Name: Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Scopri come quantificare la trasmigrazione dei monociti e la formazione delle cellule della gomma piuma in campioni clinici umani. Questo metodo permette di valutare il potenziale aterogenico e identificare individui a rischio di malattie cardiovascolari acute.

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Gli autori riconoscono con gratitudine l'opera del professor William Muller e Dr. Clare Westhorpe per il loro ruolo chiave nello sviluppo di precedenti iterazioni di questo modello. Gli autori inoltre vorrei ringraziare il nucleo AMREP citometria a flusso per lo smistamento dei monociti sottoinsiemi e l'Alfred Hospital infettiva malattia unità cliniche infermieri per l'assunzione di persone HIV + per alcuni studi di ricerca. Gli autori riconoscono con gratitudine il contributo a questo lavoro del Victoria programma operativo di infrastruttura di supporto ricevuto dall'Istituto Burnet. TAA è supportato da un RMIT University Vice-Cancelliere di Postdoctoral Fellowship. Quest'opera è stata sostenuta da NHMRC progetto sovvenzione 1108792 assegnato a AJ e AH. TK è supportato da NIH concede NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # UL1TR000124.

Nota: tutti gli esperimenti utilizzando campioni biologici umani sono stati eseguiti con approvazione etica dal comitato di etica umana Alfred Hospital, Melbourne. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in armadi di sicurezza biologica di classe II se non diversamente specificato. " Prewarmed " si riferisce ai reagenti riscaldati a 37 ° C in bagnomaria.
 1. preparazione di tipo I gel del collagene fibroso: giorno 1 <ol><li>preparare polimerizzato il gel del collagene in sequenza aggiungendo e miscelazione 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, acido acetico 4,58 mM e 1,71 mg/mL di collagene fibroso tipo I in un polistirolo da 5 mL tubo come da tabella 1. 
	Nota: Assicurarsi che il collagene sia ben mescolato pipettando delicatamente su e giù per 5 volte al fine di evitare la formazione di collagene ' tasche ' nella miscela di gel. Preparare 4-6 gel per condizione di test per microscopia o 15 gel per condizione di test per citometria a flusso.</li>
	<li>Bene una volta misto, aliquotare 50 µ l di miscela di gel di collagene in ciascun pozzetto di una piastra di coltura di tessuto 96 pozzetti a fondo piatto sterile. Non utilizzare le righe e le colonne esterne, ma riempire questi con 200 µ l di 1 x Dubecco ' tampone s fosfato (PBS) per proteggere i gel da dissecazione. Incubare le piastre a 37 °C/5% CO 2 per 2 h consentire il collagene polimerizzare. 
	Nota: Posizionare le piastre direttamente sul metallo pulito rack nell'incubatrice per garantire la distribuzione uniforme del calore.</li>
	<li>a seguito di incubazione, sovrapporre i gel con 150 µ l di 1 x M199 completati (Vedi Tabella materiali) e incubare per 5 giorni fino a uso.</li>
</ol> 2. Espansione di Stored HUVEC: giorno 1 <ol><li>etichetta cappotto un diametro di 10 cm di Petri con 1 mL di 50 µ g/mL fibronectina diluiti in 1X PBS e incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	Cellule endoteliali (HUVEC, 1.0 x 10 6 cellule) in 10 mL di M20 della vena <li>disgelo aliquote del cordone ombelicale umano primario crioconservati. 
	Nota: HUVEC dovrebbe essere preparato come descritto in precedenza 21 e utilizzato in un numero di passaggio basso (&lt; passaggio 4). HUVEC può essere sostituito con le cellule endoteliali umane dell'arteria coronaria qui.</li>
	<li>Risospendere HUVEC in 10ml M20 e aggiungere al piatto rivestito fibronectina, aspirando fibronectin in eccesso prima dell'aggiunta delle cellule e la cultura di confluenza (circa 5 giorni), sostituendo i media il giorno 3.</li>
