Name: Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Impara a generare e modificare iPSC privi di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando CRISPR-Cas9. Questo metodo consente di ottenere cloni monocellulari modificati con elevata affidabilità e senza mosaicismo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lavoro in laboratorio è stato sostenuto da postdoctoral fellowship grant a Dr. Anjali Nandal e grant esplorativo da Maryland Stem Cell Research Fund a BT (TEDCO).

<ol><li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559(2017).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
</ol>

BT è dei membri fondatori di ristrutturare Biosciences Inc.

Riprogrammazione di cellule somatiche umane per iPSCs ha fornito una spinta importante ai campi di ricerca di base di biologia, medicina personalizzata, modellazione di malattia, lo sviluppo di farmaci e medicina rigenerativa16. Molti metodi attuali e ampiamente usati di iPSC umana generazione richiedono l'uso di virus con il rischio di integrazione nel genoma ospite o episomal vettori con bassa efficienza di riprogrammazione. Qui, presentiamo un metodo efficiente per la generazione iPSCs privo di...

La riprogrammazione di cellule somatiche umane allo stato pluripotent da sovraespressione di fattori di riprogrammazione ha rivoluzionato la ricerca sulle cellule staminali con applicazioni nella modellazione di malattia, la medicina rigenerativa e lo sviluppo di farmaci. Sono disponibili per la consegna dei fattori di riprogrammazione e generando iPSCs diversi metodi di riprogrammazione non-virale, ma il processo è lavoro intensivo e non molto efficiente1. I metodi virali, anche se efficiente, sono associati a problemi di integrazione del virus e carcinogenicità2,3,4. In questo manoscritto, segnaliamo l'uso di citoplasmico Sendai virus per fornire fattori di riprogrammazione e stabilire linee di iPSC privo di impronta che la mancanza di integrazione di tutte le sequenze di vettori virali in loro genomi5. Sendai virus è un virus a RNA che è diluito su passaggi di citoplasma ~ 10 cella dopo l'infezione e produce fattori di riprogrammazione in abbondanza, portando a rapida ed efficiente riprogrammazione6,7. Le iPSCs stabilito poi può essere aumentato facilmente al medium senza alimentatore per evitare l'uso di fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) come alimentatore cellule8.
In questa pubblicazione, oltre a delineare il virus Sendai mediato riprogrammazione, descriviamo anche un protocollo migliorato per l'editing iPSCs, che ha il potenziale per la fornitura di cellule umane illimitate con modificazioni genetiche desiderate per la ricerca. Abbiamo utilizzato la tecnologia CRISPR/Cas9 per la modifica delle iPSCs, che ora viene utilizzato per una vasta gamma di applicazioni tra cui bussare-ins e Ko, delezioni genomiche su larga scala, libreria in pool di screening per l'individuazione del gene, ingegneria genetica di numerosi organismi di modello e gene terapia9,10,11. Questa tecnica comporta la formazione di complessi di Streptococcus pyogenes-derivata Cas9 nucleasi e 20-mer guida RNAs che ottenere il riconoscimento di destinazione tramite appaiamento con sequenza genomica target adiacente al 3' del nucleotide protospacer adiacente sequenza di motivo (PAM). Le nucleasi Cas9 induce un nucleotidi doppia interruzione incagliato ~ 3 dal sito PAM, che è successivamente riparato prevalentemente da non-omologo fine entrare via (NHEJ) che conduce gli inserimenti o eliminazioni nell'open reading frame e quindi funzionale Ko di geni12.
Il nostro protocollo migliorato include i dettagli per la coltura di cellule pancreatiche umane, loro riprogrammazione su mitotically inattivato fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) per raggiungere una maggiore efficienza della riprogrammazione, successivo adattamento alla cultura senza alimentatore il Matrigel, caratterizzazione delle iPSCs stabilito, CRISPR guidato RNA progettazione e preparazione, consegna in iPSCs come complessi di RNP, singola cella ordinamento per generare linee clonali di iPSCs modificato, facile screening e identificazione di modifiche e la caratterizzazione di singola cella cloni. Delezioni genomiche in modo efficiente sono stati generati in questo studio tramite l'introduzione di proteine Cas9 e due CRISPR sgRNA RNP complessi per indurre interruzioni incagliate doppie (DSBs) e l'eliminazione dell'intervento del segmento. Questo metodo sfrutta l'uso di due guide per la generazione le eliminazioni nell'open reading frame, ad alta efficienza di NHEJ portando a basso numero di cloni che necessità di essere caratterizzato e facile screening preliminare di cloni di capillare automatizzata unità di elettroforesi, analizzatore di frammento. Questi genoma efficaci metodi per generare modelli di malattia umana basata su cellule staminali di editing diventerà presto un approccio standard e di routine in qualsiasi laboratorio di cellule staminali. Infine, editing genomico preciso renderà possibile andare di là di modellazione di malattia delle cellule staminali e potenzialmente potrebbe contribuire a catalizzare le terapie basate sulle cellule.

