Name: Un metodo per la determinazione e la simulazione di permeabilità e la diffusione in un modello 3D del tessuto in una membrana inserire sistema per piastre multi-pozzetto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Scopri come determinare i coefficienti di permeabilità e diffusione in modelli 3D di pelle utilizzando un sistema di membrane in piastre multi-pozzetto. Questa tecnica avanzata ottimizza le simulazioni computazionali per applicazioni farmaceutiche e cosmetiche.

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Questo lavoro è stato creato con il sostegno finanziario dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sotto grant No. PO413/12-1 e LA 1028/7-1.

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Uwe Marx è l'amministratore delegato e azionista e Gerd Lindner è un azionista di TissUse GmbH, società di produzione e commercializzazione della tecnologia MOC. Altri autori non dichiarano alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo libro.

Questo studio documenta un metodo sviluppato per quantificare la permeazione attraverso un tessuto-costrutto ingegnerizzato su una membrana. Permeazione di sostanze con diverse dimensioni molecolari attraverso gel dell'agarosi in primo luogo è stato esaminato per testare e convalidare il metodo e la simulazione corrispondente. È noto che più piccole molecole permeano più velocemente attraverso una maglia di matrice (fatta eccezione per l'effetto in gel filtrazione mediante cromatografia di permeabilità). Osservazioni simili sono state fatte con gli esperimenti di esclusione dimensionale delle sostanze attraverso la sclera26, membrana epidermica umana27, pelle umana17e ratto pelle28. Una correlazione inversa tra coefficienti di permeabilità e il corrispondente raggio di Stokes (il raggio di una sfera duro che si muove con lo stesso tasso di diffusione come le molecole descritte, solitamente più piccole rispetto al raggio efficace della molecola) ha dimostrato 26 , 28e una relazione simile è stato osservato negli esperimenti con sostanze di diverse dimensioni molecolari. Tracciando i coefficienti di permeabilità nel raggio di 1/Stokes, è stata trovata una correlazione lineare sopra i quattro gruppi con la più piccola dimensione molecolare (R2 = 0.93) (Figura 6). Ciò indica che i coefficienti di permeabilità simulato con il metodo suggerito sono in un intervallo realistico.
L'errore di 46.15% negli esperimenti è leggermente più grande rispetto a quanto indicato per gli esperimenti di permeabilità con Franz diffusione cellulare sistema10. Una possibile spiegazione potrebbe essere la distribuzione di dimensione di fluorescina-isotiocianato-destrano, che è discussa più avanti.
Il metodo descritto presenta importanti vantaggi rispetto ai metodi che utilizzano il sistema di celle di diffusione di Franz. In primo luogo, l'installazione è più compatto; gli esperimenti vengono eseguiti direttamente in un sistema di ﬁssaggio della membrana, che ha la scala di una piastra commerciale ben (∼ 13 cm x 8,5 cm). In questo modo più campioni essere eseguiti contemporaneamente, considerando che una cella di diffusione di Franz separata è necessaria per ogni campione. In secondo luogo, la permeabilità di un modello di pelle può essere misurata direttamente nell'inserto della membrana, dove avviene la coltivazione. Utilizzando celle di diffusione di Franz, i campioni devono essere portati fuori e montati sul sistema, che è più ingombrante per i piccoli campioni ed è anche più che richiede tempo.
Esperimenti di permeazione con matrici di collagene delle cellule ha mostrato che questo metodo può essere applicato con successo ai sistemi delle cellule-seminato. Il modello qui presentato è stato verificato per i modelli di pelle; Tuttavia, il metodo può essere applicato ad altri tipi di colture di cellule organiche, per esempio, malattie renali o epatiche.
In questo studio, è stato utilizzato un modello di collagene-cellula in cui le cellule HaCaT coperto completamente la superficie del modello (vedere Figura 5). Ciò ha condotto ad una riduzione del coefficiente di permeabilità, dimostrando che il metodo è abbastanza sensibile per distinguere il coefficiente di permeabilità tra un modello di collagene-cellulare con e senza uno strato di HaCaT. Idealmente, un modello della pelle dovrebbe costituire una barriera, che si avvicina l'epidermide di una vera e propria pelle29, ed è quindi importante verificare la qualità (ad es., edificio del derma, epidermide) del modello della pelle prima dell'uso effettivo. Lo sviluppo di un modello di pelle possa essere visualizzato con tecniche di colorazione e quantificato dal rilevamento di pelle collagene e proteine30,31,32. Il coefficiente di permeabilità può anche essere un fattore importante per valutare lo sviluppo del modello della pelle, ma sono necessari ulteriori esperimenti per confermare questo. Come accennato in precedenza, questo metodo consente l'esecuzione di campioni multipli in parallelo. È anche possibile prelevare campioni durante la coltivazione per misurare la permeabilità e quindi osservare lo sviluppo di questo parametro del modello della pelle.
Si deve osservare che la permeabilità è misurata attraverso un gel/collagene-cella-modello e una membrana contemporaneamente. Il coefficiente di permeabilità rilevati è specifico del sistema, per cui i risultati dei modelli differenti della pelle possono essere paragonati soltanto quando si utilizza l'inserto della membrana stessa. Inoltre, il modello di pelle ha bisogno coprire l'area intera coltivazione al fine di garantire che la sostanza in esame permei solo attraverso il modello e non adiacente ad esso, che potrebbero indurre errori nella permeabilità misurata. Un altro aspetto che dovrebbe essere considerato in futuro esperimenti è l'ambiente naturale che circonda la pelle. Normalmente, la temperatura della superficie della pelle è inferiore rispetto la regione interna, che può influenzare le condizioni di permeazione.
Al fine di allineare gli esperimenti di laboratorio con simulazioni al computer, è stato presentato un metodo che consente l'ottimizzazione dei parametri per la simulazione applicata. Simulazioni sono state trovate in concomitanza anche con i dati sperimentali per sostanze con piccole dimensioni molecolari. Tuttavia, sono stati osservati scostamenti tra dati sperimentali e simulazione per sostanze con dimensioni molecolari. Polisaccaride grandi molecole possono aumentare l'attrito e rallentare il processo di diffusione in un gel. Questo effetto provoca diffusione anomala, che è un motivo possibile per la deviazione fra sperimentale e simulazione valori33,34. Un'altra spiegazione potrebbe essere la presenza di particelle più piccole o più grandi in fluorescina-isotiocianato-destrano. Il produttore specifica il peso molecolare della sostanza come la dimensione media con un determinato intervallo, che permette grandi e piccole particelle di essere presenti. È anche poco chiaro come disperse queste sostanze sono, come le più piccole particelle permeano più velocemente attraverso il gel e il canale di fluido. È possibile estendere la simulazione per considerare questi diffusione e gli effetti di attrito.
L'esperimento di permeabilità e la simulazione sono stati sviluppati per l'uso in un 2-oC. Con l'aiuto della simulazione, questo metodo sperimentale possa essere trasferito direttamente ai più sofisticate messe a punto sperimentali. Ad esempio, la simulazione di sistema inserto di membrana possa essere facilmente trasferita alla geometria di un 2-OC o ad altri sistemi con configurazioni simili. Questa opzione di modulare la simulazione può essere utilizzata per supportare la progettazione di futuri esperimenti. Inoltre, gli effetti collaterali come evaporazione, anormale diffusione e gli effetti della membrana può essere integrati per migliorare la simulazione, migliorando così la precisione. Il programma di simulazione dà l'opportunità di modificare o migliorare l'equazione di simulazione, nonché a integrare altri moduli fisici al fine di indagare altri aspetti dello sviluppo del modello di pelle. Un esempio è la simulazione della produzione di lattato e consumo di glucosio in un modello cellulare di collagene.
Un aspetto particolarmente interessante nella sperimentazione delle sostanze mediche è come le sostanze sono distribuite in un sistema di organo-on-a-chip. Il parametro di simulazione e permeabilità mio aiuto per rispondere a domande quali quanto velocemente una sostanza permea nel sistema e che la concentrazione sarà disponibile per altri tessuti in un chip multi-organ. Questo metodo può sostenere e promuovere lo sviluppo e la sperimentazione di tali sistemi organo-on-chip.

