Un metodo per la determinazione e la simulazione di permeabilità e la diffusione in un modello 3D del tessuto in una membrana inserire sistema per piastre multi-pozzetto

L'obiettivo generale di questo protocollo è determinare la permeabilità e i coefficienti di diffusione di modelli di pelle 3D in un piccolo sistema di inserti a membrana. Questi argomenti possono aiutare a rispondere a domande chiave sull'ingegneria 3D dei tessuti cutanei per applicazioni farmaceutiche e cosmetiche in cui la permeabilità e il coefficiente di diffusione sono fattori di qualità essenziali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione diretta di questi coefficienti all'interno di un piccolo inserto multipozzetto.

Il piccolo sistema di inserti a membrana nella simulazione può essere ulteriormente modificato per l'uso in organi sui dispositivi navali e altre applicazioni che utilizzano sistemi di inserti a membrana. Per preparare un gel di agarosio, iniziare applicando 28,6 microlitri di gel di agarosio liquido a 80 gradi Celsius appena preparato su ciascuna membrana di un sistema di inserti a membrana a 96 pozzetti. Dopo 10 minuti, il gel si sarà solidificato e potrà essere utilizzato per un test di permeabilità.

Per preparare un modello cellulare di collagene, mescolare prima 125 microlitri di HBSS e un millilitro di soluzione di collagene R su ghiaccio, quindi neutralizzare con idrossido di sodio. Quindi aggiungere alla miscela 125 microlitri di fibroblasti primari sospesi in terreno completo. E aggiungere 28,6 microlitri della soluzione cellulare risultante a ciascun pozzetto di un nuovo sistema di inserti a membrana a 96 pozzetti.

Dopo 30 minuti in un incubatore per colture cellulari, aggiungere 75 microlitri di terreno completo sulla superficie del gel e 300 microlitri di terreno completo sul fondo di ciascun pozzetto per un'incubazione notturna nell'incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, sostituire il terreno con 75 microlitri di cheratinociti umani adulti a basso contenuto di calcio e ad alta temperatura per ogni modello di cellula di collagene e rimettere la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per altri tre giorni. Il quarto giorno, aspirare il terreno dalla superficie del modello cellulare e rimettere la piastra nell'incubatrice per altri sette giorni.

Per eseguire un test di permeabilità, erogare 75 microlitri di sostanza donatrice in un sistema modello di interesse con inserto a pozzetti piccoli e aggiungere 300 microlitri di sostanza accettore sul fondo di ciascun pozzetto. Posizionare la piastra su un agitatore a 37 gradi Celsius, 95% di umidità e circa 480 giri/min per cinque ore, trasferendo il sistema di inserti a membrana una volta all'ora in una piastra vuota a 96 pozzetti e misurando la fluorescenza diffusa all'interno dei pozzetti inferiori della piastra sperimentale su un lettore di piastre. Al termine dell'esperimento di permeabilità, apri l'apposito software di modellazione e inizia un nuovo modello.

Selezionare la Creazione guidata modello e il modello 3D. Aggiungere Trasporto di specie diluite e fare clic su studia. Quindi seleziona Dipendente dal tempo e fai clic su Fine.

In Definizioni globali, fare clic con il pulsante destro del mouse per aggiungere parametri e immettere i parametri geometrici e fisici nella griglia. Imposta la geometria del sistema di inserimento della membrana dagli esperimenti e fai clic con il pulsante destro del mouse su Definizioni per aggiungere due sonde di dominio, selezionando una sonda come dominio accettore e l'altra come dominio donatore. Impostare entrambi i domini su media con un'espressione C e un'unità di mols per metro cubo.

E imposta il coefficiente di diffusione sotto le proprietà di trasporto uno e il trasporto di specie diluite. Fare clic con il pulsante destro del mouse su trasporto di specie diluite per aggiungere una seconda proprietà di trasporto due e selezionare la seconda barriera nella selezione del dominio. Sotto il trasporto di specie diluite, per valori iniziali uno, definire la concentrazione come zero.

Fare clic con il pulsante destro del mouse su trasporto delle specie diluite per aggiungere un secondo valore iniziale due e selezionare il donatore come terzo dominio. Impostare la concentrazione come concentrazione iniziale della sostanza donatrice fluorescente. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul trasporto delle specie diluite per aggiungere la simmetria uno e selezionare tutte le superfici della selezione del contorno che rispecchiano l'intera geometria.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla mesh per aggiungere due tetraedri liberi e impostare la seconda barriera come dominio. Fare clic con il pulsante destro del mouse su quello tetraedrico libero per aggiungere la dimensione della mesh predefinita a extra-fine. Nel secondo tetraedro libero, impostare l'accettore e il donatore come domini e la mesh predefinita su più fine.

