Name: Metodologia per linduzione dellespettorato e laboratorio di lavorazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Impara la tecnica di induzione dell'espettorato per analisi cellulare in malattie respiratorie come asma e COPD. Questo metodo non invasivo consente di studiare lo stato infiammatorio delle vie aeree.

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Questo lavoro è stato supportato dall'ospedale università di Liegi (Liege CHU). Riconosciamo "Produzioni di istanti" per la produzione video. Riconosciamo anche Cedric François, il paziente che è apparso nel film.

Tutti i metodi descritti in questa sezione sono stati approvati dal comitato etico dell'ospedale università di Liegi e tutti i soggetti sani ha dato il consenso informato per la partecipazione.
1. espettorato indotto
<ol>
	<li>Spirometria pre- e post-broncodilatatore
	<ol>
		<li>Eseguire una spirometria (volume espiratorio forzato in 1 secondo [FEV1] e manovra di capacità vitale forzata [FVC]) secondo l'American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) criteri standard12.</li>
		<li>Amministrare 400 µ g di salbutamolo inalato da un inalatore di dosi controllate (MDI) attraverso un dispositivo distanziatore. Nota: Negli adulti, gli eventi avversi di salbutamolo per via inalatoria includono tremore e tachicardia13.</li>
		<li>Ripetere spirometria (FEV1 e manovra di FVC) 15 minuti più tardi, secondo i criteri standard ATS/ERS12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione del nebulizzatore ad ultrasuoni Nota: Il nebulizzatore deve essere accuratamente pulito e disinfettato prima di ogni utilizzo, in conformità con le istruzioni del produttore.<ol>
		<li>Riempire la camera di nebulizzazione con acqua distillata fino al livello consigliato.</li>
		<li>Collocare una tazza pulita nella camera di nebulizzazione.</li>
		<li>Coprire la tazza con il coperchio adatto.</li>
		<li>Riempire la tazza con entrambi 50 mL di soluzione salina ipertonica (5%) per un paziente con post-broncodilatatore FEV1 &#62; 65% preveduto o 50 mL di soluzione fisiologica (0,9%) per un paziente con post-broncodilatatore FEV1≤ 65% preveduto.</li>
		<li>Aggiungere 1,75 mL di soluzione di solfato di salbutamolo (5 mg/mL) per la tazza.</li>
		<li>Collegare i tubi e le valvole secondo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccolta dell'espettorato e nebulizzazione Nota: Eseguire la tecnica sotto controllo medico.<ol>
		<li>Spiegare la procedura al paziente.</li>
		<li>Chiedere al paziente di utilizzare un clip del naso.</li>
		<li>Accendere il nebulizzatore e selezionare il livello più basso delle impostazioni di aerosol e ventilatore.</li>
		<li>Chiedere al paziente di inalare l'aerosol attraverso il boccaglio con respirazione di marea per 5 min. Nota: Le impostazioni di Aerosol e ventilatore possono essere aumentate a seconda della tolleranza del paziente.<ol>
			<li>In caso di tosse insopportabile o nausea, interrompere la procedura e passare al punto 1.3.5.</li>
			<li>In caso di senso di costrizione toracica o disagio respiratorio, andare al punto 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Spegnere il nebulizzatore.</li>
		<li>Chiedere al paziente di rimuovere la clip da naso, sciacquare la bocca con acqua e fare dei gargarismi due volte prima di scartarlo nel lavandino. Nota: Le cellule di Saliva possono contaminare il campione di espettorato e portare a un campione inutilizzabile.</li>
		<li>Chiedere al paziente di tosse con espettorato in un contenitore di plastica.</li>
		<li>Eseguire una spirometria (una manovra espiratoria forzata) per misurare il FEV1.</li>
		<li>Valutare la caduta FEV1 come segue: (FEV1 misurata al punto 3.8 [mL]) - (post-broncodilatatore FEV1 misurata al punto 1.3 [mL]) / (post-broncodilatatore FEV1 misurata al punto 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>Se il FEV1 cade da 20% o più dal valore post-broncodilatatore, interrompere la procedura. Misurare il FEV1 nuovo 10 min più tardi. Se il FEV1 cade 20% o più, chiedere al medico di amministrare il bromuro di ipratropium nebulized (0,25 mg/2 mL) e tenere il paziente sotto osservazione medica. Andare al passaggio 1.3.10.</li>
			<li>Se il FEV1 non rientra del 20% o più dal valore post-broncodilatatore, ripetere i passaggi da 3.2 a 3,9 una a tre volte per raggiungere un tempo di nebulizzazione totale di 10-20 min. Nota: Il tempo di nebulizzazione totale dipenderà dalla qualità (presenza di spine o parti viscosi) e la quantità del campione dell'espettorato. Se la qualità del campione e/o la quantità è scarsa dopo 10 min di nebulizzazione, la procedura dovrebbe essere estesa per raggiungere un tempo di nebulizzazione totale di 15-20 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mantenere il campione di espettorato refrigerato fino al trattamento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. espettorato elaborazione
Nota: Processo di espettorato entro 3 ore dal campionamento per la vitalità cellulare ottimale.