Organo-tipiche culture 3D sono diventati potenti strumenti per lo sviluppo di farmaci e sostanza test1. A questo proposito, modelli di pelle umana sono di particolare interesse a causa di requisiti normativi, come quelli nel settore della cosmetica. Successivamente hanno portato allo sviluppo di numerosi modelli 3D della pelle, per uso sia su loro come culture di singolo-organo in piastre multi-pozzetto o in multi-organ-friggere, in combinazione con organo ulteriori modelli, ad esempio, il fegato2.
Per quanto riguarda la coltivazione di un equivalente di pelle, l'interfaccia aria-liquido (ALI) è un elemento essenziale per differenziazione epidermica corretta3. Inserti di cultura cellulare composti da un vaso con una membrana permeabile liquido nella parte inferiore vengono in genere utilizzate per stabilire un ALI. ALIs sono ampiamente utilizzati nei modelli di pelle disponibile nel commercio come EpiDerm4, Phenion5ed Episkin6, per la cultura di modelli di pelle con dimensioni da 96 pozzetti (4,26 mm di diametro) fino a 12-pozzetti (12,2 mm di diametro). Il metodo qui descritto determina la permeazione delle sostanze in un sistema di inserimento della membrana.
Il coefficiente di permeabilità è un parametro significativo per valutare la qualità di qualsiasi modello di pelle coltivata rispetto alla pelle nativo5e viene utilizzato per valutare quanto rapidamente la migrazione di sostanze attive attraverso la pelle. Soprattutto se farmaci o cosmetici prodotti devono essere applicati alla pelle, questo parametro è essenziale per capire quando precisamente gli agenti attivi passano attraverso di essa. Una simulazione può aiutare ulteriormente per prevedere il comportamento del sistema e successivamente ridurre il necessario sforzo sperimentale che richiede tempo, soprattutto quando un grande insieme di sostanze è coinvolto.
La cella di diffusione di Franz è stato-of-the-art per permeazione esperimenti con la pelle e pelle modelli5,6,7,8,9. Questo dispositivo è costituito da due vani con un campione fisso (barriera di diffusione) in mezzo. La sostanza da saggiare viene applicata direttamente alla parte superiore del campione (compartimento donatore) e la concentrazione del composto che permea può essere rilevata sul vano opposto (accettore). Sul versante acceptor, temperatura costante e la concentrazione di sostanza omogenea sono garantiti attraverso una camera a temperatura e un agitatore magnetico. Campioni possono essere prelevati da un braccio di campionamento sul lato accettore della cella Franz. Con una gamma di altezza tra 19 e 179 cm, questo sistema è relativamente grande10,11. Un altro metodo per la determinazione dei coefficienti di diffusione nei tessuti e sostanze in gel è FRAP. Questa tecnica utilizza il principio di sbiancamento fluorescente etichettati particelle in gel e quindi determinare il tempo di recupero della zona sbiancato per calcolare il coefficiente di diffusione12,13,14.
Inoltre, Fourier transform-spettroscopia all'infrarosso (FTIR) può essere utilizzata per rilevare il movimento delle particelle con assorbanza della luce a raggi infrarossi al fine di determinare il processo di permeazione delle sostanze in pelle15,16. Tuttavia, questi o altri metodi di imaging (ad es., spettroscopia di fluorescenza del due-fotone correlazione17) deve necessariamente costare strumenti intensivi.
In questo articolo, un metodo è presentato direttamente misurare la permeabilità di una barriera all'interno di un sistema di inserimento della membrana, dove un modello di pelle può essere coltivato. Questo metodo consente esperimenti di permeabilità deve essere eseguito con un gran numero di piccoli campioni (ben dimensioni fino a mm 4,26) in un sistema compatto. Questo è in contrasto con la cella di diffusione di Franz, dove un dispositivo separato è necessaria per ogni sonda, che deve essere montato sul dispositivo ed è difficile da realizzare per i piccoli campioni (dimensioni mm 4,26). Inoltre, poiché il metodo non richiede strumentazione principali (ad es., un microscopio confocale o multifotonica), si ottiene una riduzione di tempo e costo.
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in membrana microporosa inserire sistemi con un campione (barriera) costituiti da gel di agarosio o un modello di cellulare di collagene stabilito sulla membrana. Sostanze fluorescenti (donatore) con diverse dimensioni molecolari sono state applicate alla parte superiore del campione, e la concentrazione della sostanza permeata è stata rilevata sul fondo (accettore) utilizzando un lettore di fluorescenza (Vedi Figura 1). Al fine di validare il metodo e verificare l'esattezza di questa simulazione, gel dell'agarosi erano prodotto e utilizzati come una barriera. Idrogeli sono generalmente utilizzati per lo studio dei processi di diffusione e permeazione in mezzo poroso a scienze biologiche13. Il metodo è stato poi testato in un sistema cellulare-seminato costituito da una matrice di collagene dei fibroblasti primari e cellule adulte umane basse calcio alte temperatura cheratinociti (HaCaT) (modello di cellula-matrice), che è una pelle semplificata modello18,19 .
Inoltre, il processo di permeazione è stato simulato mediante simulazioni di flusso con fluidodinamica computazionale. Si è constatato che, per mezzo di ottimizzazione dei parametri, il coefficente di diffusione potrebbe essere calcolato dai dati sperimentali. In generale, questa simulazione offre diverse applicazioni; per esempio, è possibile prevedere un processo di permeazione basato su esperimenti di brevi e la simulazione può ridurre significativamente il numero di esperimenti.
Metodo sperimentale e simulazione sono state progettate per l'applicazione a un organo-on-a-chip sistema1,20,21, specificamente il 2-organo-chip (2-OC) sviluppato commercialmente1,22, 23,24,25. In linea di principio, il processo di permeazione di qualsiasi modello di organo basato su sistemi di membrana inserti può essere descritto in questo modo.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>Polvere ad alta risoluzione</td></tr><tr><td></td><td>Collagene Serva</td><td>47256.01</td><td>Soluzione di collagene R 0,4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>Alto glucosio con L-Glutammina</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Siero fetale di vitello</td></tr><tr><td>Fluoresceina Sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina Isotiocianato-destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluoresceina Isotiocianato-destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluoresceina Isotiocianato-destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluoresceina Isotiocianato-destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific 14170120</td><td></td><td>senza calcio, senza magnesio , con rosso fenolo</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>PBS granulato</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>compresse</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari Transwell</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 pozzetti, 0,4 & micro; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari Transwell</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 pozzetti, 0,4 & micro; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>con EDTA</td></tr></tbody></table>