<table><tbody><tr><td>Vettori virali di Sendai - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>Scongelamento su ghiaccio; S No: 1</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0,05%, 100 ml; S No: 2</td></tr><tr><td>Inibitore della roccia (Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>Uso 10 &mu; M; S No: 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>S No: 4</td></tr><tr><td>Siero sostitutivo (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>S No: 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X; S No: 6</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071,03</td><td>Aliquota; S No: 7</td></tr><tr><td>L-glutammina (Glutamax, 100X), liquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100; S No: 8</td></tr><tr><td>aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100; S No: 9</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1.000; S No: 10</td></tr><tr><td>Ematocitometri Hausser</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>S No: 11</td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina allo 0,1%</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Incubare a 37&ordm; C per 1 ora; S No: 12</td></tr><tr><td>anticorpo SSEA-4</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100; S No: 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4745S</td><td>1/200; S n.: 14</td></tr><tr><td>OCT4 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1.000; S No: 15</td></tr><tr><td>Collagene I, Coda di Ratto</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td>Tenere al freddo; S No: 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (anticorpi secondari)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2.000; S No: 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X; S No: 18</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale da 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>S No: 20</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S No: 21</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>S No: 22</td></tr><tr><td>Ambito di dissezione&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>S No: 23</td></tr><tr><td>Cappa di presa</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S No: 24</td></tr><tr><td>15&nbsp; ml Provetta da centrifuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S n.: 25</td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Tubo da centrifuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>S No: 26</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S No: 28</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>S No: 29</td></tr><tr><td>Prigrow III medium</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S No: 31</td></tr><tr><td>Countess&trade; Contatore di cellule</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S No: 32</td></tr><tr><td>Sistema a raggi X Faxitron Faxitron</td><td></td><td>CellRad</td><td>S No: 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S No: 34</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>1mg/ml stock; S No: 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S No: 36</td></tr><tr><td>matrigel qualificato hESC</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Per diluire, utilizzare DMEM/F-12 a freddo; S No: 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td>Cartone: 10 ug/ml; S No: 38</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% stock in PBS; S No: 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21705</td><td>1/100; S No: 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100; S No: 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S No: 42</td></tr><tr><td>Kit fosfatasi alcalina</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S No: 43</td></tr><tr><td>Cas9 proteina</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>Scongelamento e aliquota; S No: 44</td></tr><tr><td>Siero di capra o asino</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>S No: 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>S No: 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>S No: 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>S No: 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>S No: 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>S No: 50</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>S No: 51</td></tr><tr><td>Mega Shortscript T7 kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>S No: 52</td></tr><tr><td>Mega Clear kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>S No: 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>S No: 54</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>S No: 55</td></tr><tr><td>Kit di clonazione CloneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S No: 56</td></tr><tr><td>Analizzatore di frammentiTM</td><td>Advanced Analitico</td><td></td><td>S No: 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 kit medio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>Caldo a temperatura ambiente; S No: 58</td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento mFreSR&trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S No: 59</td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento CryoStor&reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S No: 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S No: 61</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S No: 62</td></tr><tr><td>Cellule pancreatiche umane</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>S No: 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade; Tecnologie</td> delle <td>cellule staminali</td> medie a induzione neurale <td>5835</td><td>S No: 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>S No: 65</td></tr><tr><td>2% B27-insulin</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>S No: 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>S No: 67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>S No: 68</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>S No: 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>S No: 70</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761-100ML</td><td>S No: 71</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>S No: 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>S No: 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>S No: 74</td></tr><tr><td>TUJ1 anticorpo</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S No: 75</td></tr><tr><td>NKX2-5 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>S No: 76</td></tr><tr><td>SOX17 anticorpo</td><td>R & D systems</td><td>AF1924</td><td>S No: 77</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S No: 78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-nucleofector&trade;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>S No: 79</td></tr><tr><td>FACSAria II (selezionatore cellulare)</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>S No: 80</td></tr></tbody></table>

