.

Al termine della lettura, trasferire i dati su un PC. Impostare il livello di fluorescenza GFP nel terreno di controllo al 100%, quindi confrontarlo con il livello di fluorescenza GFP nel terreno proveniente da cellule co-trasfettate con vari peptidi SMR per determinare i cambiamenti nella secrezione di NPH GFP. Il co IP per isolare i partner di legame dei motivi è un passo difficile.

Assicurarsi che le perle siano adeguatamente agitate durante l'incubazione e che venga rimosso quanto più liquido possibile dalle perle durante ogni fase di lavaggio. Coltivare cellule jerk hat in terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS a 37 gradi Celsius in una fiaschetta di coltura tissutale T 75 mediante centrifugazione a 1000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet di cella in un millilitro di PBS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Centrifugare a 1000 volte G per un minuto. Quindi risospendere il pellet in un millilitro di lisi Anti-Flag. Tampone mediante pipettaggio delicato in microcentrifuga differenziale.

Le sospensioni a 2000 volte G per cinque minuti e a 13.000 volte G per 10 minuti. Per pellettare i detriti cellulari e il DNA, raccogliere rispettivamente il surnatante di seguito denominato lisato. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, aggiungere un milligrammo di proteina lisato e un microgrammo di peptide simpatico SMR wild type o SMR mutante a 20 microlitri di gel di affinità Anti-Flag M two.

Questo gel di affinità è di seguito indicato come la resina che porta la miscela a un volume finale di un millilitro in tampone co IP. Preparare anche un controllo negativo in cui il lisato viene combinato con la resina in assenza di entrambi i peptidi. Incubare le miscele a quattro gradi Celsius durante la notte con rotazione da un capo all'altro.

Il giorno successivo pellettare la resina mediante microcentrifugazione a 5.000-8.000 volte G per 30 secondi. Dopo la centrifuga, attendere uno o due minuti prima di maneggiare i campioni per consentire alla resina di depositarsi nel tubo. Rimuovere il surnatante con una punta di pipetta a estremità stretta o una siringa di Hamilton, facendo attenzione a non trasferire la resina.

Lavare la resina quattro volte con la resina, sospendendola in 500 microlitri di tampone di lavaggio, seguita da microcentrifugazione. Per eluire le proteine cellulari legate. Aggiungere 15 microgrammi di peptide three x flag in eccesso nella provetta in 50 microlitri di tampone di lavaggio e incubare su un agitatore a bilanciere per 30 minuti a temperatura ambiente dopo la centrifuga di incubazione a 5.000-8.000 volte G per 30 secondi.

Dopo aver lasciato riposare le provette per due minuti, raccogliere e conservare il surnatante contenente le proteine eluse. Dopo aver concentrato gli EIT mediante precipitazione con acetone, far bollire i campioni in un tampone per campioni laly. Quindi separare le proteine mediante pagina SDS su un triss dal 40 al 20%, HCL criterion precast gel colorare il gel con kumasi blu brillante R due 50.

Per valutare l'inibizione degli anticorpi nelle cellule JCA trasfettate da cot con NGFP e tubulina Antifa o anticorpi antimortalità utilizzando il kit di reagenti per la somministrazione di proteine chariot come descritto nel documento di accompagnamento, raccogliere il terreno condizionato privo di cellule dalle cellule raccolte. Trasferire 100 microlitri in pozzetti individuali di una piastra per microtitolazione nera a 96 pozzetti. Quindi misurare la fluorescenza GFP nel mezzo utilizzando un fluorimetro con lunghezza d'onda di eccitazione 485 nanometri e lunghezza d'onda di emissione 515 nanometri in unità fluorescenti relative.

Dopo aver letto la piastra, trasferire i dati su un PC e impostare il livello di fluorescenza GFP nel controllo anti-tubulina grassa al 100%Confrontare questo con il livello di fluorescenza GFP nel terreno da cellule cot trasfettate con anticorpi anti mortalità per determinare i cambiamenti nella secrezione di NEF GFP per mappare i motivi apoptotici dell'HIV è stata eseguita un'analisi di scansione peptidica delle proteine NPH come descritto in questo video. L'asse Y mostra la percentuale di cellule che sono marcate con tunnel e l'asse x denota la condizione di trattamento come mostrato qui, sono state identificate due regioni separate dell'HIV e una NEF che inducono l'apoptosi. Questi sono indicati da un aumento della marcatura a tunnel delle cellule esposte ai peptidi neph.

I picchi di apoptosi sono indicati dal motivo uno e dal motivo due per valutare l'inibizione competitiva della secrezione di neph da parte dei peptidi SMR wild type, terreno di coltura da cellule T CAT jerk, culla sezionata con un clone NPH GFP e vari peptidi SMR, sono stati saggiati per la secrezione di NPH esoomiale, come mostrato dalla fluorescenza GFP nei peptidi del mezzo contenenti uno o più NPH wild type, i motivi di sequenza SMR hanno inibito la secrezione di NEF esoomiale. mentre la sostituzione con alanina di qualsiasi amminoacido all'interno di questa regione ha notevolmente ridotto l'efficacia dei peptidi. Ciò suggerisce che il peptide wild type SM R inibisce l'nph esoomiale, una versione strapazzata di 11 amminoacidi del motivo apoptotico di neff. Un SM, precedentemente descritto e ottenuto da Sigma Genesis, è stato utilizzato come controllo negativo e non ha avuto alcun effetto sulla secrezione di NEP esoomiale.

Questa immagine del gel della pagina SDS colorato con kumasi mostra la co-immunoprecipitazione di quattro proteine da parte del peptide SMR wild-type con dimensioni di 60, 65, 75 e 250 kilodalton. Il peptide mutante SMR di controllo negativo non ha catturato queste proteine e queste proteine non hanno interagito in modo non specifico con la resina di affinità. In assenza del peptide wild type SMR, questi risultati suggeriscono che le proteine precipitate dal coun interagivano specificamente con i motivi SMR del peptide wild type SMR.

Il test del lettore di piastre mostra che la trasfezione cot dell'anticorpo anti mortale con il plasmide di espressione neph ha completamente abolito la secrezione di NPH esoomiale. L'anticorpo non correlato non ha avuto alcun effetto sulla secrezione esoomiale. Questi risultati suggeriscono che è necessaria un'interazione intatta con i talenti NM per la secrezione di neph esoomiale.

In conclusione, dopo aver visto questo video, dovresti aver sviluppato una buona comprensione di come utilizzare le tecniche di descrizione per identificare i motivi funzionali nelle proteine bersaglio e utilizzare tali dati per sviluppare inibitori peptidici di base di questi motivi funzionali. Durante il tentativo di procedura di co-IP, sarà fondamentale ricordare di prestare particolare attenzione nell'esecuzione dei lavaggi di incubazione, assicurandosi che le perle siano adeguatamente agitate durante l'incubazione e che quanto più liquido possibile venga rimosso dalle perle durante ogni fase di lavaggio. Inoltre, durante i lavaggi della cella e della resina lisata, la resina permette sempre alla resina di depositarsi dopo la centrifugazione.

Utilizzare i puntali per pipette con estremità stretta ed eseguire quattro lavaggi per ridurre adeguatamente lo sfondo a livelli accettabili.