un metodo per la determinazione e la simulazione di permeabilità e la diffusione in un modello 3d del tessuto in una membrana inserire sistema per piastre multi-pozzetto

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro coltivati della pelle modelli sono diventati sempre più rilevanti per le applicazioni farmaceutiche e cosmetiche e sono utilizzati anche nello sviluppo di farmaci, nonché la sostanza test. Questi modelli sono per lo più coltivati in sistemi di membrana-inserti, loro permeabilità verso sostanze differenti, essendo un fattore essenziale. Metodi applicati per la determinazione di questi parametri in genere, di solito richiedono campioni di grandi dimensioni (ad es., Franz diffusione cell) o laboriosa attrezzature (ad es., recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP)). Questo studio presenta un metodo per determinare i coefficienti di permeabilità direttamente in sistemi di membrana-inserti con diametri di 4,26 e 12,2 mm (zona di coltura). Il metodo è stato convalidato con agarosio e gel del collagene come pure un modello cellulare di collagene che rappresentano modelli di pelle. I processi di permeazione di sostanze con diverse dimensioni molecolari e permeazione attraverso modelli differenti delle cellule (costituiti da gel di collagene, fibroblasti e HaCaT) sono stati accuratamente descritti.
Inoltre, per supportare il metodo sperimentale di cui sopra, è stata stabilita una simulazione. La simulazione si inserisce i dati sperimentali bene per sostanze con piccole dimensioni molecolari, fino a 14 x 10-10 m raggio di Stokes (4.000 MW), ed è quindi uno strumento promettente per descrivere il sistema. Inoltre, la simulazione può ridurre considerevolmente gli sforzi sperimentali ed è abbastanza robusta per essere esteso o adattato alle configurazioni più complesse.

