A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare l'imaging su cellule vive per valutare le decisioni sul destino cellulare dopo il trattamento con il farmaco anti-mitotico paclitaxel. Questo metodo ci consente di visualizzare come le singole cellule rispondono a diverse dosi del farmaco anti-mitotico paclitaxel. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una grande quantità di informazioni su singole cellule o intere popolazioni che non è possibile ottenere dall'imaging a cellule fisse o dai saggi basati sulla popolazione.

A dimostrare questo metodo è Marc Vittoria, un dottorando presso il Laboratorio Ganem. Per iniziare, pulire il fondo di vetro della capsula di imaging con un detergente ottico per rimuovere eventuali impronte digitali o polvere che potrebbero interferire con l'imaging. Utilizzare una quantità sufficiente di detergente ottico per bagnare l'intera superficie del vetro.

Posizionare la piastra con fondo di vetro con le cellule sul tavolino del microscopio nell'adattatore della piastra di imaging. Rimuovere il coperchio di plastica dal piatto e coprire il piatto con una camera con piano di vetro. Assicurarsi che la camera sia dotata di una valvola per consentire un flusso d'aria costante costituito dal 5% di anidride carbonica.

Per umidificare il 5% di anidride carbonica, il gas viene fatto fluire attraverso un tubo inserito in un alloggiamento sterile a bagnomaria. Ciò consente al gas di equilibrarsi al 95% di umidità. Avviare e calibrare lo stadio codificato utilizzando il programma software che controlla il microscopio.

Ciò garantirà coordinate XY accurate e preverrà la deriva focale. Quindi, eseguire l'illuminazione Kohler sollevando il condensatore e chiudendo l'apertura in modo che il campo sia scuro. Abbassare il condensatore fino a quando non è visibile una forma esagonale nitida di luce.

Quindi, utilizzare le viti di centraggio per centrare l'esagono di luce nel campo visivo. Una volta visibile la forma esagonale, aprire l'apertura fino a quando l'intero campo visivo non è illuminato. Attiva la messa a fuoco automatica del microscopio per assicurarti che tutti i punti siano mantenuti a fuoco per tutta la durata dell'esperimento.

Utilizzare il software di acquisizione per selezionare diversi campi visivi non sovrapposti da ciascun pozzetto per l'imaging. Selezionare le regioni di imaging in cui le cellule hanno aderito bene al fondo del vetro e sono tra il 50 e il 70% confluenti. Evitare le aree di celle raggruppate, in quanto ciò renderà difficile l'analisi successiva.

Per valutare il destino delle cellule mitotiche, impostare il software di imaging in modo che raccolga immagini da ciascun campo visivo selezionato ogni 10 minuti per un massimo di 96 ore. La mitosi imperturbata dura da 20 a 40 minuti, e quindi intervalli di 10 minuti forniranno un campionamento sufficiente per identificare quando le cellule si dividono. Per identificare la rottura nucleare, che è un evento transitorio, acquisire immagini ogni cinque minuti.

Identificare le cellule che entrano in mitosi mediante l'osservazione dell'arrotondamento cellulare, utilizzando ottiche a contrasto di fase e/o condensazione cromosomica, utilizzando l'istone umano H2B fuso con GFP. Sia l'arrotondamento cellulare che la condensazione cromosomica sono facilmente visualizzabili a occhio. Annotare il momento in cui la cellula entra in mitosi.

Continua a seguire la cella fino a quando non raggiunge il suo destino. Le cellule di controllo dovrebbero allineare in modo efficiente i loro cromosomi ed entrare in anafase entro un'ora. Visualizzare l'anafase mediante ottica a contrasto di fase quando la cellula inizia a pizzicarsi in due o attraverso la visualizzazione di cromosomi che si muovono verso i poli marcati con H2B-GFP.

Annotare il momento in cui la cellula subisce l'anafase. Al contrario, le cellule trattate con paclitaxel rimarranno arrotondate con cromosomi condensati per diverse ore. Identificare le cellule mitoticamente arrestate che subiscono la morte cellulare.

Le cellule che muoiono durante la mitosi vengono visualizzate mediante microscopia a contrasto di fase, poiché le cellule si bleberanno, si restringeranno e/o si romperanno. Se si esegue l'imaging H2B-GFP, i cromosomi si frammentano anche durante la morte cellulare. Identificare le cellule mitoticamente arrestate che subiscono uno slittamento cellulare.