Attenzione: Indossare un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali di protezione.
<ol>
	<li>Preparazioni preliminari
	<ol>
		<li>Preparare una diluizione di 10 volte della soluzione concentrata dithiothreitol (agente mucolitico) con acqua distillata sterile per ottenere 10 mL di una soluzione di 6,5 mM, in conformità con le istruzioni del produttore. Nota: Al fine di prevenire dithiothreitol concentrato soluzione di miscelazione con l'aria ambiente, aspirare la soluzione dal flaconcino con una siringa sterile ed ago. Una volta aperto, il flacone di soluzione concentrata deve essere conservato a temperatura ambiente e utilizzato entro 5 giorni. Al mattino vi attende la soluzione diluita. Attenzione: A causa del pericolo di irritazione di occhi e pelle, indossare indumenti protettivi (abbigliamento, guanti e occhiali di protezione).</li>
		<li>Fare una 5 volte la diluizione del blu di trypan (0,4%) con di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) per ottenere una soluzione di 0,08%. Tenere questa soluzione diluita a temperatura ambiente ed utilizzare entro 2 settimane. Attenzione: A causa di rischi cancerogeni, indossare indumenti protettivi (abbigliamento, guanti e occhiali di protezione).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccolta di espettorato surnatante
	<ol>
		<li>Trasferire l'intero espettorato in un tubo di plastica fondo conico da 50 mL e pesare il campione.</li>
		<li>Aggiungere un peso 3 volte di soluzione DPBS.</li>
		<li>Lentamente Vortexare il campione per 30 s.</li>
		<li>Centrifuga a 800 x g e a 4 ° C per 10 min.</li>
		<li>Filtrare il campione attraverso 2 singoli strati di garza sterile e raccogliere il surnatante in un tubo di plastica fondo conico da 50 mL.</li>
		<li>Aliquota del surnatante in 2 mL in plastica tubi e conservarli a-80 ° C. Nota: Surnatante campioni sono utili per analisi componenti fase fluida dell'espettorato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mucolysis espettorato
	<ol>
		<li>Se necessario, Aggiungi DPBS il pellet cellulare per raggiungere un volume totale della sospensione di cellule di 5 mL.</li>
		<li>Diluire la sospensione cellulare con 1 volume di 6,5 mM dithiothreitol. Utilizzare un bilanciere panca al rock la sospensione cellulare per 20 min a temperatura ambiente.<ol>
			<li>Ripetere almeno 3 volte con DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare diluito a 550 x g e a 4 ° C per 10 min.</li></ol></li></ol>Scartare il surnatante.
