Name: Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Impara a caratterizzare i processi di riparazione del DNA nelle rotture a doppio filo usando la microscopia a immunofluorescenza su cellule U2OS/DR-GFP. Questo metodo consente di studiare la formazione e la risoluzione dei complessi di riparazione.

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Grazie a Joel Sanneman e Dr. Philine Wangemann del nucleo di microscopia confocale, finanziato da la Kansas State University College di medicina veterinaria, per il loro sostegno degli sforzi per sviluppare questa tecnica. pCBASceI era un regalo di Maria Jasin (Addgene plasmide # 26477) 30. Le cellule U2OS DR-GFP erano un regalo gentile da Maria Jasin18.

Siete pregati di notare che questo protocollo è stato scritto per U2OS celle contenenti un sito di riconoscimento-SceI18. Le celle non devono essere U2OS ma devono contenere il sito SceI. Il protocollo potrebbe essere necessario essere regolato (ad es., numero di cellule seminate e tempi di incubazione) a seconda del tipo di celle utilizzate.
1. definire la cinetica di formazione di complessi di riparazione DSB
<ol><li>Crescere le cellule U20S-DRGFP su una piastra di coltura del tessuto 10 cm fino a 85 – 90% confluenti.</li>
	<li>Rimuovere il supporto e incubare a temperatura ambiente (TA) in 3 mL di EDTA per 2 min.</li>
	<li>Sostituire EDTA con 1 mL di tripsina e incubare a 37 ° C per 5 min, assicurarsi che le cellule si staccano dalla superficie della piastra di visualizzazione al microscopio. Neutralizzare la tripsina con 5 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di cellule in sospensione utilizzando un emocitometro e il metodo di esclusione del blu di trypan.</li>
	<li>Seme 6 x 103 cellule/pozzetto in 200 µ l di una piastra a 96 pozzetti con fondo di vetro. In alternativa, seme 4 x 106 cellule in 8 mL sulle lamelle 12 mm posizionato in un piatto di 10 cm. Nota: Ogni bene o vetrino coprioggetti rappresentano un unico punto di tempo, compreso il controllo.</li>
	<li>Crescere le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Indurre DSBs
	<ol>
<li>Sostituire il supporto del piatto cm piastra 96 pozzetti/10 con H2O2 diluito ad una concentrazione di 25 µM con DMEM + 10% FBS e incubare a 37 ° C per 1 h.</li>
		<li>Lavare le cellule 3x con 1x PBS e Sostituisci con DMEM fresco completati con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C per 0, 1, 4, 8, 24 e 48 h. assicura che fresche diluizioni di H2O2 sono usate per ogni esperimento. Nota: Per evitare di uccidere le cellule alla concentrazione H2O2 usato qui, assicurarsi che la dose di danni sia bassa abbastanza in modo tale che la maggior parte delle cellule permetterà di evitare l'apoptosi e senescenza. È fondamentale osservare il processo di recupero. Ciò si ottiene misurando la sensibilità ad una gamma di dosi. Eseguire un'analisi di MTT o altre analisi di attuabilità delle cellule per determinare la minima concentrazione di perossido di idrogeno che può essere utilizzato.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissaggio e permeabilizing cellule
	<ol>
<li>Lavare le cellule 3 volte con PBS 1X. Rimuovere un vetrino coprioggetti dalla piastra di 10 cm per ogni punto del tempo e posizionarlo in un singolo pozzo di una piastra a 24 pozzetti per il fissaggio. Utilizzare l'ago e pinzette per rimuovere delicatamente il vetrino coprioggetti ed evitando di graffiare le cellule fuori dalla superficie del vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Fissare le cellule mediante incubazione per 15 min con paraformaldeide al 4% (PFA) a volte dopo 1 h di esposizione di H2O2 e la sostituzione di DMEM fresco (0, 1, 4, 8, 24 e 48 h) designato.</li>
		<li>Lavare i vetrini coprioggetti fissi 3 volte con PBS. Permeabilize le cellule con un detergente non ionico diluito in 1X PBS 0,5%. Incubare per 15 min a RT, prima di lavare 3 volte con PBS. Nota: Dopo il permeabilization, deposito di lamelle è possibile in PBS a 4 ° C per almeno una settimana.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualizzazione complessa riparazione