efficiente generazione e la modifica di ipscs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di crispr-cas9

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Cellule staminali pluripotenti embrionali e indotto può auto-rinnovarsi e differenziarsi in più tipi di cellule del corpo. Le cellule pluripotenti sono così ambite per la ricerca in medicina rigenerativa e sono attualmente nei test clinici per le malattie dell'occhio, diabete, malattie cardiache e altri disturbi. La capacità di differenziarsi in tipi cellulari specializzati accoppiati con i recenti progressi nel genoma tecnologie compreso il sistema CRISPR/Cas hanno fornito ulteriori opportunità per la sartoria il genoma di iPSC per svariate applicazioni compreso la malattia di modellazione, terapia genica e la differenziazione dei percorsi di differenziazione, per citarne alcuni. Tra le tecnologie di modifica disponibili, il CRISPR/Cas9 da Streptococcus pyogenes è emerso come uno strumento di scelta per l'editing site-specific del genoma eucariotico. Il CRISPRs sono facilmente accessibile, economico e altamente efficiente in ingegneria modifiche mirate. Il sistema richiede una nucleasi Cas9 e una sequenza di guida (20-mer) specifica per la destinazione genomica adiacente con un 3-nucleotide "NGG" protospacer-adiacente-motivo (PAM) per il targeting Cas9 al locus genomico desiderato, a fianco di un tracciante universale di associazione Cas9 (RNA insieme chiamato RNA guida singola o sgRNA). Qui vi presentiamo un passo-passo il protocollo per generazione efficiente di iPSC alimentatore indipendente e privo di impronta e descrivere metodologie per l'editing genomico di iPSC utilizzando i complessi della ribonucleoproteina (RNP) Cas9. Il genoma protocollo di modifica è efficace e può essere facilmente multiplexed di sgRNAs pre-complessanti per più di una destinazione con la proteina Cas9 e contemporaneamente fornire nelle cellule. Infine, descriviamo un approccio semplificato per l'identificazione e caratterizzazione di iPSCs con modifiche desiderate. Presi insieme, le strategie descritte dovrebbero semplificare la generazione e la modifica di iPSC per molteplici applicazioni.

In questa pubblicazione, abbiamo seguito un protocollo semplice ma efficace per la generazione di iPSC da cellule pancreatiche umane mediante integrazione o privo di impronta Sendai virus vettori. Figura 1A Mostra una rappresentazione schematica del presente protocollo di riprogrammazione. Le cellule pancreatiche umane sono state acquistate commercialmente, coltivate in medium Prigrow III e trasdotte con il virus Sendai come spiegato sopra. Trasdotte fusiform...

Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule staminali pluripotenti indotte prive di tracce, o IPSC, da cellule pancreatiche umane in condizioni senza feeder, quindi modificare le cellule utilizzando ribonucleoproteine CRISPR-Cas9 e infine caratterizzare le singole linee clonali modificate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'editing del genoma delle cellule staminali umane, come la generazione di IPSC prive di tracce e la modifica mediante ribonucleoproteine CRISPR-Cas9. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è possibile ottenere linee clonali di IPSC modificate con elevata affidabilità e non vi è evidenza di mosaicismo.Dopo aver rivestito una piastra a sei pozzetti con collagene freddo, seminare al giorno 2 cellule pancreatiche primarie umane di basso passaggio in mezzo Prigrow III per ottenere circa 2,5 x 10⁵ cellule oppure una confluenza di almeno il 60% per pozzetto al giorno della trasduzione, o giorno zero. Al giorno della trasduzione, dopo aver raccolto e contato le cellule secondo il protocollo descritto nel testo, scongelare in ghiaccio un set di provette contenenti il vettore Sendai e aggiungere con attenzione i volumi calcolati di ciascuna provetta a 1 mL di mezzo Prigrow III preriscaldato. Pipettare delicatamente per mescolare la soluzione.Aspirare il Prigrow III dalle cellule e aggiungere lentamente la miscela virale di riprogrammazione nei pozzetti. Incubare quindi le cellule durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius. Ventiquattro ore dopo la trasduzione, scartare con attenzione la miscela virale dalle cellule e sostituirla con mezzo Prigrow III fresco.Al sesto giorno, aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare alle cellule e incubarle per 10 minuti. Successivamente, utilizzando Prigrow III con inibitore di rock, seminare tutte le cellule in piastre di MEF preparate il giorno precedente. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tutta la notte.Osservare regolarmente le piastre per la comparsa di aggregati cellulari o colonie indicative di cellule riprogrammate, che formeranno aggregati clonali con morfologia a selciato, nucleo grande e nucleoli evidenti. Contrassegnare le colonie di iPSC probabili e controllarle regolarmente per verificarne la crescita. Quasi quattro settimane dopo la trasduzione, dopo aver preparato le piastre di MEF da 24 pozzetti, preparare la membrana matrice aliquotando il prodotto in base al fattore di diluizione indicato nel certificato di analisi.Selezionare 24-48 colonie e trasferirle su piastre da 24 pozzetti rivestite con membrana matrice e contenenti mTeSR1. Incubare le piastre per 24 ore e cambiare il mezzo ogni giorno. Per ulteriori dettagli, consultare il protocollo testuale.Aggiungere 500 mcL di dispasi per staccare le colonie robuste piastrate sulla membrana matrice. Dopo aver incubato le cellule per 20 minuti, ripiastrarle su piastre a 12 pozzetti rivestite con membrana matrice. Espandere e caratterizzare le linee cellulari mediante colorazione per fosfatasi alcalina, immunomarcatura e analisi FACS seguendo il protocollo descritto nel testo.Per trasfettare le iPS dopo aver sintetizzato le sgRNA secondo il protocollo descritto nel testo, preparare la miscela master per la nucleofezione per ogni campione combinando 0,5 mcg di proteina Cas9 e 0,5 mcg di ciascuna sgRNA in un volume di reazione di 22 mcL. Dopo aver aspirato il mezzo contenente l'inibitore di ROCK, utilizzare 2 mL di PBS-R per lavare ogni pozzetto delle iPS. Quindi aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Ri-sospendere le cellule in 3 mL di mezzo mTeSR1 e pipettare delicatamente su e giù per ottenere una sospensione di cellule singole. Trasferire le cellule dissociate in un tubo da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di mezzo mTeSR1.Al mix maestro per la nucleofezione, aggiungere 16,4 µL di integratore P3 per cellule primarie e 3,6 µL dell'integratore uno del kit Nucleofector. Dopo aver contato e centrifugato le cellule, risospendere ogni unità di 0,5 x 106 cellule in 22 µL del mix maestro per la trasfezione precedentemente preparato. Trasferire rapidamente le cellule nella camera centrale di una pozzetta di una striscia Nucleocuvette.Quindi, posizionare la striscia in un dispositivo Nucleofector e nucleofettare le cellule utilizzando il programma CB150. Dopo la nucleofezione, aggiungere rapidamente 80 mcL di mezzo mTeSR1 preriscaldato contenente 10 micromolare di inibitore della chinasi ROCK in ogni pozzetto contenente le cellule nucleofettate. Mescolare delicatamente aspirando e dispensando più volte con una pipetta.Trasferire delicatamente le cellule dalla striscia ai pozzetti della piastra da 12 pozzetti rivestita con matrice membranosa contenente mezzo mTeSR1 con inibitore di ROCK. Al secondo giorno di incubazione, dopo aver preparato le piastre MEF, sostituire il mezzo sui HIPSC da mTeSR1 a mTeSR1 integrato con 1XSMC4 per almeno due ore prima del sorting cellulare singolo. Aspirare il mezzo dai HIPSC e utilizzare PBS per lavare delicatamente le cellule.Quindi aggiungere 500 mcL di soluzione di distacco cellulare in ogni pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Generare una sospensione di cellule singole aggiungendo 1 mL di mTeSR1 in ogni pozzetto e pipettando delicatamente su e giù per diverse volte. Separare le cellule singole in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti precedentemente preparata.Quattro giorni dopo il sorting, la formazione di colonie dovrebbe essere evidente. A questo punto, sostituire il mezzo di coltura con mezzo HESC integrato con SMC4 1X. Dopo aver estratto e amplificato il DNA bersaglio secondo il protocollo indicato nel testo, utilizzare un kit analizzatore di frammenti per analizzare la regione genomica bersaglio amplificata per PCR di tutti i cloni mediante la miscela di colorante per gel, seguendo le istruzioni del produttore.Confermare le linee di iPSC pluripotenti secondo il protocollo descritto nel testo. Prima della trasduzione con il virus di Sendai, le cellule pancreatiche mostrano una tipica morfologia a forma di fuso. Piccole colonie compatte compaiono sui MEF entro il giorno 12, simili alle colonie di cellule pluripotenti umane.Normalmente, le colonie di iPSC umane completamente riprogrammate presentano confini molto definiti e possono essere selezionate tra il giorno 23 e il giorno 30. Qui viene mostrata una colonia dissociata al giorno 23. Nell'immagine è riportata una tipica vista a contrasto di fase di una colonia di iPSC dopo il prelievo e la coltura in condizioni senza feeder, a seguito della riprogrammazione mediante virus di Sendai di cellule pancreatiche.Le colonie di IPSC colorate in rosso per la fosfatasi alcalina sono a destra. Le IPSC sono state confermate mediante colorazione immunoistochimica per i marcatori di pluripotenza OCT4 e NANOG, come mostrato in questi pannelli. In questo esperimento, le IPSC sono state colorate con marcatori della superficie cellulare ed è stata eseguita un'analisi FACS su una sospensione di singole cellule.Il picco verde rappresenta le IPSC pancreatiche, mentre il picco viola contiene cellule negative per le IPSC. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere condizioni asettiche o sterili per la separazione cellulare e la coltura cellulare. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il targeting genico in IPSC e in ESC, e ulteriori domande possono essere affrontate mediante modifiche genetiche precise.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare in modo affidabile IPSC prive di impronte e di cellule di supporto ed eseguire modifiche genomiche bialleliche.

