G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma
22 marzo 2018
Descriviamo una tecnica per combinare la citometria a flusso e sequenziamento ad alta per identificare regioni tarda replicazione del genoma.
L'obiettivo generale di questa procedura per il sequenziamento profondo del DNA da cellule precedentemente separate mediante citometria a flusso in base alla fase del ciclo cellulare è identificare le regioni del genoma che si replicano in modo estremamente tardivo durante il ciclo cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della replicazione del DNA, come ad esempio quali regioni del genoma incontrano difficoltà a completare la replicazione del DNA e risultano quindi particolarmente vulnerabili a riarrangiamenti genomici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, nonostante sia molto semplice dal punto di vista sperimentale, fornisce una visione sorprendentemente dettagliata della dinamica della replicazione genomica.
Per iniziare, inoculare provette da 15 millilitri contenenti otto millilitri di YEPD con cellule di lievito di interesse. È accettabile utilizzare un mezzo sintetico o ricco. Coltivare le cellule per tutta la notte per almeno 12 ore per raccoglierle durante la loro effettiva distribuzione nella fase logaritmica.
Il giorno seguente, quando le colture hanno una densità di cinque-quindici milioni di cellule per millilitro, centrifugare le cellule e risospendere in 1,5 millilitri di etanolo al 70%. Trasferire quindi la sospensione in una provetta microcentrifuga da 1,6 millilitro e lasciare incubare le cellule a temperatura ambiente per un'ora o per almeno tre ore sul ghiaccio. Dopo l'inoculo, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere in un millilitro di citrato di sodio.
Infine, sottoporre brevemente le cellule a sonicazione due volte. Quindi ripetere il ciclo di centrifugazione e risospendere il lievito in un millilitro di citrato di sodio contenente RNasi. Lasciare che la RNasi reagisca con il lievito a 50 gradi Celsius per un'ora o tutta la notte a 37 gradi Celsius in un blocco termoregolato o in un bagno d'acqua.
Dopo il trattamento con RNasi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di proteinasi K alla miscela e proseguire la reazione per un'ora a 50 gradi Celsius. Quindi centrifugare le cellule e risospendere le cellule in un millilitro di citrato di sodio. Successivamente, centrifugare le cellule ed eliminare il soprannatante mediante aspirazione con vuoto.
Quindi, in luce fioca, risospendere le cellule in un millilitro di citrato di sodio con colorante verde per gli acidi nucleici. Incubare ora il lievito al buio per un'ora a temperatura ambiente. Per procedere, contare le cellule utilizzando un citometro a flusso con dati di emissione a 530 nanometri.
Separarli in base al loro contenuto di DNA nelle diverse fasi del ciclo cellulare: G1, S, G2 precoce e G2 tardiva. Raccogliere almeno 1,6 milioni di cellule aploidi da ciascuna fase. Immediatamente dopo il sorting, centrifugare le cellule per 20 minuti. Aspirare il soprannatante e congelare il pellet a meno 20 gradi Celsius per la conservazione.
Abbiamo scoperto che il passaggio singolarmente più critico per questa procedura consiste semplicemente nel centrifugare immediatamente le cellule dopo il loro recupero, al massimo un'ora dopo il sorting. Questa estrazione si basa su un kit per l'estrazione del DNA genomico da lievito. Iniziare aggiungendo 120 microlitri di buffer di digestione e cinque microlitri di enzima litico per lieviti.
Quindi omogeneizzare le cellule nel mix di reazione utilizzando un vortex e incubare il mix a 37 gradi Celsius per 40-60 minuti. Successivamente, aggiungere 120 microlitri di buffer di lisi e vortexare il mix ad alta velocità per 10-20 secondi. Poi aggiungere 250 microlitri di cloroformio e mescolare accuratamente il contenuto del tubo per un minuto.
Successivamente, centrifugare il tubo alla velocità massima per due minuti. Trasferire quindi il soprannatante sulla colonna di legame del DNA. Far passare il soprannatante attraverso la colonna mediante una centrifugazione alla velocità massima della durata di un minuto.
Per lavare il DNA sulla membrana della colonna, trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta e aggiungere 300 microlitri di buffer per il lavaggio del DNA. Quindi ripetere la centrifugazione alla velocità massima per un minuto. Ripetere questo passaggio di lavaggio un'altra volta.
Per raccogliere il DNA, trasferire la colonna di centrifugazione in una provetta pulita. Aggiungere 60 microlitri di acqua e attendere da uno a tre minuti. Quindi centrifugare la colonna alla velocità massima per 10 secondi per isolare l'acqua contenente il DNA eluito.
Ora aggiungere da cinque a 195 microlitri di tampone per DNA a doppio filamento ad alta sensibilità contenente il reagente in concentrazione 1:200. Successivamente, misurare la fluorescenza del campione per calcolare il rendimento. Ci si aspetta di ottenere da 10 a 50 nanogrammi di DNA.
Ora utilizzare la sonificazione per frammentare il DNA in pezzi compresi tra 250 e 350 paia di basi. Successivamente, utilizzare un kit standard per preparare una libreria di DNA e sequenziarla mediante almeno 10 milioni di letture single-end di 50 paia di basi. La procedura descritta è stata utilizzata per identificare siti di replicazione tardiva nel lievito in gemmazione.
Le cellule normali sono state confrontate con quelle prive di Sir2, una proteina deacetilasi. I dati grezzi presentavano picchi elevati, principalmente dovuti alla presenza di elementi TY. Tali picchi sono stati rimossi limitando le profondità di lettura a 2,5 volte la profondità mediana di lettura per ciascun campione.