		<li>Risospendere il pellet cellulare in circa 1 mL di DPBS.</li>
	
	
	<li>Valutazione delle proprietà qualitative del campione dell'espettorato (concentrazione delle cellule, cellule squamose contaminazione e attuabilità di metodo di esclusione del Trypan Blue) dal conte emocitometro
	<ol>
		<li>Valutare e registrare l'esatto volume della sospensione cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di sospensione cellulare a 50 µ l della soluzione di blu di trypan 0,08% e omogeneizzare.</li>
		<li>Mettere il campione sotto il vetrino coprioggetto di un emocitometro (camera di Thoma) e posizionarlo sotto il microscopio ottico (400 X).</li>
		<li>Contare le cellule squamose, il vivente non squamocellulare cellule (incolore) e le cellule morte non squamocellulare (celle colorate di blu). Nota: In caso di densità cellulare troppo bassa o troppo alta, concentrare o diluire la sospensione cellulare e ripetere i passi 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Valutare la concentrazione cellulare di sospensione, la percentuale delle cellule squamous e la percentuale di vitalità delle cellule non squamocellulare. Nota: Calcolare il conteggio totale delle cellule non squamocellulare/g di espettorato: cella concentrazione della sospensione (punto 5.4) * volume della sospensione cellulare (passo 4.8) * % di cellule non squamocellulare / peso del campione dell'espettorato (punto 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione di un macchiato cytospin scivolare con la sospensione cellulare e lo stoccaggio di cellule residue, se necessario Nota: Se la sospensione cellulare contiene più di 80% squamose cellule, il campione è considerato poveri qualità e inadatto per una diapositiva di cytospin14. In tal caso, interrompere il trattamento e considera questo esempio infruttuoso.<ol>
		<li>Diluire una parte aliquota della sospensione delle cellule con DPBS per ottenere almeno 350 µ l di sospensione cellulare a 500.000 cellule/mL.</li>
		<li>Assemblare il concentratore di cella in conformità con le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Riempire ciascuna delle 3 scomparti del concentratore delle cellule con 100 µ l di sospensione cellulare.</li>
		<li>In una citocentrifuga, spin per 2 min a 150 x g e a temperatura ambiente. Eliminare i sovranatante.</li>
		<li>Smontare il concentratore di cella in conformità con le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Lasciare asciugare all'aria. Nota: In questa fase, le cellule residue possono essere memorizzate in un buffer adeguato se necessario per ulteriori esperimenti.</li>
		<li>Macchia il vetrino con una colorazione commerciale kit (vedere la Tabella materiali), in conformità con le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Montare il vetrino con un mezzo di montaggio adatto e un vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Porre il vetrino al microscopio ottico (600 X) con immersione in olio.</li>
		<li>Contare le celle non squamocellulare almeno 500: neutrofili, eosinofili, macrofagi, linfociti e cellule epiteliali. Nota: Conteggio differenziale delle cellule è di solito eseguita da una sola o due dedicato e addestrato osservatori per limitare le discrepanze del interobserver.</li>
		<li>Registrare i valori assoluti e percentuali di ogni tipo di cellula.</li>
	</ol>
	</li>

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<li>Holz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+sputum+composition+between+two+inductions+performed+on+consecutive+days%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days.</a> Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).</li>
<li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li>
<li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li>
<li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum%3A+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo di espettorato indotto è uno strumento utile per studiare il vano delle vie respiratorie. Ci sono diverse possibili applicazioni di questa tecnica. In primo luogo, può migliorare la conoscenza circa le cellule immuni e meccanismi implicati in varie malattie respiratorie. Ad esempio, questa tecnica ha permesso l'inchiesta di infiammazione delle vie aeree in larghe coorti di pazienti, ed è stato dimostrato che circa la metà dei pazienti asmatici sono caratterizzata da un anormale delle vie aeree l'infiammazione eosinofila15, 16 , 17, mentre i pazienti BPCO esibiscono solitamente un neutrofilo rialzato espettorato contare18. Questa tecnica ha contribuito anche alla migliore caratterizzazione di infiammazione delle vie aeree nei pazienti con fibrosi polmonare idiopatica e ai mediatori di prove che possono contribuire a questa malattia19. In secondo luogo, la tecnica di espettorato indotto può essere utile per predire la risposta al trattamento. Ad esempio, la presenza di una percentuale anormale degli eosinofilo di espettorato ha dimostrata di essere un indicatore premonitore di corticosteroide reattività11,18. Nell'asma e nella BPCO, sartoria la dose dei corticosteroidi per normalizzare la percentuale degli eosinofilo di espettorato è stato indicato per essere più efficace nel ridurre il numero delle esacerbazioni di regolazione trattamento secondo gli attuali orientamenti clinici11 ,20,21. In terzo luogo, l'analisi dell'espettorato possono aiutare a sviluppare terapie mirate. Ad esempio, la presenza di un numero abnorme di neutrofili di espettorato in COPD e alcuni pazienti asmatici ha portato allo sviluppo di trattamenti antineutrophilic11. In quarto luogo, la tecnica può svolgere un ruolo nella diagnosi. Ad esempio, la presenza di eosinofilia di espettorato è necessaria fare una diagnosi di bronchite eosinofila non-asmatica11.