Esperimenti di permeabilità in una membrana di 96 pozzetti inserire sistema con gel di agarosio al 2% come una barriera sono stati condotti al fine di valutare l'accuratezza di una simulazione. Sale sodico della fluorescina (NaFl) e della fluorescina isotiocianato-destrani (FD) sono stati utilizzati per verificare l'impatto della dimensione molecolare della sostanza diffondente da 5 x 10-10 m fino a 45 x 10-10 m raggio di Stokes (376.27-40.000 mol wt). Ottimizzazione dei parametri nativo della simulazione è stato utilizzato per la simulazione di dati sperimentali in forma.
A tal fine, alle pendici del solo le parti lineari della permeabilità simulate sono state confrontate con i risultati sperimentali. Per piccole dimensioni molecolari, simulazione e dati sperimentali erano in buon accordo con 99,2% per NaFl e 80,2% per FD 4.000 (Vedi Figura 4a e Figura 4b). Dimensione molecolare maggiore generato deviazioni più alte risultati correlazioni di 50,5% per 10.000 FD, 79,7% per 20.000 FD e 53,6% per FD 40.000. Progressione della curva nelle simulazioni hanno mostrato un ritardo all'inizio e un aumento più forte nel corso dei grafici (Vedi Figura 4 c–4e).
Coefficienti di permeabilità e i coefficenti di diffusione simulato sono mostrati in tabella 4. Il coefficiente di permeazione diminuisce con l'aumento di dimensioni molecolari. Deviazione standard era tra 0,08 x 10-8 m/s e 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), che ha corrisposto ad un errore assoluto di tra 4,18% e 46.15%. Esperimenti con le più grandi molecole hanno mostrato un maggiore errore assoluto. I coefficenti di diffusione simulato si comportavano molto similmente ai coefficienti di permeabilità sperimentale. Sostanze con raggi più grandi di Stokes ha mostrato i coefficenti di diffusione decrescente e l'errore assoluto ha variato fra 9,09% e 18,46% (N = 3).
Negli esperimenti ulteriori permeazione, quattro tipi di modello delle cellule di collagene differenti sono stati utilizzati come barriere in una membrana 12-pozzetti inserire sistema. Questi modelli comprendono un modello senza cellula e un modello di cellulare con diverse combinazioni di fibroblasti primari nel gel di collagene e HaCaT sulla superficie. Sono state utilizzate le seguenti combinazioni: collagene (col.) come un modello senza cellula, collagene + fibroblasti (col. + F.), HaCaT (col. + H.), + fibroblasti e collagene, collagene + HaCaT (col. + F. + H.). Sale di sodio di fluoresceina con DMEM + 10% FCS è stato utilizzato come sostanza donatrice. Per immagine analisi del modello di cella del collagene, colorazione con ematossilina ed eosina (lui) è stato usato. Questa colorazione è stato fatto utilizzando il protocollo del produttore. In Figura 5, è indicata tale una macchia con un modello rappresentativo di col. + F. + h... L'HE macchie leggermente la struttura del tessuto della matrice del collagene. I fibroblasti si trovano nella matrice e i nuclei dei fibroblasti e cellule HaCaT sono colorati in viola scuro. Sulla parte superiore della matrice di collagene, c'è un livello contenente molti nuclei, che dovrebbero essere i nuclei di HaCaTs, creazione di un livello di inclusione nella parte superiore del modello.
In tabella 5, coefficienti di permeazione sperimentale e i coefficenti di diffusione simulato sono elencati. Una tendenza può essere visto per la maggior parte dei modelli con HaCaT, che hanno coefficienti di permeazione/diffusione inferiori rispetto ai modelli senza HaCaT. L'errore assoluto dei coefficienti di permeazione è 10,9-24,4% e per la diffusione coefficienti 5,2% - 12,9%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> Figura 1: Vista laterale dell'esperimento in una membrana permeabilità inserire sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> Figura 2: grafico esemplare di un esperimento di permeabilità. La concentrazione di acceptor viene tracciata nel corso del tempo. Due linee tratteggiate staffa parte quasi lineare del grafico. La pendenza della parte lineare viene utilizzata per determinare il coefficiente di permeabilità. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> Figura 3: geometria e mesh della membrana inserire il sistema nella simulazione. (un) geometria della membrana 96 pozzetti sistema di inserimento. sistema di ﬁssaggio (b) geometria della membrana 12-pozzetti. sistema di ﬁssaggio (c), maglia della membrana 96 pozzetti. sistema di ﬁssaggio (d), maglia della membrana 12-pozzetti. (e) sistema di inserti di sezione trasversale e parametri della membrana. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> Figura 4: confronto tra i dati sperimentali da un esperimento di permeazione per la simulazione ottimizzata. sale di sodio (un) della fluorescina, (b) della fluorescina isotiocianato-destrano 4.000 mol WT, (c), 10.000 mol WT, (d), 20.000 mol WT e (e) 40.000 mol WT <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> Figura 5: rappresentante HE colorazione di un modello di cella di collagene (collagene, fibroblasti + HaCaT). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> Figura 6: coefficiente di permeabilità in funzione del raggio 1/Stokes utilizzando sale sodico della fluorescina e della fluorescina isotiocianato-destrano in una membrana di 96 pozzetti inserire sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Experession per sistema ben 96 mm</td>