	<ol>
<li>Bloccare il piastra 96 pozzetti/coprioggetti in una soluzione di 3% albumina di siero bovino (BSA) e detergenti non ionici 0.1%, diluito in PBS 1X (soluzione al 3% BSA) per 1 h a TA.</li>
		<li>Incubare con gli anticorpi primari che la proteina di riparazione di interesse, diluito secondo le indicazioni del produttore in soluzione al 3% BSA per 1h a RT, prima di lavare 3 volte con PBS 1X di destinazione.</li>
		<li>Incubare il piastra 96 pozzetti/coprioggetti con anticorpo secondario diluito secondo il protocollo del produttore in soluzione al 3% BSA. Confermare che i fluorophores secondario non dispone di eccitazione sovrapposti o spettri di emissione.</li>
		<li>Dopo aver lavato le cellule con PBS 3 volte aggiungere DAPI, diluito secondo le indicazioni del produttore in 1X PBS e incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini con una goccia di agente di montaggio, assicurandosi che le facce di lato della cella verso il basso. Premere con attenzione i coprioggetti e godersi qualsiasi agente di montaggio in eccesso con un panno.</li>
		<li>Sigillare i coprioggetti con asciugatura rapida smalto trasparente e garantire una buona tenuta del coprivetrino con lo scivolo.</li>
		<li>Prendere le immagini al microscopio confocale concentrandosi sul canale DAPI, prima di altri canali (con segnali da gene di riparazione del DNA di interesse) per evitare di introdurre bias l'esperimento.</li>
		<li>In alternativa, le immagini possono essere acquisite prendendo Z-sezioni dell'area desiderata e condensando l'immagine in un unico piano per visualizzare tutti i fuochi rilevabili. Nota: Se la risoluzione DSB o proteina di interesse non è osservata in momenti scelti, determinare quando DSBs risolvere selezionando una vasta gamma di punti di tempo inizialmente (0 – 48 h dopo induzione di DSB). I punti di tempo di interesse variano dal metodo di induzione del DSB e la riparazione della proteina di interesse.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare software libero ImageJ per definire i nuclei nelle immagini di microscopia di immunofluorescenza. Nota: Per aprire immagini al microscopio, il Bio-Formats plugin deve essere installato in ImageJ.<ol>
<li>Aprire le immagini confocale (.czi o. TIF) trascinando il file di immagine nella finestra di ImageJ, oppure selezionando "Bio-Formats importatore" dalla barra "Plugin" in ImageJ. Nota: Apparirà la finestra "Opzione di importazione di Bio-Formats".</li>
		<li>Selezionare "Canali Split" per dividere l'immagine in DAPI costitutiva e immagini fluorescenti all'interno della finestra "Opzione di importazione di Bio-Formats".</li>
		<li>Selezionare "Colorized" in "Opzioni di colore" dal menu a discesa. Selezionare "OK" per aprire il DAPI e istone H2AX (H2AX) immagini come finestre separate e scegliere l'immagine DAPI.</li>
		<li>Selezionare l'opzione di "Regolare la soglia" per selezionare i nuclei e la barra degli strumenti "Immagine". Nota: Verrà visualizzata una finestra di "Soglia".</li>
		<li>Regolare la soglia di immagine facendo scorrere la barra inferiore della finestra di "Soglia" completamente a destra. Regolare la barra superiore fino a quando i nuclei appaiono completamente rossi con contorni distinti e il nero di sfondo. NON selezionare Applica. Chiudere la finestra di "Regolare la soglia".</li>
		<li>Selezionare l'opzione di "Analizzare particelle" e "Analizza" barra degli strumenti. Visualizzata una finestra di "Analizzare particelle" che appaiono sullo schermo.</li>
		<li>La dimensione minima di un nucleo di input. Nota: Particelle sotto la dimensione immessi non verranno conteggiate come nuclei.</li>
		<li>Dal menu a discesa "Mostra", selezionare "Contorni". Selezionare l'opzione "Aggiungi a Manager". Fare clic su "OK" per aprire una finestra di "Gestione di ROI". Nota: I contorni dei nuclei verranno visualizzato in una finestra separata.</li>