Oltre ad ottenere un conteggio differenziale delle cellule, la tecnica di induzione dell'espettorato permette anche le prestazioni di molti ulteriori analisi, attraverso lo studio dell'espettorato surnatante o da cellule dell'espettorato. L'analisi di mediatori8,19,22 e la valutazione dell'attività chemiotattica del campione per eosinofili22esempi con espettorato surnatante. Dalle cellule dell'espettorato, RNA possa essere estratti e utilizzato per microRNA o espressione genica analizza19,23 . Le cellule dell'espettorato possono essere analizzate anche da flusso cytometry9,23 che permette, tra gli altri, immunophenotyping e ordinamento celle. Inoltre, le cellule dell'espettorato possono essere colta10, e loro produzione del Mediatore può essere misurato in vitro24. Vale la pena notare che in questo caso, il contenuto di mediatore è diverso da quello che può essere trovato in espettorato surnatante. Infatti, mediatori nel sovranatante dell'espettorato possono essere influenzate dalle secrezioni da cellule residenti delle vie respiratorie e di essudazione del plasma, al contrario l'espettorato cultura cellulare modello24. Infine, immunocitochimica e in situ di ibridazione può essere eseguita anche utilizzando cellule di espettorato7.
La tecnica di espettorato indotto presenta alcune limitazioni. L'induzione deve essere eseguita sotto controllo medico. È anche essenziale per l'operatore dare istruzioni esaurienti ai pazienti. Altre limitazioni includono la cooperazione e la condizione medica dei pazienti, sono necessari sforzi respiratori. Per quanto riguarda la fattibilità di questa tecnica nei bambini, parecchi studi hanno riferito che era successo e sicuro nei bambini di età superiore ai 6 anni25. Dati sui bambini di &#60; 6 anni di età sono carenti25, ma è probabile che l'induzione di espettorato è difficile da eseguire in quei bambini14. La tecnica è attualmente limitata ai servizi e centri specializzati di ricerca perché è tecnicamente impegnativo, che richiede tempo, e richiede personale specializzato1. Un'altra limitazione è che la tecnica di induzione dell'espettorato e di analisi non è sempre successo, significato che un cytospin leggibile non è sempre ottenuto26. Tuttavia, il tasso di successo è di solito circa 80% in diverse coorti di pazienti4,26,27,28,29. Infine, deve usare cautela quando si confrontano diverse coorti di pazienti per quanto riguarda la corrispondenza di età come è stato indicato agli urti l'espettorato delle cellule totali30,31. Allo stesso modo, altri parametri, quali le abitudini di genere e del tabacco devono essere abbinate come essi possono anche interferire con l'espettorato cella conteggio29,32. Quando il paziente di corrispondenza non è possibile, un altro modo per tener conto di età, sesso o stato di fumo è regolare l'analisi statistica per queste caratteristiche.
Rispetto ad altre tecniche che consentono la raccolta di cellule dalle vie aeree, come le biopsie e lavaggi broncoalveolari, il metodo di espettorato indotto ha il vantaggio di essere semplice, ben tollerato, sicuro, riproducibile, economica e non invasiva. Questi vantaggi consentono la tecnica di espettorato indotto da eseguirsi su larga scala e ripetutamente nel corso del tempo e ne fanno un'alternativa di scelta per il campionamento delle vie aeree. Bronchosorption è un'altra tecnica che permette la raccolta di liquido il rivestimento mucoso al fine di valutare delle vie respiratorie mediatori33. Mentre questa tecnica (che richiedono broncoscopia) è più invasiva rispetto espettorato indotto, presenta i vantaggi di evitare qualsiasi contaminazione con la saliva e l'ottenimento di elevate concentrazioni di mediatori rispetto a broncoalveolare lavaggio33.