			<td>Experssion per sistema 12-pozzetti in mm</td>
			<td>Descrizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5,65 [mm]</td>
			<td>14,7 [mm]</td>
			<td>Diametro del pozzo</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4,26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>Diametro della membrana</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [mm]</td>
			<td>21,97 [mm]</td>
			<td>Diametro di Acceptor</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>Heigh della barriera</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>Distanza tra bene e inferiore</td>
		</tr>
<tr>
<td>olly</td>
			<td>4.73 [mm]</td>
			<td>5,24 [mm]</td>
			<td>Alta: l'accettore</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Profondità di immersione</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>Raggio della sfera di immersione+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>R_Z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-posizione della palla immersione+
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: parametri di geometria per la simulazione di "Trasporto di specie chimiche". + Solo per essere usato per la simulazione di agarose gel nella membrana ben 96 inserire sistema.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Espressione</td>
			<td>Valore</td>
			<td>Descrizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Concentrazione di Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 [mg/ml] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>0,5 mol/m2</td>
			<td>Concentrazione di FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>0,2 mol/m2</td>
			<td>Concentrazione di FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0,1 mol/m2</td>
			<td>Concentrazione di FD 20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>0,05 mol/m2</td>
			<td>Concentrazione di FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1E-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>1E - 9m/s2</td>
			<td>Coefficente di diffusione d'acqua d'impasto</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Parametri fisici per la simulazione di "Trasporto di specie chimiche".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Espressione</td>
			<td>Descrizione</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Definizione della concentrazione accettore</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>Cambiamento di fattore d</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Parametri per la simulazione di "Ottimizzazione".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Permeare</td>
			<td>Coefficiente di permeabilità (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coefficente di diffusione (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Raggio di Stokes di permeato (m) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4.79 ± 0,20</td>
			<td>1,94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4.000</td>
			<td>2.37 ± 0,31</td>
			<td>0.65 ± 0,12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1,67 ± 0,47</td>
			<td>0.22 ± 0.02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20.000</td>
			<td>0.65 ± 0,30</td>
			<td>0,29 ± 0,04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40.000</td>
			<td>0,27 ± 0,08</td>
			<td>0,14 ± 0.02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: coefficiente di permeabilità e la diffusione di sostanze con diverso raggio di Stokes tramite gel di agarosio al 2% + membrana in una membrana di 96 pozzetti inserire sistema. (sale di sodio di fluorescina = FL. So., fitc destrano = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modello</td>
			<td>Coefficiente di permeabilità (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coefficente di diffusione (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col.</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0,06</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + F.</td>
			<td>1.77 ± 0,38</td>
			<td>0.93 ± 0,12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + H.</td>
			<td>1.64 ± 0,40</td>
			<td>0.96 ± 0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col. + F. + H.</td>
			<td>1,65 ± 0.18</td>
			<td>0.88 ± 0,11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5: coefficiente di permeabilità e la diffusione di sale sodico della fluorescina attraverso un modello di cellulare di collagene in un 12-membrana ben inserire sistema (col. = collagene, F. = fibroblasto, H. = HaCaT).