I dati depurati dagli spike sono stati successivamente lisciati mediante una finestra scorrevole di 20 kb. Infine, i dati sono stati normalizzati e rappresentati come rapporti rispetto ai livelli in G1. Una cellula completamente non replicata apparirebbe a 0,5, mentre una cellula completamente replicata apparirebbe a uno. In questi dati provenienti dal cromosoma sette, si osservava evidenza di una regione nota per replicarsi in fase tardiva nel mutante Sir2.
Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare quelle regioni del genoma che completano per ultime la replicazione del DNA e che sono quindi particolarmente vulnerabili a rotture del DNA e ad altri problemi associati alla replicazione tardiva.
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Panoramica
Questo articolo descrive una tecnica che combina la citometria a flusso e il sequenziamento ad alto rendimento per identificare le regioni del genoma che si replicano in fase tardiva. Questo metodo fornisce informazioni sulle dinamiche della replicazione genomica e contribuisce a rispondere a domande fondamentali nel campo della replicazione del DNA.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Genomica
- Analisi del ciclo cellulare
- Replicazione del DNA
Sfondo
- Comprendere le regioni del genoma che si replicano in fase tardiva è fondamentale per lo studio della replicazione del DNA.
- Queste regioni potrebbero essere vulnerabili a riarrangiamenti genomici.
- Il sorting tramite flusso consente l'isolamento di cellule in base alla loro fase del ciclo cellulare.
- Il sequenziamento ad alto rendimento fornisce una visione completa della dinamica genomica.
Scopo dello studio
- Identificare le regioni del genoma che si replicano in una fase tardiva del ciclo cellulare.
- Esplorare le implicazioni di una replicazione incompleta del DNA.
- Migliorare la comprensione della stabilità genomica e delle riarrangiamenti.
Metodi Utilizzati
- Citometria a flusso per ordinare le cellule in base alla fase del ciclo cellulare.
- Sequenziamento profondo del DNA da cellule ordinate.
- Coltura di cellule di lievito in mezzo YEPD.
- Incubazione notturna per ottenere una distribuzione in fase logaritmica.
Risultati principali
- La tecnica rivela una visione dettagliata della dinamica della replicazione genomica.
- Le regioni identificate come tardivamente replicanti possono indicare aree soggette a instabilità.
- Un disegno sperimentale semplice fornisce informazioni significative.
- Fornisce un quadro di riferimento per ulteriori ricerche sulla replicazione del DNA.
Conclusioni
- Questo metodo è efficace per lo studio della replicazione tardiva nel genoma.
- Può contribuire a identificare vulnerabilità nella replicazione del DNA.
- L'approccio è accessibile e informativo per i ricercatori del settore.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione delle regioni genomiche a replicazione tardiva fornisce informazioni fondamentali sull'instabilità cromosomica, un fattore chiave nell'oncogenesi e nelle patologie legate all'invecchiamento. Questa tecnica consente il rilevamento precoce di regioni genomiche soggette a rottura e mutazione, supportando la validazione degli obiettivi nei percorsi di risposta al danno del DNA. Collegando i tempi di replicazione alla vulnerabilità funzionale, essa aumenta l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici del mantenimento del genoma.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei tempi di replicazione come biomarcatore dell'instabilità genomica in modelli di malattia.
- Valore operativo: Combina la citometria a flusso con il sequenziamento per isolare e analizzare popolazioni di DNA specifiche per fase.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili quantitativi e genomici del tempo di replicazione per analisi comparative.
- Valore operativo: Un flusso di lavoro standardizzato basato sul sorting del contenuto di DNA e sulla preparazione di librerie favorisce la riproducibilità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Rivela regioni con tassi elevati di rottura e mutazione, fornendo informazioni per ridurre i rischi meccanicistici relativi agli obiettivi di stabilità genomica.
- Valore operativo: Consente il confronto tra ceppi wild-type e mutanti (ad esempio, Sir2) per valutare i modificatori genetici del timing di replicazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase iniziale della scoperta fornendo dati genomici funzionali che orientano la selezione del target e l'analisi dei percorsi metabolici prima dell'identificazione del capostazione.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sugli effetti dei tempi di replicazione nella stabilità genomica e nell'integrità cromosomica.
- Screening: Fornisce dati di sequenziamento normalizzati e corretti per gli spike, che consentono il confronto quantitativo del completamento della replicazione tra diverse condizioni.
- Analisi: Utilizza una media mobile con finestra scorrevole e rapporti normalizzati al G1 per produrre mappe dei tempi di replicazione facilmente interpretabili.
- Ricerca Translazionale: Collega la replicazione tardiva a esiti fenotipici come rottura e mutazione, sostenendo la rilevanza traslazionale come biomarcatore.
- Riutilizzo Aziendale: Adattabile a qualsiasi tipo cellulare separabile mediante sorting a flusso, consentendo applicazioni trasversali in sistemi di mammiferi o lieviti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nell'identificazione di loci genomici meccanicamente vulnerabili.
- Valore operativo: Flusso di lavoro standardizzato e scalabile, dal sorting cellulare alla preparazione della libreria per sequenziamento.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti evidenziando i bersagli associati allo stress e all'instabilità replicativa.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio dei bersagli del mantenimento del genoma in base alla vulnerabilità del timing replicativo.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze in citometria a flusso, estrazione di acidi nucleici e preparazione di librerie per sequenziamento di nuova generazione.
- Strumentazione per il sorting cellulare, sonificazione e piattaforme di sequenziamento ad alto rendimento.
- Standardizzazione della rimozione degli spike (limitazione della profondità di lettura) e dei parametri di smoothing tra i campioni.
- Considerazioni adattative per dimensioni genomiche e tipi cellulari diversi dal lievito.
- Limitazione pratica: richiede un numero sufficiente di cellule (1,6 milioni per fase) e un'accurata tempistica dopo il sorting per prevenire il degrado.