</ol> 3. Coltura di HUVEC monostrato sui gel di collagene: giorno 5 <ol><li>il giorno 5, staccare HUVEC aspirare il surnatante da di Petri cultura e lavando via contenenti siero media con 10 mL di siero M199.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL 0.05% tripsina/0.53 EDTA in M199 HUVEC e incubare per 1-2 min a temperatura ambiente, agitando delicatamente fino a quando le cellule staccano.</li>
	<li>Una volta staccata, rapidamente sciacquare Petri con 5ml M20 e trasferire i file multimediali contenenti cellule in una provetta 10 mL.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 200 µ l di M20, contare le celle utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Risospendere le cellule a 2,0 x 10 5 cellule/mL in M20, aspirare il M199 sui gel dalla piastra a 96 pozzetti (punto 1.3) e aggiungere 100 µ l di sedimento HUVEC (2.0 x 10 4 celle) per ogni gel di collagene preparato in precedenza (punto 1.2). Piastre della coltura per 3 giorni a 37 °C/5% CO 2. 
	Nota: L'integrità dello strato monomolecolare HUVEC può essere confermata dopo 3 giorni di nitrato d'argento che macchia 22 o immunohistochemistry per giunzione stretta proteine 23 in questa fase. Ulteriori gel deve essere preparato per questo scopo.</li>
</ol> 4. Attivazione di HUVEC monostrato e isolamento/attivazione dei monociti per trasmigrazione: giorno 8 <ol><li>il giorno 8, attivare ciascun monostrato HUVEC prima dell'aggiunta dei monociti aspirando il M20 media sovrapponendo i gel e aggiungendo 100 µ l di 10 ng/mL TNFα umano in M20 per gel. Incubare a 37 °C/5% CO 2 per 4 h. 
	Nota: Condizioni Non attivato HUVEC possono anche essere incluse se necessario come controlli.</li>
	<li>Durante il 4 h HUVEC attivazione passo, isolata monociti da PBMCs utilizzando magnetica del branello tecniche per selezionare negativamente per celle secondo il produttore ' s istruzioni. Un minimo di 6,5 x 10 6 PBMCs dovrebbe essere usato in questa fase, al fine di ripristinare in modo affidabile 3.0 x 10 5 monociti, necessari per una condizione, come monociti in genere rappresentano circa il 10-15% di PBMCs. 
	Nota: Per valutare l'effetto dell'attivazione del monocito prima della formazione delle cellule del monocito della trasmigrazione e schiuma, monociti possono essere attivati in questa fase. Monociti possono essere isolati da PBMCs scongelati se necessario (cioè, campioni memorizzati). Sottoinsiemi di monociti isolati mediante FACS ordinamento possono essere preparati per l'aggiunta di gel (Figura 1).</li>
</ol> 5. Trasmigrazione dei monociti umani primari: giorno 8 <ol><li>per misurare la trasmigrazione del monocito, rimuovere i supporti contenenti TNFα e lavare gel due volte con 100 µ l M199 aggiungendo e rimuovendo i media. Dopo il lavaggio, aggiungere 2,0 x 10 5 appena isolato o scongelati e lavato crioconservati PBMCs o 5.0 x 10 4 appena isolato monociti o purificata sottoinsiemi del monocito di monostrati HUVEC in 100 µ l M20. Incubare per 1 h a 37 ° C e 5% di CO 2 per consentire la trasmigrazione in avanti dei monociti nel gel. Si consiglia di lasciare 6 pozzetti per ogni condizione sperimentale esaminati. 
	Nota: Per valutare l'effetto del siero autologo sulla formazione delle cellule della trasmigrazione e schiuma, incubare le cellule con M20 contenente la concentrazione di siero inattivato con calore donatore e confrontare le condizioni con un controllo di pool di siero umano. Leucociti diverso da monociti possono essere aggiunti in questa fase. Se studiando l'impatto di specifici lipidi lipidi specie (ad es., HDL, oxHDL), è possibile eseguire tutti i passaggi seguenti con supporto privo di siero contenente lipidi di 20-50 µ g/mL.</li>
	<li>Dopo 1 h di trasmigrazione in avanti, raccogliere le cellule non-trasmigrato lavando gel due volte con 100 µ l di preriscaldati 1 mM EGTA in PBS 1X e una volta con 100 µ l M199 (stesso centrifugare condizioni), pool i surnatanti da ogni pozzetto dello stesso condizione sperimentale (solitamente 6 pozzi) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio. Centrifugare le cellule non-trasmigrate a 4 ° C, 300 x g per 5 min e risospendere in 30 µ l di PBS 1x 1.</li>
