Name: G2-seq: Unelevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri come identificare le regioni del genoma che replicano tardivamente nel ciclo cellulare usando la citometria a flusso e il sequenziamento ad alto throughput. Questo metodo semplice offre una visione dettagliata della dinamica della replicazione genomica.

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Questo lavoro è stato supportato da grant GM117446 NIH di A.B.

1. preparazione delle cellule per flusso Cytometry ordinamento
<ol><li>Inoculare provette da 15 mL contenente 8 mL di brodo YEPD tale che le culture raggiungono una densità di 5 x 106 a 1,5 x 107 cellule per mL dopo crescita durante la notte (vedi discussione Nota 1).</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule di lievito (1.400 x g, a temperatura ambiente o a 4 ° C) in una provetta da centrifuga da 15 mL tappo a vite per 5 min, risospendere le cellule in 1,5 mL di etanolo al 70% e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,6 mL, lasciando questo sedersi per 1 h a temperatura ambiente o almeno 3 h sul ghiaccio ( possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ° C) (Vedi punto di discussione (2)).</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule di lievito in microfuge (14.000 x g, 4 ° C) per 1 min, risospendere in 1 mL 50 millimetri citrato di sodio, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C) per 1 min, aspirare il surnatante e risospendere in 1 mL 50 millimetri citrato di sodio, pH 7,2 , contenente 0,25 mg/mL soluzione di RNAsi per 1 h a 50 ° C o una notte a 37 ° C in bagno di acqua o blocco di calore.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di proteinasi K (20 mg/mL risospesi in 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 2mm CaCl2, 50% in peso di glicerolo di volume) e incubare per 1 h a 50 ° C.</li>
	<li>Rotazione verso il basso delle cellule (14.000 x g, 4 ° C), risospendere le cellule in 1 mL 50 millimetri di citrato di sodio, pH 7,2, rotazione verso il basso (14.000 x g, 4 ° C), aspirare il surnatante con vuoto, risospendere in 1 mL 1 µM verde acido nucleico ceppo risospeso in citrato di sodio 50 mM , pH 7.2 ed incubare al buio per 1 h a temperatura ambiente, Sonicare x 2 per 2 s ciascuno (2 watt di potenza di uscita).</li>
</ol>2. cella ordinamento
<ol><li>Usando un Classificatore celle, ordinare le celle in base al contenuto di DNA in fasi G1, S, "primi G2" e "fine G2", raccolta di cellule aploidi almeno 1,6 milioni da ogni fase del ciclo cellulare come in Figura 1 (Vedi punto di discussione (3)).</li>
	<li>Trasferire le cellule microfuge provette e spin giù cellule per 20 min a 14.000 x g a 4 ° C nel microfuge e aspirare il surnatante con vuoto (il pellet può essere conservato congelati a-20 ° C a tempo indeterminato; veda discussione punto (4)).</li>
</ol>3. DNA estrazione e preparazione di sequenziamento librerie
Nota: La procedura seguente si basata su "protocollo I" nell'estrazione del DNA genomico di lievito Kit (Vedi Tabella materiali).
<ol><li>Aggiungere 120 µ l di "Buffer di digestione," un buffer proprietario che consente degli enzimi litici di lievito a digerire la parete cellulare e 5 µ l di enzima litico lievito, risospendere nel vortex e incubare a 37 ° C per 40-60 min.</li>
	<li>Aggiungere 120 µ l di tampone di Lisi"," un buffer proprietario che contiene detergente e vortice dura per 10-20 s.</li>
	<li>Aggiungi 250 cloroformio µ l - Mescolare accuratamente per 1 min.</li>
	<li>Girare alla massima velocità in un microfuge per 2 min.</li>
	<li>Caricare il surnatante nella colonna associazione DNA e centrifugare in un microfuge alla massima velocità per 1 min.</li>
	<li>Aggiungere 300 µ l di "DNA lavaggio Buffer," un buffer proprietario che contiene etanolo e centrifugare per 1 min in un microfuge alla massima velocità. Scartare il flusso attraverso, aggiungere 300 µ l di tampone di lavaggio di DNA e ripetere il processo di lavaggio.</li>
	<li>Trasferire la colonna di spin in una provetta di microfuge fresco, aggiungere 60 µ l di acqua (non TE) - attendere 1-3 min e poi Centrifugare per 10 s per eluire il DNA.</li>
	<li>Misurare la concentrazione aggiungendo 5 µ l di DNA a 195 µ l di reagente di dsDNA ad alta sensibilità che è stato diluito 1: 200 in buffer di dsDNA ad alta sensibilità e quindi misura fluorescenza in un fluorimetro, utilizzando 10 µ l di dotazione standard per la calibrazione; si aspettano tra 10 e 50 ng di rendimento totale del DNA.</li>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni (picco incidente potenza 450, fattore di utilizzo del 30%, cicli al Burst 200, trattamento tempo 60 s, livello acqua 6) per spezzare il DNA in frammenti di 250-350 bp.</li>
	<li>Preparare una libreria utilizzando il kit di preparazione del campione del DNA e la sequenza è (almeno 10 milioni di 50 bp singolo fine letture) dello strumento di sequenziamento del DNA in modalità rapida (vedi discussione nota (5)).</li>
</ol>4. analisi di sequenziamento dati e generazione di replica profili
<ol><li>Allineare sequenze di genoma di Saccharomyces cerevisiae sacCer3 utilizzando Gsnap12 (Vedi nota di discussione (6)).</li>
	<li>Determinare a base pair leggi di profondità utilizzando "genomeCoverageBed" software13 degli Bedtools.</li>
	<li>Se presente, rimuovere punte artefactual nelle profondità di lettura, (vedi discussione nota (7)).</li>
	<li>Liscio leggere profondità dal cromosoma utilizzando mediane in un 20kb scorrevoli finestra utilizzando la funzione "runMean" in R pacchetto "caTools" (vedi discussione nota (8)).</li>
	<li>Trama leggere profondità in fase S, G2 presto e tardi G2 come percentuale della profondità di lettura completamente replicata (Vedi nota di discussione (9)).</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mentre questa tecnica è robusta e relativamente dritto in avanti, particolare attenzione deve essere rivolta al seguente:
(1) si consiglia che culture crescono per almeno 12 ore prima che raggiungano la fase di log, poiché le differenze si manifestano nel ciclo cellulare distribuzioni se culture vengono vendemmiate, dopo aver raggiunto la densità desiderata solo 4 h dopo l'inoculazione. La nostra ipotesi sono che una distribuzione del ciclo cellulare che ha raggiunto un equilibrio relativament...