Un metodo per la determinazione della permeabilità in una membrana inserire sistema per piastre multi-pozzetto e sono presentati in silico ottimizzazione dei parametri per il calcolo dei coefficenti di diffusione mediante simulazione.

Un metodo per la determinazione e la simulazione di permeabilità e la diffusione in un modello 3D del tessuto in una membrana inserire sistema per piastre multi-pozzetto

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è determinare la permeabilità e i coefficienti di diffusione di modelli di pelle 3D in un piccolo sistema di inserti a membrana. Questi argomenti possono aiutare a rispondere a domande chiave sull'ingegneria 3D dei tessuti cutanei per applicazioni farmaceutiche e cosmetiche in cui la permeabilità e il coefficiente di diffusione sono fattori di qualità essenziali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione diretta di questi coefficienti all'interno di un piccolo inserto multipozzetto.Il piccolo sistema di inserti a membrana nella simulazione può essere ulteriormente modificato per l'uso in organi sui dispositivi navali e altre applicazioni che utilizzano sistemi di inserti a membrana. Per preparare un gel di agarosio, iniziare applicando 28,6 microlitri di gel di agarosio liquido a 80 gradi Celsius appena preparato su ciascuna membrana di un sistema di inserti a membrana a 96 pozzetti. Dopo 10 minuti, il gel si sarà solidificato e potrà essere utilizzato per un test di permeabilità.Per preparare un modello cellulare di collagene, mescolare prima 125 microlitri di HBSS e un millilitro di soluzione di collagene R su ghiaccio, quindi neutralizzare con idrossido di sodio. Quindi aggiungere alla miscela 125 microlitri di fibroblasti primari sospesi in terreno completo. E aggiungere 28,6 microlitri della soluzione cellulare risultante a ciascun pozzetto di un nuovo sistema di inserti a membrana a 96 pozzetti.Dopo 30 minuti in un incubatore per colture cellulari, aggiungere 75 microlitri di terreno completo sulla superficie del gel e 300 microlitri di terreno completo sul fondo di ciascun pozzetto per un'incubazione notturna nell'incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, sostituire il terreno con 75 microlitri di cheratinociti umani adulti a basso contenuto di calcio e ad alta temperatura per ogni modello di cellula di collagene e rimettere la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per altri tre giorni. Il quarto giorno, aspirare il terreno dalla superficie del modello cellulare e rimettere la piastra nell'incubatrice per altri sette giorni.Per eseguire un test di permeabilità, erogare 75 microlitri di sostanza donatrice in un sistema modello di interesse con inserto a pozzetti piccoli e aggiungere 300 microlitri di sostanza accettore sul fondo di ciascun pozzetto. Posizionare la piastra su un agitatore a 37 gradi Celsius, 95% di umidità e circa 480 giri/min per cinque ore, trasferendo il sistema di inserti a membrana una volta all'ora in una piastra vuota a 96 pozzetti e misurando la fluorescenza diffusa all'interno dei pozzetti inferiori della piastra sperimentale su un lettore di piastre. Al termine dell'esperimento di permeabilità, apri l'apposito software di modellazione e inizia un nuovo modello.Selezionare la Creazione guidata modello e il modello 3D. Aggiungere Trasporto di specie diluite e fare clic su studia. Quindi seleziona Dipendente dal tempo e fai clic su Fine.In Definizioni globali, fare clic con il pulsante destro del mouse per aggiungere parametri e immettere i parametri geometrici e fisici nella griglia. Imposta la geometria del sistema di inserimento della membrana dagli esperimenti e fai clic con il pulsante destro del mouse su Definizioni per aggiungere due sonde di dominio, selezionando una sonda come dominio accettore e l'altra come dominio donatore. Impostare entrambi i domini su media con un'espressione C e un'unità di mols per metro cubo.E imposta il coefficiente di diffusione sotto le proprietà di trasporto uno e il trasporto di specie diluite. Fare clic con il pulsante destro del mouse su trasporto di specie diluite per aggiungere una seconda proprietà di trasporto due e selezionare la seconda barriera nella selezione del dominio. Sotto il trasporto di specie diluite, per valori iniziali uno, definire la concentrazione come zero.Fare clic con il pulsante destro del mouse su trasporto delle specie diluite per aggiungere un secondo valore iniziale due e selezionare il donatore come terzo dominio. Impostare la concentrazione come concentrazione iniziale della sostanza donatrice fluorescente. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul trasporto delle specie diluite per aggiungere la simmetria uno e selezionare tutte le superfici della selezione del contorno che rispecchiano l'intera geometria.Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla mesh per aggiungere due tetraedri liberi e impostare la seconda barriera come dominio. Fare clic con il pulsante destro del mouse su quello tetraedrico libero per aggiungere la dimensione della mesh predefinita a extra-fine. Nel secondo tetraedro libero, impostare l'accettore e il donatore come domini e la mesh predefinita su più fine.Quindi, in studio uno, fare clic su Calcola per avviare la simulazione. Per adattare il coefficiente di diffusione ai dati generati dalla simulazione di diffusione, aprire il menu Aggiungi psichico e selezionare matematica. Individua l'ottimizzazione e la sensibilità.Seleziona l'ottimizzazione e fai clic su Aggiungi al componente. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sulle definizioni per aggiungere variabili e inserire manualmente le variabili dalla tabella tre. Successivamente, nel menu di accoppiamento dei componenti, fare clic con il pulsante destro del mouse sulle definizioni, aggiungere quella media seguita dall'aggiunta manuale dell'accettore come nome dell'operatore e selezionare quello del dominio.Esporta i dati sperimentali in un nuovo documento di testo. Utilizzare un punto e virgola per separare i dati in colonne e un'interruzione di riga per separare i dati in righe. Fare clic con il pulsante destro del mouse su ottimizzazione per aggiungere l'obiettivo dei minimi quadrati globali e allegare il documento di testo ai dati sperimentali.Fare clic sull'obiettivo globale dei minimi quadrati per definire la prima colonna come colonna temporale uno e la seconda colonna come colonna valore uno. Nella colonna dell'espressione del valore, inserisci la variabile C.Fare clic con il pulsante destro del mouse su ottimizzazione per aggiungere una variabile di controllo globale. E dichiara la ricerca del carattere di sottolineatura D come una variabile con un valore iniziale di uno, un limite inferiore di zero e un limite superiore di 1.000.Fare clic con il pulsante destro del mouse su Study One per aggiungere l'ottimizzazione. E seleziona SNOPT come metodo di risolutore di ottimizzazione. Impostate la tolleranza di ottimalità su uno alla potenza di meno otto.Quindi impostare il coefficiente di diffusione sulla barriera su D.Impostare il tempo di simulazione in studio da zero secondi a 22.000 secondi con un intervallo di 100 secondi e fare clic su Calcola per iniziare l'ottimizzazione dei parametri. L'analisi istologica di un modello cellulare di collagene rivela una leggera colorazione dei fibroblasti all'interno della matrice centrale. Nella parte superiore della matrice di collagene, si può osservare uno strato contenente molti nuclei probabilmente costituiti da cheratinociti umani adulti a basso contenuto di calcio e ad alta temperatura.Utilizzando il sale sodico di fluoresceina e il destrano isotiocianato di fluoresceina, verificare l'impatto della dimensione molecolare della sostanza diffondente rivela che per piccole dimensioni molecolari, la simulazione e i dati sperimentali sono in buon accordo per entrambe le molecole. Dimensioni molecolari più grandi, tuttavia, generano deviazioni più elevate nelle progressioni della curva nelle simulazioni, dimostrando un ritardo all'inizio e un aumento più forte nel corso successivo dei grafi. Infatti, il coefficiente di permeazione diminuisce all'aumentare della dimensione molecolare con i coefficienti simulati che si comportano in modo simile ai coefficienti di permeabilità sperimentali.Da notare che la maggior parte dei modelli che utilizzano cheratinociti adulti umani a basso contenuto di calcio e ad alta temperatura hanno coefficienti di permeazione e diffusione inferiori rispetto ai modelli senza cheratinociti adulti umani a basso contenuto di calcio e ad alta temperatura. Il modello di simulazione del collagene può essere stabilito in 11-12 giorni e la misurazione della permeazione può essere completata in sei ore se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione della procedura, è importante mantenere costanti le condizioni al contorno come la temperatura, il volume di riempimento, la concentrazione della sostanza applicata, l'umidità e il processo della membrana al fine di ridurre la variazione del coefficiente di permeazione.Con l'aiuto di questa simulazione del modulo, lo sforzo sperimentale può essere ridotto e le prestazioni a lungo termine possono essere previste. Può anche essere adattato ad altri dispositivi di permeazione o sistemi di proprietà di organi. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle applicazioni farmaceutiche e cosmetiche, nonché allo sviluppo dell'interazione nell'ingegneria tissutale per esplorare i processi di permeazione per diffusione nei tessuti artificiali.