Quindi, in studio uno, fare clic su Calcola per avviare la simulazione. Per adattare il coefficiente di diffusione ai dati generati dalla simulazione di diffusione, aprire il menu Aggiungi psichico e selezionare matematica. Individua l'ottimizzazione e la sensibilità.

Seleziona l'ottimizzazione e fai clic su Aggiungi al componente. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sulle definizioni per aggiungere variabili e inserire manualmente le variabili dalla tabella tre. Successivamente, nel menu di accoppiamento dei componenti, fare clic con il pulsante destro del mouse sulle definizioni, aggiungere quella media seguita dall'aggiunta manuale dell'accettore come nome dell'operatore e selezionare quello del dominio.

Esporta i dati sperimentali in un nuovo documento di testo. Utilizzare un punto e virgola per separare i dati in colonne e un'interruzione di riga per separare i dati in righe. Fare clic con il pulsante destro del mouse su ottimizzazione per aggiungere l'obiettivo dei minimi quadrati globali e allegare il documento di testo ai dati sperimentali.

Fare clic sull'obiettivo globale dei minimi quadrati per definire la prima colonna come colonna temporale uno e la seconda colonna come colonna valore uno. Nella colonna dell'espressione del valore, inserisci la variabile C.Fare clic con il pulsante destro del mouse su ottimizzazione per aggiungere una variabile di controllo globale. E dichiara la ricerca del carattere di sottolineatura D come una variabile con un valore iniziale di uno, un limite inferiore di zero e un limite superiore di 1.000.

Fare clic con il pulsante destro del mouse su Study One per aggiungere l'ottimizzazione. E seleziona SNOPT come metodo di risolutore di ottimizzazione. Impostate la tolleranza di ottimalità su uno alla potenza di meno otto.

Quindi impostare il coefficiente di diffusione sulla barriera su D.Impostare il tempo di simulazione in studio da zero secondi a 22.000 secondi con un intervallo di 100 secondi e fare clic su Calcola per iniziare l'ottimizzazione dei parametri. L'analisi istologica di un modello cellulare di collagene rivela una leggera colorazione dei fibroblasti all'interno della matrice centrale. Nella parte superiore della matrice di collagene, si può osservare uno strato contenente molti nuclei probabilmente costituiti da cheratinociti umani adulti a basso contenuto di calcio e ad alta temperatura.

Utilizzando il sale sodico di fluoresceina e il destrano isotiocianato di fluoresceina, verificare l'impatto della dimensione molecolare della sostanza diffondente rivela che per piccole dimensioni molecolari, la simulazione e i dati sperimentali sono in buon accordo per entrambe le molecole. Dimensioni molecolari più grandi, tuttavia, generano deviazioni più elevate nelle progressioni della curva nelle simulazioni, dimostrando un ritardo all'inizio e un aumento più forte nel corso successivo dei grafi. Infatti, il coefficiente di permeazione diminuisce all'aumentare della dimensione molecolare con i coefficienti simulati che si comportano in modo simile ai coefficienti di permeabilità sperimentali.

Da notare che la maggior parte dei modelli che utilizzano cheratinociti adulti umani a basso contenuto di calcio e ad alta temperatura hanno coefficienti di permeazione e diffusione inferiori rispetto ai modelli senza cheratinociti adulti umani a basso contenuto di calcio e ad alta temperatura. Il modello di simulazione del collagene può essere stabilito in 11-12 giorni e la misurazione della permeazione può essere completata in sei ore se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione della procedura, è importante mantenere costanti le condizioni al contorno come la temperatura, il volume di riempimento, la concentrazione della sostanza applicata, l'umidità e il processo della membrana al fine di ridurre la variazione del coefficiente di permeazione.

Con l'aiuto di questa simulazione del modulo, lo sforzo sperimentale può essere ridotto e le prestazioni a lungo termine possono essere previste. Può anche essere adattato ad altri dispositivi di permeazione o sistemi di proprietà di organi. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle applicazioni farmaceutiche e cosmetiche, nonché allo sviluppo dell'interazione nell'ingegneria tissutale per esplorare i processi di permeazione per diffusione nei tessuti artificiali.