Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte prive di impronta o IPSC da cellule pancreatiche umane in condizioni di feeder-free, quindi di modificare le cellule utilizzando le ribonucleoproteine CRISPR-Cas9 e infine di caratterizzare i cloni di singole cellule modificate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'editing del genoma delle cellule staminali umane, come la generazione di IPSC prive di impronte e l'editing con ribonucleoproteine CRISPR-Cas9. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le linee clonali di IPSC modificate possono essere generate con elevata affidabilità e non vi è evidenza di mosaicismo.

Dopo aver rivestito una piastra a sei pozzetti con collagene freddo, piastra le cellule pancreatiche primarie umane a passaggio precoce nel terreno Prigrow III il giorno 2 per ottenere circa 2,5 x 10 alle 5 cellule o almeno il 60% di confluenza per pozzetto il giorno della trasduzione o il giorno zero. Il giorno della trasduzione, dopo aver raccolto e contato le cellule secondo il protocollo di testo, scongelare con ghiaccio un set di provette vettoriali Sendai e aggiungere con cura i volumi calcolati di ciascuna provetta a 1 mL di terreno Prigrow III preriscaldato. Pipettare delicatamente per miscelare la soluzione.

Aspirare il Prigrow III dalle cellule e aggiungere lentamente la miscela di virus di riprogrammazione ai pozzetti. Quindi incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte. Ventiquattro ore dopo la trasduzione, scartare con cura la miscela virale sulle cellule e sostituirla con un terreno fresco di Prigrow III.

Il sesto giorno, aggiungere 1 mL di soluzione per il distacco cellulare alle cellule e incubarle per 10 minuti. Quindi, utilizzando Prigrow III con un inibitore di roccia, piastrate tutte le cellule su piatti di MEF preparati il giorno prima. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte.

Osservare regolarmente le piastre per l'emergere di grumi cellulari o colonie indicative di cellule riprogrammate che formeranno aggregati clonali con una morfologia a ciottoli e un grande nucleo e nucleoli. Contrassegna le probabili colonie IPSC e controllane regolarmente la crescita. Quasi quattro settimane dopo la trasduzione, dopo aver preparato piastre MEF a 24 pozzetti, preparare la membrana della matrice aliquotandola in base al fattore di diluizione sul certificato di analisi.

Prelevare 24-48 colonie e trasferirle su piastre da 24 pozzetti rivestite con membrana matrice con mTeSR1. Incubare le piastre per 24 ore e cambiare il terreno ogni giorno. Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo.

Aggiungere 500 mcL di dispasi per staccare le colonie robuste piastrate sulla membrana della matrice. Dopo aver incubato le cellule per 20 minuti, piastrerle nuovamente su piastre da 12 pozzetti rivestite con membrana a matrice. Espandere e caratterizzare i cloni utilizzando la colorazione con fosfatasi alcalina, l'immunocolorazione e l'analisi FACS secondo il protocollo di testo.

Per trasfettare gli HIPSC dopo aver sintetizzato gli SGRNA secondo il protocollo di testo, preparare la master mix di nucleazione per ciascun campione combinando 0,5 mcg di proteina Cas9 e 0,5 mcg di ciascun SGRNA in un volume di reazione di 22 mcL. Dopo aver aspirato il terreno contenente l'inibitore della roccia, utilizzare 2 ml di RTPBS per lavare ogni pozzetto di ISPC. Quindi aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di soluzione per il distacco cellulare.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Risospendere le cellule in 3 mL di terreno mTeSR1 e pipettare delicatamente su e giù per generare una sospensione di una singola cellula. Trasferire le cellule dissociate in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di terreno mTeSR1.

Al master mix di nucleofezione, aggiungere 16,4 mcL di integratore di cellule primarie P3 e 3,6 mcL di integratore uno dal kit Nucleofector. Dopo aver contato e centrifugato le cellule, risospendere ciascuna unità di 0,5 x 10 alla sesta cella in 22 mcL della miscela master di trasfezione precedentemente preparata. Trasferire rapidamente le cellule nella camera centrale di un pozzetto di una striscia di nucleocuvetta.

Quindi, posizionare la striscia in un dispositivo Nucleofector e nucleofectare le cellule utilizzando il programma CB150. Dopo la nucleofezione, aggiungere rapidamente 80 mcL di terreno mTeSR1 preriscaldato contenente 10 inibitori di roccia micromolare a ciascun pozzetto delle cellule nucleofettate. Mescolare delicatamente pipettando su e giù.

Trasferire delicatamente le cellule dalla striscia ai pozzetti della membrana della matrice prerivestita su piastra a 12 pozzetti contenente terreno mTeSR1 con inibitore di roccia. Il secondo giorno di incubazione dopo la preparazione delle piastre MEF, sostituire il terreno sulle HIPSC da mTeSR1 a mTeSR1 integrato con 1XSMC4 per almeno due ore prima dello smistamento di singole cellule. Aspirare il terreno dalle HIPSC e utilizzare il PBS per lavare delicatamente le cellule.

Quindi aggiungere 500 mcL di soluzione per il distacco delle cellule in ciascun pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Generare una sospensione a singola cellula aggiungendo 1 mL di mTeSR1 a ciascun pozzetto e pipettare delicatamente su e giù più volte. Ordinare le singole cellule in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti precedentemente preparata.

Quattro giorni dopo lo smistamento, la formazione delle colonie dovrebbe essere evidente. A questo punto, sostituire il terreno di coltura con un terreno HESC integrato con 1X SMC4. Dopo aver estratto ed espanso il DNA bersaglio secondo il protocollo di testo, utilizzare un kit analizzatore di frammenti per eseguire la regione genomica bersaglio amplificata dalla PCR di tutti i cloni attraverso la miscela di coloranti in gel secondo le istruzioni del produttore.

Confermare i cloni IPSC pluripotenti secondo il protocollo di testo. Prima della trasduzione del virus Sendai, le cellule pancreatiche mostravano una tipica morfologia a fuso. Piccole colonie strette compaiono sui MEF entro il giorno 12 assomigliando a colonie di cellule pluripotenti umane.

Normalmente, le colonie di IPSC umane completamente riprogrammate hanno confini molto chiari e possono essere rilevate entro i giorni 23-30. Qui è mostrata una colonia dissociata al giorno 23. Qui viene presentata una tipica immagine a contrasto di fase di una colonia di IPSC dopo il prelievo e la coltura in condizioni prive di alimentatore dopo la riprogrammazione delle cellule pancreatiche da parte del virus Sendai.

Le colonie di IPSC rosse colorate con fosfatasi alcalina sono sulla destra. Le IPSC sono state confermate mediante immunocolorazione per i marcatori di pluripotenza OCT4 e NANOG, come osservato in questi pannelli. In questo esperimento, le IPSC sono state colorate con marcatori di superficie cellulare e l'analisi FACS è stata eseguita su una singola sospensione cellulare.

Il picco verde rappresenta le IPSC pancreatiche e il picco viola contiene le cellule IPSC negative. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere condizioni asettiche o sterili per la selezione e la coltura cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il targeting genico nelle IPSC e nelle ESC, e si può rispondere a ulteriori domande eseguendo precise modificazioni genetiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare in modo affidabile IPSC senza impronte e feeder ed eseguire l'editing del genoma in modo biallelico.