Fasi critiche hanno bisogno di attenzione nel protocollo. In primo luogo, deve fare attenzione riguardo la concentrazione salina e il tempo di induzione, perché questi due parametri possono influenzare i risultati e pertanto devono essere standardizzati34,35. In secondo luogo, il mucolysis con DTT è un passo importante del trattamento. Rispetto a PBS, DTT è stato indicato per meglio disperdere espettorato celle7, che migliora la qualità di diapositiva di cytopsin ed è essenziale avere una cella riproducibile totali2. Tuttavia, l'agente mucolitico può interferire con la misurazione di componenti biochimici.Chiodare esperimenti quindi deve essere eseguita quando si misura un nuovo composto biochimico36. Infine, un altro passo fondamentale della procedura è la cella contando passo, che deve essere eseguita da un tecnico specializzato per garantire risultati affidabili e interpretabile.
Un metodo alternativo utilizzando spine di espettorato (parti viscida o più dense), anziché l'intero espettorato, è anche descritto in letteratura7. Entrambe le tecniche presentano vantaggi e svantaggi. La tecnica di espettorato intero consente più rapida elaborazione7, ma è spesso contaminata con la saliva, che diluisce il campione e può ridurre la qualità di cytospins2,7. Con la tecnica di selezione di spina, la contaminazione di saliva è ridotto, il che significa che i campioni siano spesso di qualità migliore per il dosaggio dei mediatori di fase fluida e cytospin diapositive7. Il trattamento è tuttavia più lungamente7 e spine selezionate potrebbero non essere rappresentativi della totalità del campione37. Vale anche la pena notare che non tutti i campioni contengono spine, che possono essere limitante. Entrambi i metodi sono validati e riproducibile, e attualmente non esiste alcuna prova che i conteggi differenziali delle cellule ottenuti da entrambi i metodi sono diversi14,38.
In futuro, l'espettorato indotto potrebbe essere utilizzato come strumento clinico per fornire biomarcatori per l'indagine, la diagnosi e la gestione di tutti i tipi di malattie respiratorie infiammatorie.

Parecchi metodi sono usati per studiare l'infiammazione delle vie aeree: diretta misure (come le biopsie bronchiali o lavaggi broncoalveolari) e metodi indiretti (come valutazione di sintomo, campione del polmone e analisi funzione analisi del sangue)1. Le tecniche dirette hanno il vantaggio di valutare in modo affidabile l'infiammazione delle vie aeree, ma sono invasiva e non è fattibile su grande scala a causa di disagio per il paziente e il rischio sostenuto1. Per quanto riguarda i metodi indiretti, scarsamente correlati con la valutazione diretta di infiammazione delle vie aeree1.
Raccolta dell'espettorato è un altro modo per campionare cellule dalle vie aeree e permette la valutazione diretta dell'infiammazione delle vie aeree. Tuttavia, produzione di espettorato spontaneamente può condurre ai campioni di qualità scadente e non è possibile per tutti i pazienti2. Questo problema è stato superato utilizzando soluzione salina ipertonica nebulizzata con ultrasuoni per indurre la produzione di espettorato2. Questo metodo è stato inizialmente utilizzato in pazienti infettati con il virus di immunodeficenza umana (HIV) per la diagnosi di polmonite di carinii di pneumocystis 3 ed è stato adattato per soggetti sani e gli asmatici nel 19924. Espettorato indotto è fattibile in pazienti più gravi anche utilizzando soluzione salina isotonica5. Anche se generalmente ben tollerato, l'inalazione di soluzione salina può causare broncospasmo in pazienti con hyperresponsive airways5. Pertanto, si consiglia di somministrare un breve durata d'azione beta agonista prima la procedura1. Inoltre, precedentemente abbiamo indicato che aggiungendo salbutamol per la soluzione salina nel nebulizzatore a ultrasuoni diminuito ulteriormente questo rischio6. I vantaggi di espettorato è che è non-invasivo2 e sicuro quando appropriate precauzioni5.
Per il trattamento dei campioni di espettorato, due metodi sono attualmente utilizzati nella letteratura: la tecnica tutta dell'espettorato e la spina selezione7. Nel nostro laboratorio, viene eseguita la tecnica tutta espettorato. L'obiettivo primario del trattamento dell'espettorato è quello di ottenere un conteggio differenziale delle cellule per studiare il tipo di infiammazione presente nel lume delle vie aeree. Tuttavia, molte altre analisi sono anche possibili ulteriori analisi di processi infiammatori e meccanismi immunitari, sia studiando mediatori nel sovranatante dell'espettorato8 o eseguendo la ricerca dettagliata sulle cellule dell'espettorato (per esempio. , flusso cytometry9, cell culture10, genomica10, proteomica10, immunocitochimica7, in situ Ibridazione7, ecc.)
