Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9
8 novembre 2017
Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule staminali pluripotenti indotte prive di tracce, o IPSC, da cellule pancreatiche umane in condizioni senza feeder, quindi modificare le cellule utilizzando ribonucleoproteine CRISPR-Cas9 e infine caratterizzare le singole linee clonali modificate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'editing del genoma delle cellule staminali umane, come la generazione di IPSC prive di tracce e la modifica mediante ribonucleoproteine CRISPR-Cas9. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è possibile ottenere linee clonali di IPSC modificate con elevata affidabilità e non vi è evidenza di mosaicismo.
Dopo aver rivestito una piastra a sei pozzetti con collagene freddo, seminare al giorno 2 cellule pancreatiche primarie umane di basso passaggio in mezzo Prigrow III per ottenere circa 2,5 x 10⁵ cellule oppure una confluenza di almeno il 60% per pozzetto al giorno della trasduzione, o giorno zero. Al giorno della trasduzione, dopo aver raccolto e contato le cellule secondo il protocollo descritto nel testo, scongelare in ghiaccio un set di provette contenenti il vettore Sendai e aggiungere con attenzione i volumi calcolati di ciascuna provetta a 1 mL di mezzo Prigrow III preriscaldato. Pipettare delicatamente per mescolare la soluzione.
Aspirare il Prigrow III dalle cellule e aggiungere lentamente la miscela virale di riprogrammazione nei pozzetti. Incubare quindi le cellule durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius. Ventiquattro ore dopo la trasduzione, scartare con attenzione la miscela virale dalle cellule e sostituirla con mezzo Prigrow III fresco.
Al sesto giorno, aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare alle cellule e incubarle per 10 minuti. Successivamente, utilizzando Prigrow III con inibitore di rock, seminare tutte le cellule in piastre di MEF preparate il giorno precedente. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tutta la notte.
Osservare regolarmente le piastre per la comparsa di aggregati cellulari o colonie indicative di cellule riprogrammate, che formeranno aggregati clonali con morfologia a selciato, nucleo grande e nucleoli evidenti. Contrassegnare le colonie di iPSC probabili e controllarle regolarmente per verificarne la crescita. Quasi quattro settimane dopo la trasduzione, dopo aver preparato le piastre di MEF da 24 pozzetti, preparare la membrana matrice aliquotando il prodotto in base al fattore di diluizione indicato nel certificato di analisi.
Selezionare 24-48 colonie e trasferirle su piastre da 24 pozzetti rivestite con membrana matrice e contenenti mTeSR1. Incubare le piastre per 24 ore e cambiare il mezzo ogni giorno. Per ulteriori dettagli, consultare il protocollo testuale.
Aggiungere 500 mcL di dispasi per staccare le colonie robuste piastrate sulla membrana matrice. Dopo aver incubato le cellule per 20 minuti, ripiastrarle su piastre a 12 pozzetti rivestite con membrana matrice. Espandere e caratterizzare le linee cellulari mediante colorazione per fosfatasi alcalina, immunomarcatura e analisi FACS seguendo il protocollo descritto nel testo.
Per trasfettare le iPS dopo aver sintetizzato le sgRNA secondo il protocollo descritto nel testo, preparare la miscela master per la nucleofezione per ogni campione combinando 0,5 mcg di proteina Cas9 e 0,5 mcg di ciascuna sgRNA in un volume di reazione di 22 mcL. Dopo aver aspirato il mezzo contenente l'inibitore di ROCK, utilizzare 2 mL di PBS-R per lavare ogni pozzetto delle iPS. Quindi aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Ri-sospendere le cellule in 3 mL di mezzo mTeSR1 e pipettare delicatamente su e giù per ottenere una sospensione di cellule singole. Trasferire le cellule dissociate in un tubo da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di mezzo mTeSR1.
Al mix maestro per la nucleofezione, aggiungere 16,4 µL di integratore P3 per cellule primarie e 3,6 µL dell'integratore uno del kit Nucleofector. Dopo aver contato e centrifugato le cellule, risospendere ogni unità di 0,5 x 106 cellule in 22 µL del mix maestro per la trasfezione precedentemente preparato. Trasferire rapidamente le cellule nella camera centrale di una pozzetta di una striscia Nucleocuvette.
Quindi, posizionare la striscia in un dispositivo Nucleofector e nucleofettare le cellule utilizzando il programma CB150. Dopo la nucleofezione, aggiungere rapidamente 80 mcL di mezzo mTeSR1 preriscaldato contenente 10 micromolare di inibitore della chinasi ROCK in ogni pozzetto contenente le cellule nucleofettate. Mescolare delicatamente aspirando e dispensando più volte con una pipetta.
