Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

L'obiettivo generale di questo test è quantificare la capacità dei monociti provenienti da campioni clinici umani di subire la migrazione transendoteliale e la formazione di cellule schiumose. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave in campo cardiovascolare, come il potenziale aterogeno delle cellule di individui a rischio di malattia coronarica acuta. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i campioni clinici possono essere misurati sia da sangue intero fresco che da coorti di pazienti conservate.

Inoltre, la formazione di cellule schiumogene può essere quantificata sia mediante microscopia che citometria a flusso. Per prima cosa, prepara i gel di collagene polimerizzati da una sospensione di collagene fresco. A un tubo di polistirene da cinque millilitri, aggiungi idrossido di sodio, poi 10 volte M199, quindi acido acido e infine aggiungi collagene fibroso.

Mescolare bene il tutto pipettando. Successivamente, aliquotare 50 microlitri nei pozzetti interni di una piastra sterile di coltura tissutale a fondo piatto a 96 pozzetti. Nei bordi esterni dei pozzetti, caricare 200 microlitri di una volta Dulbecco PBS per prevenire l'essiccazione.

Dopo due ore di incubazione a 37 gradi Celsius, il collagene polimerizzerà. Quindi, sovrapporre i gel con 150 microlitri di M199 integrato una volta e incubarli fino al momento dell'uso cinque giorni dopo. Per espandere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana conservate, preparare una fiaschetta di coltura di 25 centimetri quadrati con un millilitro di soluzione di fibronectina e incubare la capsula per 10 minuti a temperatura ambiente.

Nel frattempo, scongelare le cellule immagazzinate in un bagno d'acqua per risospenderle in M20. Una volta scongelate le cellule, aspirare l'eventuale soluzione residua di fibronectina dal piatto e piastrare. Quindi, la cultura alla confluenza sostituendo i media dopo due o tre giorni.

Gli HUVEC dovrebbero essere confluenti il quinto giorno di coltivazione. Staccarli aspirando il surnatante della coltura dal pallone, quindi lavare via il terreno contenente siero utilizzando due o tre millilitri di una volta PBS. Quindi, aggiungere cinque millilitri di tripsina diluita e incubare brevemente le cellule a temperatura ambiente, agitando delicatamente le cellule fino a quando non appaiono staccate.

Quindi, raccoglierli rapidamente con cinque millilitri di M20 e trasferire la sospensione in una provetta da 10 millilitri e celle centrifugate. Ora, risospendere le celle in M20 a 200.000 cellule per millilitro. Quindi, aspirare l'M199 dalla piastra di collagene preparata e aggiungere 100 microlitri di HUVEC a ciascun gel.

Continua la cultura per tre giorni. L'ottavo giorno di coltura degli HUVEC, attivare i monostrati prima di aggiungere i monociti. Dopo aver aspirato il terreno di sovrapposizione, aggiungere 100 microlitri di soluzione umana di TNF-alfa in ciascun pozzetto.

Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per quattro ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno e lavare i gel due volte utilizzando 100 microlitri di M199 per lavaggio. Ora, aggiungi 50.000 monociti appena isolati o sottogruppi di monociti purificati in 100 microlitri di M20 ai monostrati HUVEC.

Dopo aver aggiunto i monociti, incubare la piastra per un'ora per consentire la trasmigrazione in avanti delle cellule. Dopo un'ora, raccogliere le cellule non trasmigrate in soluzione di lavaggio. Iniziare raggruppando due lavaggi EGTA utilizzando 100 microlitri per pozzetto.

Quindi, centrifugare le soluzioni di lavaggio combinate a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 30 microlitri di PBS e contare le cellule per determinare la percentuale di cellule trasmigrate in avanti. Ora, lavare i pozzetti della piastra una volta con M199 e aggiungere 100 microlitri di M20 fresco ai pozzetti della piastra e incubare la piastra per due giorni.

Dopo due giorni, ripetere la procedura per la raccolta delle cellule non trasmigrate nella soluzione di lavaggio EGTA al fine di raccogliere le cellule trasmigrate al contrario e procedere con l'analisi fenotipica delle cellule. Per caratterizzare fenotipicamente le cellule legate al gel mediante analisi FACS, digerire le cellule aggiungendo 100 microlitri di collagenese D a 37 gradi Celsius e incubando per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, macerare i gel utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri e incubarli per altri 20 minuti per digerire completamente i gel.

Una volta completamente digeriti, filtrare e raggruppare i gel replicati digeriti attraverso una rete di nylon da 35 micron in un tubo FACS su ghiaccio. Ora, lavare una volta le celle filtrate con la soluzione di lavaggio FACS fredda. Centrifugare le cellule e risospenderle in 100 microlitri di soluzione di lavaggio a freddo.

Quindi, eseguire la colorazione e l'analisi FACS secondo il protocollo di testo. Per analizzare le cellule al microscopio, colorare prima le cellule come descritto nel protocollo di testo. Per staccare le cellule colorate, bordare i pozzetti utilizzando un ago calibro 21 con lo smusso rivolto verso l'esterno.

Quindi, prepara i vetrini per montare i gel. Praticare due piccoli fori in una striscia di nastro biadesivo, quindi fissare il nastro alla slitta e rimuovere il rivestimento protettivo. Quindi, aggiungi una goccia d'acqua in ogni foro del nastro.

Quindi, utilizzando una pinzetta, trasferire delicatamente due gel sui due fori e coprire il nastro. Infine, attacca con cura un vetrino coprioggetti al nastro e procedi con la visualizzazione delle cellule. Dopo la trasmigrazione, le cellule non trasmigrate sono state contate come descritto.

Sono state recuperate un totale di 15.000 cellule non trasmigrate e la percentuale di trasmigrazione in avanti è stata determinata al 95%Dopo 48 ore di ulteriore incubazione, sono state recuperate 36.000 cellule trasmigrate al contrario, pari al 12,6% di trasmigrazione inversa. Colorando i gel con olio rosso O si rivelavano cellule schiumogene indicate da frecce bianche e macrofagi indicati con frecce nere. Questi monociti sono stati trattati con LDL ossidato durante la trasmigrazione, una sostanza utilizzata per indurre la formazione di cellule schiumogene nei modelli convenzionali di induzione di cellule schiumose.

I dati aggregati sulla conta cellulare di 12 donatori hanno confermato che l'incubazione di monociti con LDL ossidato ha indotto una maggiore formazione di cellule schiumogene rispetto a quando i monociti sono incubati con LDL nativo o terreni M199 da soli. Le cellule trasmigrate sono state analizzate anche mediante citometria a flusso. Dopo aver escluso le cellule morte, i doppietti e gli HUVEC CD45 negativi, è stata selezionata la maggior parte della popolazione di cellule migrate e l'intensità media di fluorescenza dei recettori di interesse è stata confrontata con i dati di controllo della fluorescenza meno uno o dell'isotipo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo test per quantificare la migrazione transendoteliale dei monociti e la formazione di cellule schiumogene da campioni clinici umani. Non dimenticare che lavorare con campioni clinici umani può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario utilizzare una buona tecnica di laboratorio.