Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione del DNA, come ad esempio come vengono regolate la formazione, la localizzazione e la risoluzione dei complessi di riparazione del DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può rilevare in modo inequivocabile i cambiamenti e riparare la localizzazione e la cinetica complesse. Oltre a questi ricercatori universitari nel mio laboratorio, tre studenti laureati eseguiranno gli esperimenti.

Si tratta di Changkun Hu, Dalton Dacus e Stephen Walterhouse. Per iniziare, coltivare le cellule U2OS/DR-GFP su una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri fino a quando non sono confluenti dall'85 al 90%. Quindi rimuovere il terreno, aggiungere tre millilitri di EDTA e incubare le cellule a temperatura ambiente per tre minuti.

Sostituire l'EDTA con un millilitro di tripsina e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere cinque millilitri di DMEM per neutralizzare la tripsina. Dopo aver contato le cellule, seminare sei volte 10 al terzo pozzetto in 200 microlitri di terreno in una piastra di vetro a 96 pozzetti.

In alternativa, seminare quattro volte 10 nei sei pozzetti in otto millilitri di terreno su vetrini coprioggetti da 12 millimetri posti in una piastra di 10 centimetri, quindi far crescere le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per indurre rotture a doppio filamento, o DSB, sostituire il terreno con perossido di idrogeno diluito a una concentrazione di 25 micromolari con DMEM più il 10% di FBS e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Lavare le celle tre volte con 1x PBS, quindi aggiungere DMEM fresco.

Per fissare le cellule dopo averle incubate, utilizzare il PBS per lavare la piastra tre volte. Quindi utilizzare un ago e una pinza per rimuovere con cura un vetrino coprioggetto dalla piastra da 10 centimetri per ogni punto temporale e posizionarlo in un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere il 4% di PFA e incubare le cellule per 15 minuti.

Poi noi PBS per lavare i vetrini coprioggetto tre volte. Per permeabilizzare le cellule, aggiungere lo 0,5% di detergente non ionico e PBS. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti.

Quindi lavare nuovamente le celle con PBS tre volte. Successivamente, aggiungere il 3% di BSA e lo 0,1% di detergente non ionico diluito in PBS ai vetrini coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Quindi aggiungere gli anticorpi primari che hanno come bersaglio la proteina di riparazione di interesse e incubare i campioni a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo aver lavato le cellule con PBS tre volte, aggiungere DAPI e incubare le piastre a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi incubare i campioni con anticorpi secondari. Dopo aver lavato le celle come prima, utilizzare il reagente di montaggio per montare i vetrini di copertura con il lato della cella rivolto verso il basso sui vetrini.

Premere con cautela sui vetrini coprioggetto e utilizzare un panno per assorbire il reagente di montaggio in eccesso. Sigillare i vetrini coprioggetto con smalto trasparente ad asciugatura rapida e garantire una tenuta completa del vetrino coprioggetto con il vetrino. Acquisisci immagini al microscopio confocale concentrandoti sul canale DAPI.

Per definire i nuclei nelle immagini in immunofluorescenza, aprire le immagini confocali trascinando il file immagine nella finestra di ImageJ o selezionando l'importatore di bioformati dalla barra degli strumenti del plug-in in ImageJ. Quindi seleziona i canali divisi. In opzioni di colore, seleziona colorato dal menu a discesa.

Selezionare OK per aprire le immagini DAPI e istone H2AX come finestre separate e scegliere l'immagine DAPI. Quindi seleziona la barra degli strumenti dell'immagine nell'opzione di regolazione della soglia per selezionare i nuclei. Quindi, regola la soglia dell'immagine facendo scorrere la barra inferiore della finestra della soglia completamente verso destra.

Regola la barra superiore fino a quando i nuclei appaiono completamente rossi con contorni distinti e lo sfondo è nero. Quindi seleziona la barra degli strumenti di analisi e l'opzione analizza particelle. Inserire la dimensione minima del nucleo.

Dal menu a discesa Mostra seleziona i contorni, quindi seleziona l'opzione Aggiungi al manager. Fare clic su OK per aprire una finestra di gestione del ROI. Dalla finestra ROI manager assegnare i numeri ai nuclei tramite selezione.

Per utilizzare ImageJ per quantificare i focolai H2AX e le immagini al microscopio a immunofluorescenza, selezionare la finestra dei focolai H2AX. Quindi seleziona la barra degli strumenti del processo e scegli trova massimi per trovare i fuochi all'interno dei nuclei. Dal menu a discesa del tipo di output, scegli l'opzione punti singoli e seleziona la selezione del punto di anteprima per visualizzare i fuochi massimi.

Quindi inserire un valore di tolleranza al rumore in base all'intensità della fioritura dell'immagine. Dalla finestra ROI manager selezionare i nuclei per i quali è necessario quantificare i focolai di H2AX. Seleziona misura per misurare il numero di focolai massimi all'interno dei nuclei selezionati.

Copia i valori di intensità grezzi e incollali nel software per l'analisi dei dati. Dopo aver posizionato le cellule su piastre a 96 pozzetti con vetrini coprioggetti, come dimostrato in precedenza in questo video, indurre rotture a doppio filamento utilizzando un agente transfezioniario a base lipidica per trasfettare le cellule con il vettore di espressione I-SceI. Per acquisire l'immagine dopo aver lavato le cellule permeabilizzate e bloccate da vix come mostrato in precedenza, aggiungere anticorpi contro gamma H2AX e riparare la proteina di interesse.

Con 1x PBS wash, il coperchio della piastra a 96 pozzetti scivola tre volte. Quindi incubare i vetrini di copertura della piastra a 96 pozzetti con anticorpi secondari. Infine, dopo aver identificato le cellule che hanno un grande focolaio di gamma H2AX nucleare, contare manualmente quelle che mostrano anche colocalizzazione con la proteina di riparazione di interesse.

Questa cifra mostra una discriminazione del rumore di 90 e segna il numero corretto di fuochi. I nuclei sul bordo e i focolai al di fuori dei nuclei non vengono conteggiati durante la quantificazione. Il pannello mostrato qui mostra una bassa tolleranza al rumore di 50.

Numerosi massimi sono identificati all'esterno del nucleo e all'interno del nucleo. In questa cella si trova un'elevata tolleranza al rumore di 220. È stato rilevato un solo focolaio.

In questa figura è illustrata la colocalizzazione di un focus gamma H2AX e di una proteina di riparazione di interesse. Qui viene mostrata una cella non trasfettata e in alto a destra viene mostrata una cella con fuoco gamma H2AX non nucleare. A un ingrandimento più elevato si può distinguere un'immagine più chiara di una vera messa a fuoco interna e di una messa a fuoco non nucleare o esterna.

Infine, qui viene mostrato un esempio di un focus gamma H2AX nucleare senza colocalizzazione di una proteina di riparazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi giorni se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la precipitazione dei co-mutori, al fine di identificare le interazioni tra le proteine di riparazione di interesse.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come osservare la formazione e la risoluzione dei complessi di riparazione del DNA inducendo rotture transitorie del doppio filamento nel DNA. Imparerai anche come distinguere in modo inequivocabile l'errata localizzazione dei fattori di riparazione dal reclutamento ritardato inducendo lesioni di lunga durata.