La tecnica di induzione dell'espettorato e di analisi è attualmente limitata per ricercare servizi e centri specializzati nella pratica clinica, perché è tecnicamente impegnativo, richiede tempo e richiede personale specializzato1. Infiammazione delle vie aeree può essere studiata con questo metodo per varie malattie respiratorie come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la tosse cronica o fibrosi polmonare idiopatica11.

<table><tbody><tr><td>Spirometro - Spirobank</td><td>MIR France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>Vedi il farmaco disponibile nel paese</td></tr><tr><td>Nebulizzatore UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb Tazze monouso & Coperchi</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>Filtro batterico DeVilbiss per nebulizzatori UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>Valvole unidirezionali</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>Valvole unidirezionali</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>Connettore a T per aerosol&nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>Circuito di ventilazione monoramo ondulato</td><td>Int'Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&nbsp;</td><td>Prodotto</td><td></td> <td>dalla nostra farmacia ospedaliera</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0,9%</td><td>B.Braun Medical&nbsp; Diegem Belgio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamolo solfato 5 mg/mL - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>Vedi farmaco disponibile nel paese</td></tr><tr><td>Ipratropio bromuro 0,25 mg/2 mL - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Germania</td><td>CNK: 1543-305</td><td>Vedi farmaco disponibile nel paese</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>LONZA Belgio</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Reagente sputolisina</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0,4% soluzione 100 mL</td><td>LONZA Bio Whittaker Belgio</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro - Camera Thoma</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Hemacolor Stainig set</td><td>Merck Belgio</td><td>1116610001</td><td>Prodotto alternativo : Diff Quik Staining Set &nbsp; Diagnostica Medion&nbsp;</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio - Entellan</td><td>Merck Belgio</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Belgio</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia per l'induzione dell'espettorato e laboratorio di lavorazione

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

La tecnica di induzione dell'espettorato e la lavorazione è un metodo riconosciuto non invasivo che permette la raccolta e l'analisi delle cellule dalle vie aeree, che è interessante in varie malattie respiratorie come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), tosse cronica, o la fibrosi polmonare idiopatica. Questa tecnica è ben tollerato, sicuro e non invasivo, ma è attualmente limitata a servizi di ricerca e centri specializzati nella pratica clinica, perché è tecnicamente impegnativo, richiede tempo e richiede personale specializzato. Il tasso di successo di espettorato e analisi è circa l'80%.
Qui, descriviamo il trattamento di induzione e laboratorio dei campioni di espettorato. Espettorato è indotta da inalazione di soluzione salina ipertonica o isotonica con salbutamolo. Per la lavorazione, usiamo la tecnica tutta espettorato. Ditiotreitolo (DTT) viene utilizzato per consentire mucolysis di campioni dell'espettorato. L'obiettivo primario del trattamento dell'espettorato è quello di ottenere un conteggio differenziale delle cellule per studiare i tipi di cellule presenti nel lume delle vie aeree. Ulteriori analisi possono essere eseguite anche su espettorato surnatante e cellule dell'espettorato, che possono consentire ulteriori indagine dei processi infiammatori e meccanismi immuni. Gli esempi includono studiando mediatori nel sovranatante dell'espettorato e l'esecuzione di un ampio spettro di analisi sulle cellule dell'espettorato come citometria a flusso, genomica e proteomica.
Infine, vengono presentati risultati rappresentativi dell'analisi dell'espettorato in controlli sani, asmatici e pazienti con BPCO.