	<li>Contare le cellule raccolte nel surnatante per determinare il numero di cellule transmigrated avanti.</li>
	<li>La percentuale di cellule transmigrated avanti è determinato come segue: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq3.jpg"></li> <li>coprire il lavato gel contenenti cellule transmigrated con 100 µ l M20 e incubare per un ulteriore 48 h.</li>
	<li>Dopo 48 h, raccogliere il surnatante e lavare le cellule non-trasmigrato due volte con 100 µ l preriscaldata 1 mM EGTA/PBS, raccolta e messa in comune il surnatante da ogni condizione come descritto al punto 5.2. 
	Nota: Il fenotipo delle cellule di transmigrated inversione può essere testato su queste cellule fcitometria a flusso standard di OPO che macchia i protocolli.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 4 ° C, 300 x g per 5 min e risospendere le cellule in 30 µ l 1X PBS. Contare le celle e determinare la fattibilità tramite colorazione blu di trypan.</li>
	<li>Determinare la percentuale di cellule transmigrated inversione utilizzando la seguente equazione: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq4.jpg"> Nota: contabilità per il numero totale di cellule transmigrated avanti dà un'indicazione più precisa della trasmigrazione inversa come è improbabile trasmigrazione in avanti sarà 100%.</li>
	<li>Per analisi di microscopia, i gel di fix aggiungendo 100 µ l 2% formaldeide (concentrazione finale) in ciascun pozzetto, coprire le piastre in alluminio della stagnola e conservare a 4 ° C fino all'analisi. Per citometria a flusso, non fissare le cellule in questa fase. Vedi i protocolli sotto per microscopia (sezione 6) o l'analisi di flusso cytometry (sezione 7). 
	Attenzione: La formaldeide è tossica e corrosiva; utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE). Cura dovrebbe essere presa quando l'aggiunta di formaldeide, tuttavia, questo passaggio non deve necessariamente essere eseguita in una cappa a causa della bassa concentrazione usata.</li>
</ol> 6. Quantificazione delle cellule della gomma piuma e macrofagi di microscopia (macchia di olio-rosso O) <ol><li>rimuovere la formaldeide e lavare i gel con 100 µ l di metanolo al 50% (v/v) per 5 min e poi 100 µ l 78% (v/v) metanolo per 15 min. 
	Nota: La procedura di colorazione può essere eseguita sul banco di laboratorio e non in un armadietto di Biohazard di classe II.</li>
	<li>Macchia per le goccioline del lipido aggiungendo 100 µ l di preparati 0,2% (w/v) O olio-rosso (per dettagli, vedere Tabella materiali) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovi macchie in eccesso lavando i gel 4 volte con 100 µ l del 78% (v/v) metanolo, aspirare e scartare il supernatante dopo ogni wash.</li>
	<li>Colorante di contrasto per 15 min a temperatura ambiente con 100 µ l di Giemsa, diluito 01:10 in acqua distillata.</li>
	<li>Aspirare la colorazione di Giemsa e lavare gel una volta con acqua.</li>
	<li>Per rimuovere il gel dalla piastra, cerchio pozzi usando un ago 21G, con lo smusso rivolto verso l'esterno, intorno al bordo del gel.</li>
	<li>Per montare il gel su un vetrino da microscopio, perforare due fori (diametro 6,35 mm) in una striscia di 2,54 cm x 1,5 cm di nastro biadesivo. Difficoltà il nastro a un lato di microscopio standard e rimuovere il rivestimento protettivo dall'alto.
	<ol><li>Aggiungi una goccia d'acqua nei buchi il nastro utilizzando una pipetta di trasferimento. Delicatamente con una pinzetta, trasferire gel nei buchi il nastro e coprire con un vetrino coprioggetto di dimensioni vetro 1,5. Premere delicatamente il vetrino coprioggetti per aderire al nastro.</li>
	</ol></li> <li>Esaminare con microscopia di campo chiaro contrasto differenziale di interferenza con obiettivo 40x su un microscopio invertito.