		<li>Assegnare i numeri ai nuclei che possono essere selezionati dalla finestra "ROI Manager".</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare ImageJ per quantificare i fuochi H2AX in immagini di microscopia di immunofluorescenza.
	<ol>
<li>Selezionare la finestra di fuochi "H2AX" (macchiata con l'anticorpo secondario coniugato fluorescente). Quindi, selezionare la barra degli strumenti di "Processo" e scegliere "Trova Maxima" per trovare i fuochi all'interno dei nuclei. Nota: Si aprirà una finestra di "Trovare Maxima".</li>
		<li>Scegliere l'opzione "Singolo punti" dal menu a discesa "Tipo di Output" e selezionare "Selezione punto anteprima" per visualizzare i maxima/fuochi. Immettere un valore di "Tolleranza di rumore" a seconda dell'intensità di fluorescenza dell'immagine (Figura 1). Controllare l'aspetto di una finestra bianca con piccoli punti neri. Nota: Questi punti rappresentano la H2AX foci/maxima che sono stata rilevata. Il valore di tolleranza di rumore deve essere mantenuto costante per tutte le immagini sono analizzate. Una tolleranza bassa/alta rumore si raffigurano troppo molte/poche maxima (fuochi) all'interno del nucleo e non sarà una rappresentazione accurata dei fuochi all'interno del nucleo.</li>
		<li>Selezionare i nuclei per i quali i fuochi H2AX devono essere quantificati dalla finestra "ROI Manager". Selezionare tutti i nuclei selezionando l'opzione "Mostra tutti".</li>
		<li>Selezionare "Misura" per misurare il numero di maxima/fuochi all'interno dei nuclei selezionati. Nota: Il numero di maxima/fuochi appaiono come multipli di 255, cioè, uno massimo ha una lettura di "RawIntDen" (densità integrata) di 255.</li>
		<li>Copiare i valori di "RawIntDen" e incollarli in software per l'analisi dei dati.</li>
	</ol></li>
</ol>2. analisi di localizzazione per una rottura del DNA Double-strand di lunga durata
<ol><li>Cellule di seme sulle 96 pozzetti piastre/lamelle come descritto nelle sezioni 1.1 e 1.2.</li>
	<li>
Induzione di rotture del DNA a doppio filamento
	<ol>
<li>Transfect cellule con il vettore di espressione-SceI utilizzando un reagente di transfezione basata sui lipidi secondo le specifiche del produttore. Attendere 24-72 h dopo la trasfezione per massimizzare l'espressione dell'endonucleasi. Determinare se la transfezione è stata completata individuando le cellule con un focus di singolare grande nucleare γ-H2AX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acquisizione di immagini
	<ol>
<li>Difficoltà, permeabilize, bloccare e lavare il piastra 96 pozzetti/coprioggetti, come descritto nella sezione 1.8.</li>
		<li>Co-Incubare le cellule con un anticorpo contro γ-H2AX e la riparazione della proteina di interesse (qui, un anticorpo primario contro RAD51 è stato usato) diluiti secondo le specifiche del produttore in soluzione al 3% BSA.</li>
		<li>Lavare il piastra 96 pozzetti/coprioggetti 3 volte con PBS 1X. Incubare il piastra 96 pozzetti/coprioggetti con anticorpo secondario diluito secondo il protocollo del produttore in soluzione al 3% BSA. Confermare che i fluorophores secondario non dispone di eccitazione sovrapposti o spettri di emissione.</li>
		<li>Identificare le cellule che hanno un fuoco grande nucleare γ-H2AX. Solo scattare foto di queste cellule per evitare distorsioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di lunga durata SceI fuochi indotti
	<ol>
<li>Analizzare i fuochi di lunga durata manualmente, contando il numero di cellule che hanno la grande γ-H2AX foci e co-localizzati i fuochi della riparazione proteina di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'analisi del DNA danni riparazione in generale e la riparazione delle rotture del DNA double-stranded in particolare è un'area attiva di ricerca, poiché le sue conseguenze estendono su tumorigenesi a biologia di base6,20. Questo dettagli di manoscritto un approccio che analizza con precisione il contributo delle proteine RAD51 e γ-H2AX alla risoluzione di DSBs attraverso HR. guardando al futuro, questo metodo può essere usato per delucidare ulteriori funzioni de...