Emocitometro Una tipica immagine è illustrata nella Figura 1 che viene visualizzato con il microscopio usando l'emocitometro. Cellule squamose sono facilmente identificabili, come sono molto più grandi rispetto alle cellule non squamocellulare. Queste cellule squamose sono cellule epiteliali proveniente dalla bocca. Entrambi i tipi di cellule sono macchiati di tripan blu quando è morto. Deve usare cautela per evitare il conteggio di lieviti, batteri e rottami.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
Figura 1 : Foto di emocitometro risultati (A) una vita non-squamous delle cellule, (B) una cellula morta non squamocellulare e (C) un squamous delle cellule. Barra della scala = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Cytospin diapositiva: la figura 2 Mostra un'immagine rappresentativa di una diapositiva di cytospin ottenuta dopo l'elaborazione dell'espettorato. I tipi differenti delle cellule (neutrofili, eosinofili, macrofagi, linfociti e cellule epiteliali) possono essere differenziati per mezzo di loro morfologia e la colorazione. In alcuni casi, la contaminazione da cellule squamose può essere importante e, se la percentuale delle cellule squamous è supera all'80%, il campione viene considerato infruttuoso (Figura 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
Figura 2 : Foto di diapositiva Cytospin risultati (A) un neutrofilo, (B) un macrofago, (C) un eosinofilo, (D), un linfocita e (E), una cellula epiteliale. Barra della scala = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
Figura 3 : Esempio di una diapositiva di cytospin di scarsa qualità con &gt; 80% delle cellule squamous. Barra della scala = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tasso di successo Nel nostro reparto, il tasso di successo della procedura (che combina una riuscita induzione e un cytospin leggibile), basato su un campione di 1.129 pazienti (soggetti sani, gli asmatici o pazienti con BPCO), è dell'82% (924/1.129). In una sotto-analisi secondo il tipo di pazienti, il tasso di successo è 75% (57/76) in soggetti sani, 82% (827/1.004) in asmatici e 82% (40/49) nei pazienti con BPCO.
Risultati in soggetti sani In un'analisi retrospettiva di una serie di 289 soggetti sani dal nostro reparto, la mediana (range interquartile) peso dell'espettorato era 3,72 g (range interquartile di 2,46 g - 5,54 g) e la mediana totale non-squamous delle cellule totali/g di espettorato era 0,59 x 106 ( intervallo interquartile di 0,37 x 106 - 1.29 x 106).
In tali soggetti sani, la proporzione di cellule squamose è bassa al 19% (10% - 34%) e la redditività è alta al 66% (54-78%). Per quanto riguarda la percentuale dei tipi differenti delle cellule, i risultati sono riassunti nella Figura 4A. Possiamo osservare che la percentuale dei macrofagi (49% [31-68%]) è superiore alla percentuale dei neutrofili (34% [14% - 60%]), mentre le percentuali di linfociti (2% [1-3%]), eosinofili (0% [0-0%]) e cellule epiteliali (4% [2-11%]) sono basse. Questi risultati sono simili quando i dati sono espressi in valori assoluti (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
Figura 4 : Risultati rappresentativi del conteggio differenziale delle cellule osservata in soggetti sani espressi come percentuali (A) o (B) valori assoluti. Risultati sono mostrati come mediana (range interquartile). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
È anche importante considerare l'età dei pazienti. Infatti, una forte correlazione è tra età del paziente e la percentuale di neutrofili presente nei campioni di espettorato (Figura 5). Allo stesso modo, quando classificare i pazienti secondo classi di età di 10 anni (Figura 6), abbiamo osservato un significativo aumento della percentuale dei neutrofili con l'aumento dell'età. Pertanto, questa variabile deve essere considerata quando si confrontano i risultati da diverse coorti e prestare attenzione in corrispondenza dei soggetti.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
Figura 5: Correlazione tra età ed espettorato percentuale del neutrofilo. La correlazione è stata calcolata con il test di Spearman. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