efficient-generation-editing-feeder-free-ipscs-from-human-pancreatic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Gli strumenti di editing del genoma come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) hanno notevolmente migliorato l'efficienza del targeting genico nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter hiPSC specifici per il lignaggio utilizzando la ricombinazione omologa assistita dal sistema CRISPR/Cas.

Generazione efficiente di reporter knockin specifici per il lignaggio neurale hiPSC utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e Cas9 Double Nickase

L'editing del genoma delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) può essere fatto in modo rapido ed efficiente. Qui viene presentata una robusta procedura sperimentale per l'ingegneria genetica delle hPSC, come esemplificato dalla modifica del locus safe harbor AAVS1 per esprimere EGFP e introdurre resistenza agli antibiotici.

Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l'analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Descritto qui è un protocollo per l'etichettatura in modo endogeno espresse proteine con tag fluorescente in cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando CRISPR/Cas9. Celle putativamente modificate sono arricchite da ordinamento di attivate la fluorescenza delle cellule e linee clonali della cellula vengono generate.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

Presentato qui è un protocollo per l'efficiente editing genico mediato da ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 nelle cellule dei mammiferi utilizzando l'elettroporazione dei tubi.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Questo protocollo fornisce un metodo per facilitare la generazione di cambiamenti di nucleotidi eterozio o omozigo utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Il metodo presentato descrive la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR nella linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC), che esprime stabilmente sgRNA che hanno come bersaglio il gene L2HGDH utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente.

Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

Impara a generare e modificare iPSC privi di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando CRISPR-Cas9. Questo metodo consente di ottenere cloni monocellulari modificati con elevata affidabilità e senza mosaicismo.

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9 (Video) | JoVE Journal

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Esplora altri video