Trasferire delicatamente le cellule dalla striscia ai pozzetti della piastra da 12 pozzetti rivestita con matrice membranosa contenente mezzo mTeSR1 con inibitore di ROCK. Al secondo giorno di incubazione, dopo aver preparato le piastre MEF, sostituire il mezzo sui HIPSC da mTeSR1 a mTeSR1 integrato con 1XSMC4 per almeno due ore prima del sorting cellulare singolo. Aspirare il mezzo dai HIPSC e utilizzare PBS per lavare delicatamente le cellule.
Quindi aggiungere 500 mcL di soluzione di distacco cellulare in ogni pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Generare una sospensione di cellule singole aggiungendo 1 mL di mTeSR1 in ogni pozzetto e pipettando delicatamente su e giù per diverse volte. Separare le cellule singole in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti precedentemente preparata.
Quattro giorni dopo il sorting, la formazione di colonie dovrebbe essere evidente. A questo punto, sostituire il mezzo di coltura con mezzo HESC integrato con SMC4 1X. Dopo aver estratto e amplificato il DNA bersaglio secondo il protocollo indicato nel testo, utilizzare un kit analizzatore di frammenti per analizzare la regione genomica bersaglio amplificata per PCR di tutti i cloni mediante la miscela di colorante per gel, seguendo le istruzioni del produttore.
Confermare le linee di iPSC pluripotenti secondo il protocollo descritto nel testo. Prima della trasduzione con il virus di Sendai, le cellule pancreatiche mostrano una tipica morfologia a forma di fuso. Piccole colonie compatte compaiono sui MEF entro il giorno 12, simili alle colonie di cellule pluripotenti umane.
Normalmente, le colonie di iPSC umane completamente riprogrammate presentano confini molto definiti e possono essere selezionate tra il giorno 23 e il giorno 30. Qui viene mostrata una colonia dissociata al giorno 23. Nell'immagine è riportata una tipica vista a contrasto di fase di una colonia di iPSC dopo il prelievo e la coltura in condizioni senza feeder, a seguito della riprogrammazione mediante virus di Sendai di cellule pancreatiche.
Le colonie di IPSC colorate in rosso per la fosfatasi alcalina sono a destra. Le IPSC sono state confermate mediante colorazione immunoistochimica per i marcatori di pluripotenza OCT4 e NANOG, come mostrato in questi pannelli. In questo esperimento, le IPSC sono state colorate con marcatori della superficie cellulare ed è stata eseguita un'analisi FACS su una sospensione di singole cellule.
Il picco verde rappresenta le IPSC pancreatiche, mentre il picco viola contiene cellule negative per le IPSC. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere condizioni asettiche o sterili per la separazione cellulare e la coltura cellulare. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il targeting genico in IPSC e in ESC, e ulteriori domande possono essere affrontate mediante modifiche genetiche precise.
Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare in modo affidabile IPSC prive di impronte e di cellule di supporto ed eseguire modifiche genomiche bialleliche.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) prive di impronte da cellule pancreatiche umane in condizioni senza feeder, seguita da modifiche mediante ribonucleoproteine CRISPR/Cas9 e caratterizzazione delle linee clonali modificate derivate da singole cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Ingegneria genetica
- Tecniche di coltura cellulare
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono preziose per la ricerca e la terapia.
- Le iPSC prive di tracce evitano i problemi di integrazione associati ai metodi tradizionali.
- La tecnologia CRISPR/Cas9 consente una modifica precisa del genoma.
- La caratterizzazione dei cloni modificati è essenziale per convalidare i cambiamenti genetici.
Scopo dello studio
- Generare iPSC prive di tracce da cellule pancreatiche umane.
- Utilizzare CRISPR/Cas9 per modificare queste cellule.
- Caratterizzare le singole linee cellulari clonali modificate ottenute.
Metodi Utilizzati
- Rivestimento di piastre a sei pozzetti con collagene freddo.
- Seeding di cellule pancreatiche primarie umane in coltura precoce in mezzo Prigrow III.
- Trasduzione con vettori di tipo Sendai per la modifica del genoma.
- Caratterizzazione di cloni di iPSC modificati per affidabilità e mosaicismo.
Risultati principali
- Generazione con successo di iPSC prive di impronte.
- Elevata affidabilità nella generazione di linee clonali di iPSC modificate.
- Assenza di evidenze di mosaicismo nei cloni modificati.