	<ol><li>Portare il monostrato HUVEC a fuoco alle 40 X ingrandimento e scorrimento ' in ' il gel, contando le cellule macrofagi/schiuma per tutta la profondità del gel. Ripetere per tre distinti campi di vista situato a simili distanze dal bordo del gel al fine di ridurre al minimo i possibili effetti di bordo. In tal modo gel profondità è coerente tra regioni di conteggio. 
		Nota: Punteggio ottenuto cellule nel gel sia come cellule della gomma piuma (definito come cellule contenenti &gt; 1/3 del loro citoplasma come olio-rosso O macchiato le goccioline del lipido) o i macrofagi all'interno di 2 h di montaggio su diapositive ( Figura 2). Formazione di schiuma delle cellule è espresso come la percentuale di cellule della schiuma rispetto al numero totale di cellule migrate e viene espresso come conteggi mediani in 3 campi di vista esaminato per 6 gel per condizione, pertanto una mediana di 18 misurazioni per ogni condizione. Nella tabella 2 è riportato un esempio dell'emocromo crudo da un tipico esperimento. 
		Nota: Classificare una cella come un macrofago di vs cella di schiuma da microscopia è soggettivo e di conseguenza può essere investigatore-dipendente. Negli studi clinici, dove gli esperimenti vengono eseguiti per un periodo prolungato di tempo, è importante per il conteggio di tutti deve essere eseguita accecato da un singolo ricercatore. Vengono forniti esempi di cellule della gomma piuma e macrofagi in gel nella Figura 2.</li>
	</ol></li></ol> 7. Analisi delle cellule di Transmigrated dal flusso Cytometry <ol><li>a fenotipico caratterizzano le cellule della gomma piuma e macrofagi dopo migrazione transendoteliale, digerire i gel aggiungendo 100 µ l di collagenasi di 37 ° C preriscaldato 1 mg/mL diluito in M199 a D ciascun pozzetto ed incubare per 20 min a 37 °C/5% CO 2. 
	Nota: Posizionare le piastre da 96 pozzetti direttamente su scaffali di metallo pulito nell'incubatrice per garantire la distribuzione uniforme del calore.</li>
	<li>a seguito di incubazione, macerare il gel utilizzando una punta di pipetta 200 µ l e incubare per un ulteriore 20 min a 37 °C/5% CO 2.</li>
	<li>Una volta completamente digerito, i gel di replicare digeriti attraverso 35 µm in nylon mesh provette FACS con tappi posti su ghiaccio, filtro e piscina e lavata una volta con FACS lavare (Vedi tabella materiali) a 4 ° C, 300 x g. Risospendere le cellule in 100 µ l di FACS nello stato di Washington</li>
	<li>Incubare le cellule risultanti con anticorpi coniugati fluorophore specifici per CD45, un indicatore delle cellule vive/morte e superficie/intracellulare marcatori fenotipici o funzionali di interesse utilizzando protocolli di cytometry di flusso standard. 
	Nota: Preparare controllo tubi per compensazione utilizzando l'appropriato fluorofori e Ig compensazione perline. Estratti di cellule possono anche essere raccolte su vetrini per microscopia di immunofluorescenza di cytospinning. In alternativa, abbiamo raccolto con successo cellule usando questo protocollo per la valutazione tramite imaging citometria a flusso.</li>
	<li>Acquisire celle utilizzando un citometro a flusso ed eseguire la compensazione come richiesto. 
	Nota: Come le cellule della gomma piuma/macrofagi non possono formare singole popolazioni utilizzando le proprietà di dispersione della luce e possono differire notevolmente in dimensioni e forma, impostare liberale forward scatter (FSC) e cancelli laterali scatter (SSC) al fine di catturare tutte le cellule migrate come illustrato &lt; forte classe = "xfig" &gt; figura 3A.</li>
	<li>a seguito di acquisizione, eseguire l'analisi di dati utilizzando il software di citometria a flusso. Per identificare cellule migrate, prima selezionare le celle come negativo per il marcatore di live/dead come mostrato nella Figura 3B. Successivamente, eseguire una cella singola discriminazione creando un cancello stretto intorno alle cellule mostrato su un terreno di vs SSC-altezza SSC-area.</li>
	<li>Selezionare CD45 + cellule e cancello la popolazione maggiore di cellule migrate presente in un plot FSC/SSC come queste sono le cellule macrofagi/schiuma.</li>
</ol>