Ogni giorno, ogni cellula nel corpo umano è bombardato con un 10.000 stimato DNA lesioni1. Questa minaccia esistenziale ci mette a rischio di mutazioni, oncogenesi, nonché delle cellule morte. Per proteggere la fedeltà del genoma, le cellule di mammiferi si sono evolute per rispondere a danno del DNA con una complessa serie di associazioni di proteina e modifiche. Questa risposta è organizzata in più percorsi, conosciuti collettivamente come il DNA danni risposta (DDR)2,3. Il DDR è costituito dall'accumulo di proteine di riparazione del DNA alle lesioni del DNA, coordinate sia temporalmente e spazialmente. DDR frequentemente induce arresto del ciclo cellulare per evitare la propagazione o l'intensificazione dei danni che possono verificarsi durante la replica di danneggiato DNA2,4,5. A sua volta, è anche necessario per la vitalità cellulare si disattiva arresto del ciclo cellulare tramite la dissociazione complessi di riparazione dopo la riparazione è stata completata.
Tra le varie tipologie di danno del DNA, DSBs sono più deleteri. Omissione di riparare DSBs può provocare di riarrangiamenti cromosomici o eliminazioni su larga scala come la perdita di braccia di intero cromosoma. La riparazione di DSBs è diviso in due percorsi6,7,8. Ricombinazione omologa (HR) richiede una sorella cromosoma da utilizzare come un modello di DNA e quindi è limitato a fine fasi S e G2/M del ciclo cellulare9,10. Non-omologa fine unirsi (NHEJ) non hanno queste limitazioni ma può causare piccole omissioni quando riparare DSBs11,12.
DSB riparazione specificamente e il DDR in generale sono aree attive di indagine. Pur essendo organizzati in vie convenientemente separate, c'è una grande quantità di ridondanza. Infatti, molte proteine (BRCA1, BRCA2 e il RPA complessa per esempio) sono coinvolti in molteplici vie13,14,15,16. La riparazione di una lesione di una via, può portare a danni intermedio che devono essere riparato da un altro percorso14. L'intreccio di queste vie, combinate con il loro complesso compito di reclutare le proteine giuste al posto giusto per la precisa quantità di tempo necessario, richiede un processo di regolamentazione multilivello.
Un recente rapporto mette in evidenza la complessità della DDR dimostrando che formazione di complessi di riparazione, la risoluzione e la localizzazione può ciascuno separatamente essere alterata17. L'obiettivo generale del seguente protocollo è definitivamente dissezionare la capacità delle cellule di riparare DSB. Usando la microscopia di immunofluorescenza, accumulo di proteine di riparazione presso i siti di danno possa essere visualizzato nei punti di tempo rappresentativo dopo l'induzione di DSBs.
Questa tecnica ha diversi vantaggi per gli approcci comunemente utilizzati. Riparazione è spesso studiati intervalli di tempo singolo e incapace di rappresentare il processo dinamico dell'Assemblea e la dissociazione dei complessi di riparazione. Osservando l'intera gamma di riparazione dall'attivazione iniziale a piena risoluzione assicura che un ritardo nella riparazione non è erroneamente identificato come l'inibizione completa. Al contrario, assicura che l'induzione di una risposta di riparazione che è in grado di inattivare tale riscontro non è erroneamente identificato come il normale o l'eccessiva attivazione.
Formazione dei complessi della proteina in ritardo e la mis-localizzazione delle proteine di riparazione, tuttavia, può non essere inequivocabilmente distinto con questo approccio. Per determinare se proteine di riparazione sono mis-localizzate contro il ritardo nella loro localizzazione, una "lunga durata" DSB può essere introdotto attraverso scissione enzimatica del DNA cellulare. La lesione risultante è ripassare ogni volta che si è riparato, risultante in un focus distinti grande riparazione nucleare ed eliminando la limitazione temporale dal reclutamento. Ciò può essere ottenuto modificando l'approccio esistente con l'uso di un'endonucleasi di taglio raro (ad es., SceI) per indurre un DSB di lunga durata. La longevità di DSBs consente la visualizzazione delle proteine di riparazione sfuggente da microscopia di immunofluorescenza. L'abbondanza di avanzata potrebbe anche migliorare la visualizzazione quando il rilevamento è ostacolato dalla limitazione della qualità di anticorpo, una caratteristica che potrebbe essere utile quando meno proteine studiate sono identificate come aventi un impatto sulla riparazione del DNA.
In particolare, forniamo istruzioni esplicite per un immagini elaborazione ed analisi software (ad es., ImageJ). Consente di rimuovere un ostacolo finanziario analisi dell'immagine, aprendo l'interrogatorio di riparazione di danni del DNA ad un pubblico più ampio.

