Atterramento condizionale dell'espressione genica in linee cellulari del cancro per studiare il reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare il knockdown condizionale dell'espressione genica nelle cellule tumorali per studiare il reclutamento di monociti e macrofagi nel microambiente tumorale in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del microambiente tumorale riguardo alla natura del ceppo incrociato tra le cellule tumorali e le cellule del sistema immunitario. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il sistema utilizzato qui richiede la clonazione di un singolo vettore, consente la generazione rapida di cloni multipli e presenta livelli di spessore molto bassi.

È stato anche dimostrato un metodo per la purificazione dei monociti umani senza contatto diretto con gli anticorpi, che evita l'attivazione accidentale e si traduce in una popolazione pura di monociti umani per oltre il 95%. Per produrre particelle virali, trasfettare il 70% di piastre confluenti da 150 millimetri di cellule HEK-293 con 25 microgrammi di pLKO-tet-on shRNA, 25 microgrammi del plasmide di imballaggio psPAX e cinque microgrammi del plasmide pMD2 che esprime l'inviluppo. G utilizzando il reagente di trasfezione secondo i protocolli standard.

Aggiungere il composto ai piatti da 150 millimetri. Il giorno successivo, indurre la produzione di lentivirali nelle cellule cambiando il terreno in DMEM integrato con 10 millimolari di butirrato di sodio e 20 millimolari di HEPES. Coltura per otto ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo otto ore, lavare le cellule con PBS e aggiungere 25 millilitri di terreno DMEM fresco con 20 millimolari HEPES e senza butirrato di sodio. Dopo l'incubazione per 48 ore, raccogliere con cura il terreno contenente il virus con una pipetta. Per generare linee cellulari stabili, iniziare seminando le cellule di cancro del colon HCT-116 e le cellule di cancro al seno MDA-MB-231 in una piastra a 12 pozzetti e 50.000 cellule per pozzetto.

Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule sono confluenti al 60-70%, lavare le cellule con PBS e aggiungere un millilitro di terreno contenente virus a ciascun pozzetto. Il giorno successivo, rimuovere con cura il terreno contenente il virus mediante aspirazione.

Quindi, dopo aver lavato le cellule con PBS, aggiungere un terreno contenente FBS privo di tetracicline. Dopo 72 ore, lavare le cellule come prima e aggiungere un terreno integrato con un microgrammo per millilitro di puromicina per la selezione delle cellule trasfettate dal virus. Selezionare le cellule trasdotte dal virus coltivando cellule in presenza di puromicina per tre-14 giorni.

Osservare l'uccisione parziale dei pozzetti da parte della puromicina nelle cellule con cellule trasdotte dal virus. Le cellule non trasdotte non crescono in presenza di puromicina. Quando queste cellule di controllo sono morte, continuare la coltura delle linee cellulari regolate condizionatamente per due settimane in presenza di antibiotici per creare le linee cellulari regolate condizionatamente.

Verificare l'efficienza del knockdown condizionale nelle cellule di carcinoma del colon HCT-116 resistente alla puromicina e nelle cellule di carcinoma mammario MDA-MB-231 aggiungendo terreno con diverse concentrazioni di doxiciclina e coltivando le cellule per 72 ore. Dopo aver preparato il lisato cellulare, verificare il livello di knockdown mediante analisi western blot. I livelli di PAI-1 sono mostrati qui.

Per isolare i monociti del sangue periferico, preparare prima tre provette da 50 millilitri contenenti 15 millilitri di soluzione a gradiente di densità. Quindi utilizzare un pipettatore impostato sul flusso gravitazionale per sovrapporre lentamente 30 millilitri di sangue diluito sulla soluzione del gradiente di densità. Centrifugare in un rotore oscillante a 400 g a temperatura ambiente senza interruzioni per 25 minuti.

Dopo la centrifugazione, smaltire lo strato superiore e trasferire lo strato intermedio contenente le cellule mononucleate del sangue periferico in una nuova provetta da 50 millilitri e aggiungere PBS integrato con FBS fino a 50 millilitri. Centrifugare a 120 g a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante contenente piastrine.

Dopo la centrifugazione finale e la raccolta, risospendere il pellet in 50 millilitri di PBS integrato con FBS e contare le cellule mononucleate del sangue periferico utilizzando un emocitometro. Dopo aver centrifugato le cellule a 120 g, risospendere il pellet in PBS integrato con FBS contenente un millimolare di EDTA fino a una concentrazione finale di 50 milioni di cellule per millilitro. Quindi iniziare ad arricchire per i monociti aggiungendo 50 microlitri di cocktail di anticorpi a selezione negativa per ogni millilitro di sospensione cellulare e mescolare.

Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di microsfere magnetiche per millilitro, mescolare e incubare per altri 10 minuti. Quindi aggiungere PBS con FBS e EDTA fino a 25 millilitri e posizionare la miscela mononucleare del sangue periferico in un magnete che può ospitare un tubo da 50 millilitri.

Dopo l'incubazione per 10 minuti a temperatura ambiente, le microsfere magnetiche aderiranno alle pareti del tubo e sequestreranno le cellule non monocitiche dalla soluzione. Utilizzare una pipetta da 25 millilitri per rimuovere la soluzione contenente monociti dalla provetta, facendo attenzione a non toccare i lati della provetta con la pipetta. Dopo la centrifugazione e la rimozione del surnatante, risospendere il pellet contenente monociti in terreno RPMI contenente il 10% di FBS privo di TET e l'1% di pen-streptococco.

Iniziare il test seminando 40.000 cellule HCT-116 o MDA-MB-231 in un volume di 0,5 millilitri nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti in triplicato. Il giorno successivo, aggiungi un filtro al pozzo. Quindi piastra 8.000 monociti in un volume di 0,3 millilitri su un inserto di membrana porosa trattato con BSA posizionato sulla parte superiore delle cellule tumorali e incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Raccogliere gli inserti dopo 48 ore. Scrollarsi di dosso il terreno in eccesso e passare con precisione la superficie interna con un applicatore con punta di cotone per rimuovere le cellule che non sono migrate. Colorare il lato esterno dell'inserto utilizzando il metodo Wright-Giemsa.

Dopo aver montato i filtri con i macrofagi migrati rivolti verso l'alto, visualizzare i vetrini utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a 20 potenze. Scattare foto di nove campi per filtro e contare i macrofagi migrati in tutti i campi. Il saggio della camera di Boyden è stato utilizzato per quantificare la migrazione dei monociti verso le cellule tumorali.

In presenza di cellule di carcinoma mammario MDA-MB-231, la migrazione dei monociti è stata inibita del 33% dopo l'aggiunta di doxiciclina alla co-coltura per sottoregolare PAI-1. Questa inibizione della migrazione dei monociti era più pronunciata in presenza di cellule tumorali del colon HCT-116 dove il knockdown di PAI-1 mediante somministrazione di doxiciclina ha ridotto la migrazione dei monociti del 74%. Risultati simili sono stati osservati quando le condizioni medie per le cellule tumorali trattate con doxiciclina sono state posizionate sul fondo dei pozzetti come fonte di chemioattrattivi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come utilizzare un sistema tet-on funzionale per il knockdown dell'espressione genica nelle linee cellulari tumorali umane per studiare l'effetto chemioattrattivo della proteina PAI-1 secreta derivata dal cancro sui monociti umani.