In più siti discreti, chiamati origini di replicazione, da cui la replica forcelle procedere in entrambe le direzioni (rivisto in Fragkos et al., 20151) viene avviata la replica del genoma eucariotico. Origini variano nella loro tempistica e l'efficienza di cottura, e sono state sviluppate diverse tecniche per monitorare l'attività di origine di replica e delucidare le cause di questa variazione. L'attività delle singole origini può essere dedotto dai livelli di single-stranded DNA2, che si forma intorno origini attivi, o utilizzando 2D elettroforesi del gel per monitorare specifiche replica intermedi3, entrambi i quali possono essere rilevati con sonde radioattive. Entrambe queste tecniche sono più facilmente applicate in S. cerevisiae rispetto in cellule di mammifero, perché origini sono limitati a specifiche sequenze conosciute nel precedente. Con l'avvento dei microarray, è diventato possibile valutare origine sparando a livello globale. Questo è stato fatto prima di etichettatura del DNA con gli isotopi pesanti, rilasciando le cellule da un blocco di G1 in medi contenenti isotopi leggeri e monitoraggio quindi la formazione di pesante-leggero ibrido DNA attraverso il genoma4. L'introduzione di sequenziamento ad alta permesso simili genoma monitoraggio dell'attività di origine senza l'obbligo di etichettatura isotopica costosi. Le cellule sono state ordinate in un citometro a flusso in base al contenuto di DNA e il loro DNA sottoposti a sequenziamento profondo. Perché copertura sequenza procede da 1x a 2x nel corso della fase S, tempo di replicazione relativa può essere valutata confrontando la lettura profondità delle cellule in fase S a quelli in G1 o G25,6. Queste tecniche, in particolare applicate ai lieviti, ha portato ad una più profonda comprensione di come sequenza di DNA, struttura della cromatina e DNA replica proteine regolano la efficienza e la tempistica di origine.
L'inizio non solo successo della replicazione del DNA, che si svolge alle origini, ma anche il completamento della replica, che si verifica dove si incontrano le forcelle replica richiede fedele trasmissione dell'informazione genetica durante la proliferazione cellulare. Come l'inizio della replica, i tempi di completamento della replica variano in tutto il genoma con alcune regioni restanti non replicate anche tardi nel ciclo cellulare. Tali regioni possono essere particolarmente distante dalle origini di replicazione attiva o possono contenere sequenze o strutture di cromatina che ostacolano la polimerasi del DNA. Replica ritardata regioni possa manifestarsi come siti fragili, che sono associate con rottura cromosomica e più elevati tassi di mutazione e sono stati implicati nel cancro e invecchiamento7,8,9. Tuttavia, nonostante l'importanza del corretto completamento della replica del DNA nel mantenimento della stabilità del genoma, la nostra comprensione di come e dove questo avviene è rimasta lontano dietro quella dell'iniziazione di replica. E mentre singoli geni cui replica tarda è stata associata con la malattia sono stati studiati con, ad esempio, qPCR10globali studi rivolti a chiarire le posizioni e cause di ritardo replica sono mancati. Qui descriviamo una tecnica che ci si riferisce a come "G2 seq" in cui uniamo la citometria a flusso con sequenziamento ad alta per far luce sul completamento della replicazione del genoma in lievito11. Con modifiche minori, il presente protocollo può essere adattato a tutte le celle che possono essere ordinato flusso in base al contenuto di DNA.

