G2-seq: Un'elevato Throughput sequenziamento-base tecnica per identificare replica ritardata regioni del genoma

L'obiettivo generale di questa procedura per il sequenziamento profondo del DNA da cellule che sono state ordinate in base alla fase del ciclo cellulare è identificare le regioni del genoma che si replicano estremamente tardi nel ciclo cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della replicazione del DNA, come ad esempio quali regioni del genoma hanno difficoltà a completare la replicazione del DNA e sono quindi particolarmente vulnerabili ai riarrangiamenti del genoma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, anche se è molto semplice da un punto di vista sperimentale, fornisce una visione sorprendentemente ricca delle dinamiche della replicazione genomica.

Per iniziare, inoculare provette da 15 millilitri contenenti otto millilitri di YEPD con cellule di lievito di interesse. È accettabile un mezzo sintetico o ricco. Coltivare le cellule durante la notte per almeno 12 ore per raccoglierle durante la loro distribuzione in fase logaritmica reale.

Il giorno seguente, quando le colture hanno una densità compresa tra cinque e 15 milioni di cellule per millilitro, centrifugare le cellule e risospenderle in 1,5 millilitri di etanolo al 70%. Quindi trasferire la sospensione in una provetta per microfuge da 1,6 millilitri e lasciare incubare le cellule a temperatura ambiente per un'ora o per almeno tre ore su ghiaccio. Dopo l'inoculazione, centrifugare le cellule e risospenderle in un millilitro di citrato di sodio.

Infine, sonicare brevemente le celle due volte. Ripetere quindi il ciclo di centrifugazione e risospendere il lievito in un millilitro di citrato di sodio contenente RNasi. Lasciare che la RNasi reagisca con il lievito a 50 gradi Celsius per un'ora o durante la notte a 37 gradi Celsius in un blocco di calore o in un bagno d'acqua.

Dopo il trattamento con RNasi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di proteinasi K alla miscela e continuare la reazione per un'ora a 50 gradi Celsius. Quindi centrifugare le cellule e risospendere le cellule in un millilitro di citrato di sodio. Successivamente, centrifugare le cellule e aspirare il surnatante utilizzando il vuoto.

Quindi, in penombra, risospendere le cellule in un millilitro di citrato di sodio con colorazione di acido nucleico verde. Ora incubare nel lievito al buio per un'ora a temperatura ambiente. Per procedere, contare le cellule utilizzando un selezionatore di celle utilizzando dati di emissione a 530 nanometri.

Ordinali in base al loro contenuto di DNA nelle fasi del ciclo cellulare, G1 S, G2 precoce e G2 tardivo. Raccogli almeno 1,6 milioni di cellule aploidi da ogni fase. Subito dopo aver ordinato le cellule, centrifugarle per 20 minuti. Aspirare il surnatante e congelare il pellet a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per la conservazione.

Abbiamo scoperto che il passaggio più critico per questa procedura consiste semplicemente nel far girare le cellule subito dopo averle raccolte, un'ora al massimo dopo la cernita. Questa estrazione si basa su un kit di estrazione del DNA genomico del lievito. Inizia aggiungendo 120 microlitri di tampone per la digestione e cinque microlitri di enzima litico per lievito.

Quindi frullare le cellule nella miscela di reazione usando un vortice e incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 40-60 minuti. Successivamente, aggiungere 120 microlitri di tampone di lisi e agitare la miscela ad alta velocità per 10-20 secondi. Quindi aggiungere 250 microlitri di cloroformio e per un minuto mescolare accuratamente il contenuto del tubo.

Quindi, fai girare il tubo alla massima velocità per due minuti. Quindi trasferire il surnatante sulla colonna di legame del DNA. Far girare il surnatante attraverso la colonna utilizzando un ciclo di centrifugazione a velocità massima di un minuto.

Per lavare il DNA sulla membrana della colonna, trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta e applicare 300 microlitri di tampone di lavaggio del DNA. Ripetere quindi la centrifugazione alla massima velocità per un minuto. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta.

Per raccogliere il DNA, trasferire la colonna di centrifuga in una nuova provetta. Aggiungere 60 microlitri di acqua e attendere da uno a tre minuti. Quindi centrifugare la colonna alla massima velocità per 10 secondi per isolare l'acqua contenente il DNA eluito.

Ora aggiungi tra i cinque e i 195 microlitri di tampone ad alta sensibilità per DNA a doppio filamento contenente reagente a una concentrazione da uno a 200. Quindi misurare la fluorescenza del campione per calcolare la resa. Aspettatevi di raccogliere tra i 10 e i 50 nanogrammi di DNA.

Ora usa la sonicazione per rompere il DNA in frammenti che sono tra le 250 e le 350 coppie di basi. Quindi utilizzare un kit standard per preparare una libreria di DNA e sequenziarla utilizzando almeno 10 milioni di letture single-end da 50 coppie di basi. La procedura descritta è stata utilizzata per identificare i siti di replicazione tardiva nel lievito in gemmazione.

Le cellule normali sono state confrontate con quelle prive di Sir2, una proteina deacetilasi. I dati grezzi contenevano grandi picchi principalmente dovuti alla presenza di elementi TY. Questi picchi sono stati rimossi limitando le profondità di lettura a 2,5 volte la profondità rossa mediana per ciascun campione.

I dati eliminati sono stati quindi smussati con una finestra scorrevole di 20 kb. Infine, i dati sono stati normalizzati e tracciati come rapporti con i livelli in G1. Una cellula completamente non replicata apparirebbe a 0,5 e una cellula completamente replicata apparirebbe a uno. In questi dati del cromosoma sette, c'era evidenza di una nota regione di replicazione tardiva nel mutante Sir2.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare quelle regioni del genoma che sono le ultime a completare la replicazione del DNA e che sono quindi particolarmente vulnerabili alle rotture del DNA e ad altri problemi associati alla replicazione tardiva.