<table><tbody><tr><td>Vetrini coprioggetti da 12 mm</td><td>VWR</td><td>89015-725</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide (PFA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>VWR</td><td>82050-892</td><td></td></tr><tr><td>Piastra inferiore in vetro a 96 pozzetti</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AX Alexa488</td><td>EMD Millipore</td><td>05-636-AF488</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (D4B10)&nbsp;</td><td>Plugin Cell Signaling Technology</td><td>8875S</td><td></td></tr><tr><td>Bio-formati per ImageJ</td><td>National Institute of Health (NIH)&nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Alto glucosio</td><td>ThermoFisher Scientific 12100046</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>VWR</td><td>89510-194</td><td></td></tr><tr><td>Capra Anti-Coniglio IgG Alexa594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11012&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Istituto Nazionale di Sanità (NIH)&nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>I-SceI Expression Vector Addgene</td><td></td><td>26477</td><td></td></tr><tr><td>Smalto per unghie- Insta Dri</td><td>Sally e Hansen</td><td>Chiaramente Veloce (103)</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidissolvenza ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione TurboFect</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

che caratterizzano i processi di riparazione del dna alle rotture del dna transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

La riparazione delle rotture a doppio filamento (DSBs) nel DNA è un processo altamente coordinato, rendendo necessaria la formazione e la risoluzione di complessi di riparazione della multi-proteina. Questo processo è regolato da una miriade di proteine che promuovono l'associazione e dissociazione delle proteine a queste lesioni. Grazie in gran parte alla capacità di eseguire schermi funzionali di una vasta libreria di proteine, c'è un maggiore apprezzamento dei geni necessari per la riparazione di rottura del DNA double-strand. Schermi di inibitore spesso knockout o chimici identificano proteine coinvolte nei processi di riparazione utilizzando tossicità aumentata come indicatore per una proteina che è necessaria per la riparazione DSB. Sebbene sia utile per identificazione romanzo proteine cellulari coinvolte nel mantenimento della fedeltà del genoma, analisi funzionale richiede la determinazione di se la proteina di interesse promuove la localizzazione, la formazione o la risoluzione di complessi di riparazione.
L'accumulo di proteine di riparazione può essere facilmente individuata come distinti foci nucleari da microscopia di immunofluorescenza. Così, associazione e dissociazione di queste proteine nei siti di danno del DNA può essere letta osservando questi fuochi nucleari intervalli rappresentativi dopo l'induzione di rotture a doppio filamento del DNA. Questo approccio può anche identificare proteine del fattore di riparazione mis-localizzata, se difetti di riparazione non si verificano simultaneamente con incompleti ritardi nella riparazione. In questo scenario, lunga durata rotture a doppio filamento del DNA possono essere progettate esprimendo un'endonucleasi di taglio raro (ad es., SceI) in cellule dove il sito di riconoscimento per l'enzima suddetto è stato integrato nel genoma della cellula. La lesione risultante è particolarmente difficile da risolvere come fedele riparazione reintrodurrà il sito di riconoscimento dell'enzima, che richiede un altro giro di clivaggio. Di conseguenza, vengono eliminate le differenze nella cinetica della riparazione. Se non si formano complessi di riparazione, localizzazione è stato ostacolato. Questo protocollo descrive la metodologia necessaria per identificare le modifiche nella cinetica di riparazione, nonché la localizzazione della proteina di riparazione.