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Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

La barriera emato-encefalica umana previene selettivamente la penetrazione di molecole idrofile e patogeni nel cervello. Diverse patologie, tra cui meningite e delirio postoperatorio, sono associate a una maggiore permeabilità della barriera emato-encefalica. Qui, descriviamo un modello di coltura cellulare endoteliale per testare la permeabilità della barriera mediante attraversamento microbico.

Analisi della permeabilità della barriera sangue-encefalica attraverso l'attraversamento microbico attraverso le cellule endoteliali microvascolari

Questo protocollo presenta un modello biomimetico 3D con compartimento stromale fibrotico di accompagnamento. Preparato con idrogel fisiologicamente rilevanti in rapporti che imitano le proprietà bio-fisiche della matrice extracellulare stromale, mediatore attivo delle interazioni cellulari, della crescita tumorale e della metastasi.

Un modello biomimetico per il cancro al fegato per studiare le interazioni tumore-stroma in un ambiente 3D con proprietà bio-fisiche tonnibili

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Questo rapporto fornisce protocolli per l'assemblaggio, la coltura cellulare e i saggi sulla piattaforma μSiM per la costruzione di modelli di barriera emato-encefalica.

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

Presentiamo un protocollo per la produzione ad alta produttività di canali vascolari con dimensioni flessibili e modelli desiderati su una piastra standard a sei pozzetti utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D, denominata vessels-on-a-plate (VOP). Questa piattaforma ha il potenziale per far progredire lo sviluppo di terapie per i disturbi associati all'endotelio compromesso.

Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

Scopri come determinare i coefficienti di permeabilità e diffusione in modelli 3D di pelle utilizzando un sistema di membrane in piastre multi-pozzetto. Questa tecnica avanzata ottimizza le simulazioni computazionali per applicazioni farmaceutiche e cosmetiche.

Un metodo per la determinazione e la simulazione di permeabilità e la diffusione in un modello 3D del tessuto in una membrana inserire sistema per piastre multi-pozzetto (Video) | JoVE Journal

Un metodo per la determinazione e la simulazione di permeabilità e la diffusione in un modello 3D del tessuto in una membrana inserire sistema per piastre multi-pozzetto

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