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<li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HIV-1+infection+in+vitro+on+transendothelial+migration+by+monocytes+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages.</a> J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).</li>
<li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).</li>
<li>Müller, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Endothelial+Markers+PECAM-1%2C+vWf%2C+and+CD34+in+Vivo+and+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro.</a> Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).</li>
<li>Kelesidis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+impaired+HDL+function+in+HIV-1+infected+compared+to+uninfected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acquir.+Immune+Defic.+Syndr%22%5BJournal%5D)">Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li>
<li>Gacka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+and+atherogenic+activity+of+monocytes+in+Type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Complications%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes.</a> J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B%2BCD16%2B+monocytes+and+cardiovascular+outcome+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease.</a> Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto qui offre un metodo versatile e fisiologicamente rilevante per valutare il atherogenicity dei monociti da coorti cliniche umane, combinando sia trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma. Questo modello offre vantaggi rispetto ai metodi alternativi di formazione delle cellule della gomma piuma in quanto prende in considerazione l'effetto della trasmigrazione del monocito su formazione delle cellule della gomma piuma e consente la misurazione di trasmigrazione inversa<...

Trasmigrazione del monocito è un passo cruciale nello sviluppo della placca aterosclerotica che può portare a trombosi, ictus e infarto miocardico. Le placche aterosclerotiche si sviluppano da strisce grasse, generalmente presente nei siti di flusso sanguigno oscillatorio basso in mezzo alle grandi arterie, dove depositato lipidica contribuisce all'attivazione endoteliale e localizzata infiammazione1. I monociti sono reclutati alle cellule endoteliali in strisce grasse tramite proteine chemiotattica del monocito (ad esempio CCL2) e trasmigrano nei intima2. A seguito di trasmigrazione, monociti possono formare i macrofagi atherogenic, lipido-carichi, chiamati cellule della schiuma in conseguenza l'assorbimento del lipido, sintesi del lipido, down-regulation di efflusso di colesterolo o una combinazione di fattori di cui sopra. I monociti possono anche accumulare lipidi nella circolazione e hanno un fenotipo 'schiumoso', possibilmente che predispongono le cellule per schiuma cellulare formazione3,4. Cellule della gomma piuma sono la caratteristica distintiva delle strisce grasse e placche aterosclerotiche fase iniziale e la loro formazione è influenzata da mediatori infiammatori5e del lipido. In alternativa, i monociti hanno la capacità di invertire trasmigrano dall'arteria nella circolazione sanguigna6, eliminando dei lipidi dalla biancheria intima e di agire per mantenere la salute dell'arteria.
Determinare la propensione dei monociti ad trasmigrano attraverso endotelio arterioso e formare cellule di schiuma nel intima o invertire trasmigrano e trasportano lipidi fuori la placca, sono un requisito fondamentale per comprendere il ruolo dell'attivazione del monocito in aumento rischio aterosclerotico. Modelli murini di CADs quali aterosclerosi sono importanti nel delucidamento in tempo reale in vivo informazioni sullo sviluppo di fatty streak/aterosclerotica della placca. Tuttavia, questi modelli richiedono un'alterazione genetica del colesterolo naturale abilità di questi animali solitamente accoppiati con drastiche modifiche nella dieta (ad esempio il modello di dieta di ApoE-/-Western-tipo)7,8, quindi, di elaborazione induzione non fisiologico accumulo di lipidi di circolazione livelli quali lo sviluppo della placca di unità. Questi modelli possono avere limitate rilevanza a condizioni umane infiammatorie croniche quali l'infezione da HIV che non sono associate con aumentato di circolazione colesterolo o livelli di lipoproteina a bassa densità (LDL). Inoltre, le differenze nella biologia del monocito tra esseri umani e topi fanno il test immunologico domande per quanto riguarda la pertinenza delle sottopopolazioni dei monociti (ad esempio intermedi monociti (CD14 ++CD16+))9 difficile. Questo è importante quando si studia i meccanismi che guidano la malattia cardiovascolare come intermedio del monocito conteggi predicono indipendente eventi cardiovascolari10,11. Mentre le analisi esistono per misurare in modo sequenziale o formazione di cellule monocito trasmigrazione o schiuma in isolamento, nessun test in vitro è stato convalidato per quantificare sia gli aspetti di atherogenesis iniziale utilizzando le stesse cellule da coorti cliniche. Transwell modelli utilizzano un sistema a doppia camera Boyden modificato per cui le cellule vengono caricati in camera superiore e trasmigrano attraverso una barriera di plastica porosa o monostrato di cellule in un alloggiamento più basso che in genere contiene supporto con chemoattractant12 , 13. mentre ampiamente usato per l'analisi di trasmigrazione leucocitaria, questi modelli non prevedono in genere un layer che rappresenta l'intima, con conseguente transmigrated cellule migrano in soluzione e non consentono la misurazione della cella di schiuma formazione o inversa trasmigrazione delle stesse cellule. Al contrario, modelli di formazione delle cellule della gomma piuma non conto di eventuali cambiamenti indotti da trasmigrazione di monociti o degli effetti dell'attivazione endoteliale che è conosciuto per contribuire a schiuma cellulare formazione14. Inoltre, questi sistemi inducono schiuma formazione delle cellule dai macrofagi aderito a piastre per colture cellulari con l'aggiunta di saturare le concentrazioni di esogeno lipoproteina a bassa densità ossidata (oxLDL)15,16, un induttore chiave di formazione delle cellule della gomma piuma. LDL utilizzato in questi modelli è spesso ossidato da processi non fisiologicamente rilevanti come CuSO4 trattamento17, quindi, mettere in discussione l'importanza fisiologica degli studi facendo uso di questi modelli.
Qui descriviamo un'analisi che quantifica la trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma delle stesse cellule che non richiede l'aggiunta di oxLDL esogeno, così meglio modellare il ruolo dei monociti nella formazione delle cellule della gomma piuma. Questo modello è stato originariamente sviluppato dal Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18ed è stata ulteriormente perfezionato nel nostro laboratorio per valutare ex vivo il atherogenicity dei monociti isolati sotto non attivazione condizioni da individui con patologie infiammatorie che accompagna malattie come HIV infezione19 così come invecchiamento20, che sono associati con un rischio aumentato di aterosclerosi. Questo modello offre anche una piattaforma per rispondere alle domande biologiche di base per quanto riguarda la propensione dei sottoinsiemi diversi del monocito a forma schiuma cellule20, l'influenza dell'attivazione endoteliale da citochine come TNF su formazione delle cellule della gomma piuma14 e le proprietà migratori dei monociti come la profondità e velocità di trasmigrazione in gel19. Inoltre, la formazione delle cellule di trasmigrazione e schiuma di monociti può essere quantificata utilizzando la microscopia standard, cella immagini dal vivo, flusso cytometry e imaging citometria a flusso, di conseguenza, fornendo un metodo versatile per valutare il ruolo dei monociti nel atherogenesis.