Le cellule che subiscono uno slittamento mitotico vengono osservate mediante microscopia a contrasto di fase, poiché si appiattiscono di nuovo in interfase e decondensano i cromosomi senza subire anafase. Queste cellule danno origine a grandi cellule tetraploidi che sono spesso multinucleate. Continua a tracciare le celle dal campo visivo originale.

Una volta tracciato un intero campo visivo, spostati su un campo visivo separato acquisito dallo stesso pozzetto e continua a tracciare le cellule. Valutare il destino cellulare a seguito di slittamento mitotico utilizzando la linea cellulare epiteliale pigmentata retinica non trasformata e cromosomicamente stabile che esprime il sistema FUCCI. Per confermare che il sistema FUCCI funzioni correttamente, verificare che le cellule di controllo alternino l'espressione delle proteine fluorescenti rosse e verdi in modo appropriato dall'analisi dei dati di imaging delle cellule vive.

Le cellule di controllo dovrebbero passare dall'esibire una fluorescenza rossa interamente nucleare all'esibire una fluorescenza verde interamente nucleare durante l'interfase mentre le cellule progrediscono dalla fase G1 alla fase S. Le cellule dovrebbero continuare a mostrare fluorescenza verde per tutto il completamento della mitosi. Immediatamente dopo la mitosi, le cellule dovrebbero nuovamente mostrare una fluorescenza completamente rossa durante l'interfase.

Identificare le cellule arrestate nella mitosi utilizzando la microscopia a contrasto di fase e tracciarle fino a quando non subiscono uno slittamento mitotico. Le cellule che escono dalla mitosi e tornano in interfase passeranno dall'esibizione di una fluorescenza verde durante la mitosi a una fluorescenza rossa durante la fase G1. Traccia queste cellule scivolate utilizzando l'imaging a contrasto di fase ed epifluorescente a occhio per valutare il loro destino cellulare.

Identificare le cellule che rientrano nel ciclo cellulare. Queste cellule sono identificate dal cambiamento da rosso a verde nell'espressione della fluorescenza utilizzando il sistema FUCCI che indica la transizione G1/S. Identificare le cellule che subiscono l'arresto del ciclo cellulare G1.

Queste cellule sono identificate dall'espressione di una fluorescenza rossa che persiste per più di 24 ore. Inoltre, identifica le cellule che muoiono in interfase. Queste cellule sono identificate dalla rottura, dal blebbing e dal restringimento delle cellule utilizzando l'imaging a contrasto di fase.

Immagine delle celle come prima. Il segnale di fluorescenza dalla ripetizione tandem del dimero di RFP fuso a un segnale di localizzazione nucleare, o TDRFP-NLS, e H2B-GFP dovrebbe co-localizzarsi durante l'interfase. La mitosi viene visualizzata mediante arrotondamento cellulare utilizzando ottiche di fase e/o condensazione cromosomica mediante H2B-GFP.

Dopo la mitosi, l'involucro nucleare si romperà e il segnale TDRFP-NLS diventerà citoplasmatico. Dopo la mitosi, l'involucro nucleare si riformerà nelle cellule figlie e il segnale TDRFP-NLS diventerà nucleare. Tracciare le cellule figlie durante la successiva interfase mediante imaging di cellule vive.

Identificare gli eventi di rottura nucleare osservando un'esplosione transitoria di TDRFP-NLS localizzato nucleare nel citoplasma circostante. In pochi minuti, l'involucro nucleare sarà riparato e il TDRFP-NLS sarà rilocalizzato nel nucleo. Qui sono mostrate immagini rappresentative di una cellula scivolata che diventa verde ed entra nella fase S dopo essere scivolata dal trattamento con paclitaxel.

La maggior parte delle cellule che sono sfuggite al trattamento con paclitaxel ha subito un arresto G1/G0 e sono rimaste rosse per più di 48 ore senza subire apoptosi. Anche le cellule che sono rosse dopo lo slittamento subiranno l'apoptosi, come rappresentato da questa immagine. La rottura dell'involucro nucleare aumenta nelle cellule trattate con paclitaxel.

Le cellule TDRFP-NLS e H2B-GFP trattate con paclitaxel 10-nanomolare hanno un'aumentata rottura nucleare in cui RFP sarà delocalizzato dal nucleo al citoplasma nelle cellule interfasiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una solida comprensione di come eseguire l'imaging a lungo termine di cellule vive per valutare il destino cellulare in risposta a vari trattamenti farmacologici.