Figura 1 illustra la selezione della discriminazione rumore corretto per la quantificazione di maxima/fuochi usando ImageJ. Le immagini unite di DAPI e la proteina di riparazione di interesse sono sul pannello di sinistra. Figura 1A Mostra una discriminazione di rumore di 90 e segna il numero corretto dei fuochi. I nuclei sul bordo (raffigurato con una freccia rosa) e i fuochi di fuori dei nuclei (raffigurati con una freccia gial...

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione del DNA, come ad esempio come vengono regolate la formazione, la localizzazione e la risoluzione dei complessi di riparazione del DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può rilevare in modo inequivocabile i cambiamenti e riparare la localizzazione e la cinetica complesse. Oltre a questi ricercatori universitari nel mio laboratorio, tre studenti laureati eseguiranno gli esperimenti.Si tratta di Changkun Hu, Dalton Dacus e Stephen Walterhouse. Per iniziare, coltivare le cellule U2OS/DR-GFP su una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri fino a quando non sono confluenti dall'85 al 90%. Quindi rimuovere il terreno, aggiungere tre millilitri di EDTA e incubare le cellule a temperatura ambiente per tre minuti.Sostituire l'EDTA con un millilitro di tripsina e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere cinque millilitri di DMEM per neutralizzare la tripsina. Dopo aver contato le cellule, seminare sei volte 10 al terzo pozzetto in 200 microlitri di terreno in una piastra di vetro a 96 pozzetti.In alternativa, seminare quattro volte 10 nei sei pozzetti in o

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Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

In questo video, descriviamo il metodo di immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti di rotture del DNA a doppio filamento nei nuclei cellulari irradiati.

Visualizzazione basata sull'immunofluorescenza delle interazioni proteiche di riparazione del DNA

In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a immunofluorescenza per rilevare specifiche proteine di risposta al danno del DNA localizzate nei siti di rottura del doppio filamento di DNA nelle cellule mononucleate umane. Le proteine sono riconosciute da specifici anticorpi primari, che a loro volta si legano agli anticorpi secondari marcati con fluorofori che emettono fluorescenza durante la visualizzazione microscopica, consentendo la visualizzazione delle proteine come focolai...

Microscopia a immunofluorescenza per l'analisi delle rotture del DNA a doppio filamento

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Questo manoscritto fornisce un protocollo per l'analisi delle rotture del doppio filamento di DNA da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente stabilita. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per rilevare i foci indotti da radiazioni (RIF) delle proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza nelle linee cellulari del cancro del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Il seguente protocollo presenta la rilevazione di focolai di DNA a singolo filamento nella fase G1 del ciclo cellulare utilizzando la sincronizzazione del ciclo cellulare seguita dalla colorazione immunofluorescente RPA2.

Visualizzazione dei focolai di DNA a singolo filamento nella fase G1 del ciclo cellulare

Impara a caratterizzare i processi di riparazione del DNA nelle rotture a doppio filo usando la microscopia a immunofluorescenza su cellule U2OS/DR-GFP. Questo metodo consente di studiare la formazione e la risoluzione dei complessi di riparazione.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

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