<table><tbody><tr><td>Reagenti per preparazione di gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-500G</td><td>0,1 M NaOH diluito in H20</td></tr><tr><td>10x M199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td></td></tr><tr><td>AcCOOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td>20 mM Acido acetico diluito in H20</td></tr><tr><td>Cultrex Collagene Bovino I</td><td>R& D Systems</td><td>3442-050-01</td><td>Tipo I Collagene fibroso</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>Coltura cellulare</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Tecnologie di vita</td><td>11150-059</td><td>Terreni M199 contenenti sali di Earle, L-glutammina e 2,2 g/L di bicarbonato di sodio. Terreni integrati con 100 &micro; g/mL di L-glutammina&nbsp; e 100 U/mL di penicillina/streptomicina&nbsp;</td></tr><tr><td>M20</td><td></td><td></td><td>Integrato M199 contenente il 20% di siero aggregato o di donatore inattivato termicamente. Singole specie lipidiche come LDL possono essere aggiunte a M199.</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>Le cellule endoteliali primarie del cordone ombelicale umano (HUVEC) possono essere isolate da cordoni ombelicali donati con il consenso informato e l'approvazione etica. L'HUVEC isolato può anche essere acquistato in commercio.</td></tr><tr>Cellule <td></td><td></td><td>endoteliali dell'arteria coronarica umana</td><td>Le cellule endoteliali primarie dell'arteria coronaria umana possono essere isolate dalle arterie donate con il consenso informato e l'approvazione etica. Le cellule isolate possono anche essere acquistate in commercio.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BDH Merck</td><td>10093.5V</td><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-500G</td><td>Glicole etilenico-bis(&beta;-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA) - 1 mM, pH 8,0</td></tr><tr><td>0,05% tripsina EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0,05% tripsina/0,53 EDTA (1X)</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>L-glutammina (200 mM)</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Penicillina/streptomicina (10.000 unità/mL Penicillina e 10.000 &micro; g/mL Streptomicina)</td></tr><tr><td>Siero di vitello neonato</td><td>Gibco</td><td>16010-142</td><td>Siero di vitello neonato: Fibronectina di origine neozelandese</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056-1MG</td><td>Fibronectina - 50 &; g/mL aliquote preparate e conservate</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (10x): Diluire a 1x con H20</td></tr><tr><td>0,1% TNF</td><td>Gibco</td><td>PHC3015</td><td>TNF umano ricombinante - Ricostituito in H20 e conservato in 10 &micro; g/mL aliquote Lipoproteina</td></tr> a <tr><td>bassa densità</td><td>Merck Millipore</td><td>LP2-2MG</td><td>Lipoproteina a bassa densità (LDL)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 o 2% formaldeide</td><td>Polysciences</td><td>4018</td><td>1 o 2% formaldeide diluita con H20</td></tr><tr><td>sterile 50% e 78% di metanolo</td><td>Ajax Finechem</td><td>318-2.5L GL</td><td>50% o 78% v/v metanolo, diluito con H20</td></tr><tr><td>Olio Rosso O colorante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>Diluire a 2 mg/mL in 22% 1M NaOH e 78% (v/v) metanolo</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Mikro-Glass</td><td>S41104AMK</td><td>Doppi vetrini per microscopio smerigliati a 45 gradi (25 X 76 mm)</td></tr><tr><td>Vetrini di copertura</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>MENCS224015GP</td><td>22 x 40 mm #1,5 dimensioni vetrino scorrevole</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>3M Scotch</td><td>4011</td><td>Nastro di montaggio esterno super resistente (25,4 mm x 1,51 m)</td></tr><tr><td>Colorazione Giemsa</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09204.0500</td><td>Giemsa's azur eosin metilene blue solution (diluito stock 1:10 in H20)</td></tr><tr><td>Perforatore</td><td></td><td></td><td>Punzone portatile a foro singolo (punzone da 6,35 mm)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Citometria a flusso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td>Collagenasi D diluita in terreni M199 a 1 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>35 & micro; m rete di nylon polistirene con tappo tubi FACS</td><td>BD Biosciences 352235</td><td></td><td>35 &micro; m tubi FACS in polistirene con cappuccio in rete di nylon</td></tr><tr><td>Live/Dead Macchia gialla di cellule morte fissabile</td><td>Life Technologies</td><td>L34959</td><td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td></tr><tr><td>FACS wash Preparare</td><td></td><td></td><td>mescolando 1 X PBS-, 2 mM EDTA e 1% Siero di vitello appena nato</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr>piastra da <tr><td>96 pozzetti</td><td>Nunclon</td><td>167008</td><td>Piastra Delta a fondo piatto a 96 pozzetti Piastra</td></tr> di <tr><td>Petri da</td><td>10 cm TPP</td><td>93100</td><td>Sterile Piastra di Petri da 10 cm</td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 mL Eppendorf</td><td></td><td>0030 125.150</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>tubes Transfer pipetta</td><td>Samco Scientific</td><td>222-20S</td><td>Pipetta sterile per trasferimento (1 mL, bulbo grande)</td></tr></tbody></table>

quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Malattia coronarica (CAD) è delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Aterosclerosi, dei principali causa di CAD, è iniziata dalla trasmigrazione dei monociti immune innati a siti infiammatori del lipido depositato chiamato strisce grasse, che sono presenti nelle pareti arteriose del mezzo alle grandi arterie. La caratteristica fondamentale di patogena delle lesioni in questa fase iniziale di aterosclerosi è la maturazione dei monociti che migrano nelle arterie per formare cellule schiumose o macrofagi lipido-carichi. La considerevole prova sostiene l'ipotesi che il rischio di aterosclerosi è aumentato di condizioni infiammatorie croniche, malattie come l'artrite reumatoide e l'HIV, come pure l'invecchiamento generale di accompagnamento, e che questo rischio è previsto da monocito attivazione. Mentre modelli murini di fornire una buona piattaforma per studiare il ruolo dei monociti nel atherogenesis in vivo, richiedono alterazione genetica del metabolismo del colesterolo naturali e drastica alterazione delle diete normali del topo e hanno limitato l'idoneità per lo studio delle influenze atherogenic di malattie umane del comorbid. Questo ci ha motivato a sviluppare un modello umano in vitro per misurare il potenziale atherogenic di monociti isolati da individui con Stati di malattia definita. Attualmente, modelli umani in vitro sono limitanti in quanto valutano la formazione delle cellule di monocito trasmigrazione e schiuma in isolamento. Qui descriviamo un protocollo in cui monociti isolati da sangue del paziente trasmigrano in cellule endoteliali umane in una matrice di collagene di tipo 1, e viene misurata la loro propensione a maturare in cellule della gomma piuma in presenza o assenza di esogena del lipido. Il protocollo è stato convalidato per l'uso dei monociti umani purificati da individui con infezione da HIV e individui anziani non infetti da HIV. Questo modello è versatile e permette la formazione di monocito trasmigrazione e schiuma delle cellule deve essere valutata usando sia la microscopia o citometria a flusso, nonché a consentire la valutazione dei fattori atherogenic presenti nel siero o plasma.