- Convalida dell'efficacia delle ribonucleoproteine CRISPR/Cas9.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio affidabile per generare e modificare iPSC.
- Le iPSC prive di tracce possono essere utilizzate per diverse applicazioni nella ricerca.
- I ribonucleoproteine CRISPR/Cas9 sono efficaci per la modifica precisa del genoma.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una generazione affidabile di iPSC prive di impronte genomiche da cellule pancreatiche umane in condizioni senza feeder, supportando la modellizzazione delle malattie e lo sviluppo di terapie nel diabete e nella medicina rigenerativa. Combinando la riprogrammazione con vettori Sendai e la modifica mediante RNP CRISPR-Cas9, permette di ottenere linee clonali e prive di mosaicismo con elevata efficienza, riducendo la perdita di ceppi nelle fasi di convalida dell'obiettivo e di identificazione dei candidati terapeutici. L'approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici fornendo sistemi cellulari umani scalabili e geneticamente definiti per la riduzione del rischio meccanicistica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche nella linea cellulare pancreatica umana mediante editing genomico preciso di iPSC.
- Valore operativo: Produce iPSC clonali e privi di tracce genomiche, senza mosaicismi, garantendo un background genetico pulito per la validazione del bersaglio.
- Valore predittivo: Favorisce la fiducia predittiva generando controlli isogenici per la chiarificazione dei percorsi metabolici e lo screening fenotipico.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cellule pancreatiche derivate da iPSC validate, adatte allo sviluppo di saggi per lo screening di bersagli correlati al diabete.
- Valore operativo: Consente la produzione scalabile e riproducibile di cloni di iPSC modificati per la valutazione di composti in formati a 96 pozzetti.
- Prontezza per il saggio: Fornisce iPSC modificate geneticamente, separate a livello di singola cellula, con modifiche definite, per screening successivi coerenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Fornisce modelli di iPSC pancreatiche umane pertinenti per la malattia, utili per la validazione preclinica di bersagli genetici.
- De-risking meccanicistico: Permette la modifica di loci associati alla malattia per valutare la modulazione del bersaglio e il biasing del percorso in cellule umane.
- Modello preclinico: Supporta l' avanzamento con rischio calibrato generando linee clonali di iPSC con modifiche mirate verificate e assenza di integrazioni fuori bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi iniziale dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto attivo e alla validazione preclinica, consentendo una transizione fluida dalla modifica genetica alla valutazione funzionale in modelli cellulari umani.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi mediante un'accurata modifica con CRISPR-Cas9 di iPSC derivati da cellule pancreatiche umane per chiarire la funzione genica nei percorsi della malattia.
- Screening: Permette popolazioni clonali di iPSC pronte per saggi, con genotipi definiti, per studi riproducibili di screening di composti e di interazione con il bersaglio.
- Analisi: Fornisce risultati genotipici quantitativi tramite l'analisi di frammenti di regioni bersaglio amplificate con PCR, consentendo il confronto tra cloni modificati e cloni di tipo selvaggio.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico fornendo iPSC umani geneticamente modificati con fenotipo pancreatico rilevante per la malattia, per la validazione del bersaglio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la generazione e la modifica di iPSC privi di tracce su più bersagli e progetti, riducendo lo sviluppo ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile grazie a iPSC clonali e prive di mosaico con modifiche bialleliche precise per una validazione dell'obiettivo riproducibile.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e scalabilità mediante flussi di lavoro senza feeder e basati su selezione di singole cellule, compatibili con modifiche ad alto rendimento.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione riducendo i rischi biologici tardivi grazie a una riduzione precoce del rischio meccanicistico in cellule umane.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio fornendo cloni di iPSC geneticamente validati per le decisioni di avanzamento nei percorsi di medicina rigenerativa.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella nucleofezione e nel sorting di singole cellule per la generazione e la modifica efficace di iPSC.
- È dipendente dall'uso di apparecchiature Nucleofector, complessi RNP CRISPR-Cas9 e piastre rivestite con membrana matrice per un efficiente trasferimento e espansione clonale.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dedicati alla coltura cellulare, alla biologia molecolare e alle analisi, al fine di garantire una caratterizzazione clonale costante.
- Comporta considerazioni di adattamento qualora si intenda estendere il metodo ad altri tipi cellulari oltre alle cellule pancreatiche umane, inclusa l'ottimizzazione dell'efficienza di riprogrammazione e di editing.
- Include limitazioni pratiche, come la necessità di utilizzare tecniche asettiche durante il sorting e la coltura per mantenere l'integrità del clone e prevenire contaminazioni.