<table><tbody><tr><td>YeaStar Kit DNA genomico</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro; M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>risospendere in 50 mM di citrato di sodio, pH 7,2</td></tr><tr><td>50 mM di citrato di sodio, pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di RNasi (0,25 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0,25 mg/mL di RNaseA risospesa in 50 mM di citrato di sodio, pH 7,2, far bollire la soluzione di RNasi solo per 10 minuti prima del primo utilizzo, e da quel momento in poi conservare a -20 gradi;</td></tr><tr><td>soluzione di proteinasi K (20 mg/mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>risospensione in 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50% glicerolo, conservare a -20°; C</td></tr><tr><td>Modello 50 Dismembratore Sonico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Zymo-spin III</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorimetro</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Modello LE220 Ultrasuoni focalizzati</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Kit di preparazione dei campioni</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 strumento</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; Software di allineamento GSop 2501</td><td></td></tr><tr><td></td><td>software open source / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: un'elevato throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerose tecniche sono state sviluppate per seguire l'avanzamento della replica del DNA attraverso la fase S del ciclo cellulare. La maggior parte di queste tecniche sono state dirette verso delucidazione della posizione e la tempistica di apertura di duplicazione del genoma piuttosto che il suo completamento. Tuttavia, è fondamentale che capiamo regioni del genoma che sono ultima per completare la replica, perché queste regioni soffrono i livelli elevati di rottura cromosomica e mutazione, e sono stati associati con la malattia e invecchiamento. Qui descriviamo come siamo ad una tecnica che è stata utilizzata per monitorare l'inizio di replica per invece identificare quelle regioni del genoma Ultima replica completa. Questo approccio si basa su una combinazione di citometria a flusso e sequenziamento ad alta. Anche se la relazione si concentra sull'applicazione di questa tecnica di lievito, l'approccio può essere utilizzato con tutte le celle che possono essere ordinate in un citometro a flusso in base al contenuto di DNA.

Abbiamo utilizzato la procedura descritta sopra per identificare siti tardi replicanti in lievito. Questo approccio utilizzando una regione conosciuta di replicante tardiva su un cromosoma artificiale di test hanno dimostrato che la tecnica per essere precisi e affidabili. I nostri risultati hanno dimostrato anche l'importanza biologica di tempestivo completamento della replica mostrando che una tardiva replicante regione sul cromosoma 7, che abbiamo identificato come fine la replica in b...

Descriviamo una tecnica per combinare la citometria a flusso e sequenziamento ad alta per identificare regioni tarda replicazione del genoma.

G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

L'obiettivo generale di questa procedura per il sequenziamento profondo del DNA da cellule precedentemente separate mediante citometria a flusso in base alla fase del ciclo cellulare è identificare le regioni del genoma che si replicano in modo estremamente tardivo durante il ciclo cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della replicazione del DNA, come ad esempio quali regioni del genoma incontrano difficoltà a completare la replicazione del DNA e risultano quindi particolarmente vulnerabili a riarrangiamenti genomici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, nonostante sia molto semplice dal punto di vista sperimentale, fornisce una visione sorprendentemente dettagliata della dinamica della replicazione genomica.Per iniziare, inoculare provette da 15 millilitri contenenti otto millilitri di YEPD con cellule di lievito di interesse. È accettabile utilizzare un mezzo sintetico o ricco. Coltivare le cellule per tutta la notte per almeno 12 ore per raccoglierle durante la loro effettiva distribuzione nella fase logaritmica.Il giorno seguente, quando le colture hanno una densità di cinque-quindici milioni di cellule per millilitro

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G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

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