Quantificare la trasmigrazione del monocito
Monociti vengono aggiunti al modello come descritto in Figura 1, e sei gel sono preparati per ogni condizione. Monociti per 6 gel per donatore (cioè, 5,0 x 104 monociti al gel gel 6 = 3.0 x 105 monociti per donatore) sono risospese ad un volume finale di 600 µ l di M199 supporti contenenti il lipido richiesto...

Descriviamo un protocollo per misurare trasmigrazione dai monociti attraverso strati monomolecolari endoteliali umani e la loro successiva maturazione in cellule della gomma piuma. Questo fornisce un metodo versatile per valutare le proprietà atherogenic dei monociti isolati da persone con diverse patologie e per valutare i fattori nel sangue che possono migliorare questa propensione.

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

L'obiettivo generale di questo test è quantificare la capacità dei monociti provenienti da campioni clinici umani di subire la migrazione transendoteliale e la formazione di cellule schiumose. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave in campo cardiovascolare, come il potenziale aterogeno delle cellule di individui a rischio di malattia coronarica acuta. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i campioni clinici possono essere misurati sia da sangue intero fresco che da coorti di pazienti conservate.Inoltre, la formazione di cellule schiumogene può essere quantificata sia mediante microscopia che citometria a flusso. Per prima cosa, prepara i gel di collagene polimerizzati da una sospensione di collagene fresco. A un tubo di polistirene da cinque millilitri, aggiungi idrossido di sodio, poi 10 volte M199, quindi acido acido e infine aggiungi collagene fibroso.Mescolare bene il tutto pipettando. Successivamente, aliquotare 50 microlitri nei pozzetti interni di una piastra sterile di coltura tissutale a fondo piatto a 96 pozzetti. Nei bordi esterni dei pozzetti, caricare 200 microlitri di una volta Dulbecco PBS per prevenire l'essiccazione.Dopo due o

quantification-monocyte-transmigration-foam-cell-formation-from

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Camere di flusso Microfluidic incisi da fotolitografia e fabbricati da PDMS sono applicate per sondare gli esiti funzionali associati alla disfunzione CE e l'infiammazione. In un esperimento rappresentativo, la capacità di sforzo di taglio differenziale di modulare l'adesione cellulare monocitica di citochina attivato CE monostrati è dimostrata.

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Derivate da monociti macrofagi sono cellule importanti del sistema immune innato. Qui, descriviamo un facile da...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Riportiamo un metodo in vitro che permette la quantificazione del numero effettivo di cellule adesive all'interno di un monostrato di cellule endoteliali.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Il protocollo utilizza la crioconservazione dei monociti accoppiata alla loro differenziazione di massa in macrofagi. Quindi i macrofagi raccolti possono essere seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l'analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.

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Qui presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di sottoinsiemi del monocito mediante citometria di flusso di sangue intero. Ciò include che delinea come cancello i sottoinsiemi e valutare la loro espressione di marcatori di superficie e dando un esempio della valutazione dell'espressione di M1 (infiammatoria) e marcatori M2 (antinfiammatorio).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Qui, presentiamo un protocollo integrato che misura sottopopolazione del monocito traffico sotto flusso in vitro mediante uso di specifici marcatori di superficie e microscopia a fluorescenza confocale. Questo protocollo consente di esplorare reclutamento sequenziale passaggi anche per quanto riguarda il profilo di altri sottotipi del leucocita utilizzando altri specifici marcatori di superficie.

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

Qui presentiamo un protocollo per quantificare l'attività chemiotattica dei monociti del sangue nei modelli murini, per valutare gli effetti degli interventi nutrizionali, farmacologici e genetici sul monocito del sangue e per caratterizzare i monociti del sangue derivati dai macrofagi in modelli murini che utilizzano tappi di gel derivati dalla membrana del basato monocite-chemoattractant-1 (MCP-1).

Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

Qui, descriviamo un protocollo di citometria di flusso dettagliato e riproducibile per identificare sottoinsiemi monociti/macrofamiglia e t-cell utilizzando saggi di colorazione extra e intracellulare all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale, utilizzando un modello chirurgico stabilito di osteoartrite murina.

Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

Scopri come quantificare la trasmigrazione dei monociti e la formazione delle cellule della gomma piuma in campioni clinici umani. Questo metodo permette di valutare il potenziale aterogenico e identificare individui a rischio di malattie cardiovascolari acute.

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche (Video) | JoVE Journal

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

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