Figura 6: Evoluzione della percentuale dei neutrofili in base alla categoria di età. Il p-valore di ANOVA era &lt; 0,0001 per il confronto delle percentuali del neutrofilo tra classi di età. I confronti multipli sono stati realizzati con test comparazioni multiple di Dunn. I p-valori sono rappresentati come segue: * p &lt; 0.05, * * p &lt; 0.01, e * * * p &lt; 0.001. Risultati sono mostrati come mediana (range interquartile). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Risultati nei pazienti affetti da malattie respiratorie La tecnica dell'espettorato indotto è comunemente utilizzata per valutare il profilo di cellule infiammatorie nei pazienti asmatici.Questa tecnica può essere applicata anche ai pazienti affetti da BPCO, un'altra malattia infiammatoria delle vie respiratorie. Quando si confrontano soggetti sani, gli asmatici e pazienti con BPCO (3 gruppi essere abbinati per età, sesso e abitudini del tabacco), abbiamo osservato che il profilo di cellula infiammatoria è molto diverso tra queste coorti (Figura 7). Infatti, i pazienti asmatici sono caratterizzati solitamente da eosinofili espettorato sollevata, mentre la proporzione dei neutrofili di espettorato è solitamente più elevata nei pazienti con BPCO rispetto ai controlli sani, che è collegata alla gravità della malattia.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
Figura 7 : Profilo di cellula infiammatoria dell'espettorato di soggetti sani (n = 45), pazienti asmatici (n = 108) e pazienti con BPCO (n = 54). I tre gruppi sono stati abbinati per età, sesso e abitudini del tabacco. I p-valori di ANOVA erano &lt; 0.05, &lt; 0,0001, e &lt; 0,0001 per il confronto di neutrofili, eosinofili e macrofagi tra gruppi, rispettivamente. I confronti multipli sono stati realizzati con test comparazioni multiple di Dunn. I p-valori sono rappresentati come segue: * p &lt; 0.05 e * * * p &lt; 0.001. Risultati sono mostrati come mediana (range interquartile). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui descriviamo la tecnica di induzione dell'espettorato. Questo protocollo spiega anche l'espettorato di elaborazione per eseguire un conteggio differenziale delle cellule e per raccogliere il surnatante di espettorato e cellule per ulteriori analisi.

Metodologia per l'induzione dell'espettorato e laboratorio di lavorazione

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

La tecnica dell'espettorato indotto è stata sviluppata nei primi anni '90. La tecnica è stata proposta per studiare nuove informazioni nelle malattie ostruttive delle vie aeree come l'asma, la BPCO e, più recentemente, c'è stato un interesse anche per esaminare nuove informazioni nella fibrosi polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente non invasiva rispetto alla broncoscopia.L'elaborazione richiede lavoro di laboratorio e richiede tempo, quindi è piuttosto impegnativa, richiede tempo e richiede una certa esperienza in laboratorio, quindi è chiaramente una tecnica difficile da ottenere in tutti i centri. La tecnica dell'espettorato indotto è composta da due parti, la prima parte è l'induzione e la seconda parte è l'elaborazione. Prima di indurre l'espettorato, dobbiamo eseguire una spirometria, che è una valutazione del volume e della portata che il paziente è in grado di produrre.E dobbiamo farlo perché l'induzione dell'espettorato da sola può causare bronchiospasmo, quindi abbiamo assolutamente bisogno di conoscere il valore basale della spirometria dei pazienti. Quindi prima eseguiamo una spirometria, poi diamo ai pazienti broncodilatatori, di solito diamo 400 microgrammi di salbutamolo, per aprire al massimo le vie aeree dei pazienti, e anche per prevenire un bronchiospasmo che può verificarsi durante la fase di induzione. E dopo 15 minuti, misuriamo di nuovo la spirometria, per avere quello che chiamiamo il valore basale della spirometria, e in particolare guardiamo il FEV1 che è il volume che il paziente è in grado di espirare in un secondo.Versare l'acqua distillata nella camera del nebulizzatore fino al livello consigliato. Posizionare una tazza pulita nella camera del nebulizzatore. Coprire il tappo riempito con l'apposito coperchio.Riempire la tazza con 50 ml di soluzione fisiologica ipertonica al 5% se il FEV1 post-broncodilatatore è superiore al 65% previsto, o 50 ml di soluzione salina isotonica al 9% se il FEV1 post-broncodilatatore è inferiore al 65% previsto. Aggiungere 1,75 soluzione di salbutamolo solfato alla concentrazione di cinque milligrammi per ml nella tazza. Collegare i tubi e le valvole secondo le istruzioni del produttore.La tecnica deve essere eseguita sotto controllo medico. Spiegare il principio del test al paziente. Chiedi al paziente di utilizzare una clip per il naso.Avviare il nebulizzatore e selezionare il livello più basso di aerosol e l'impostazione della ventola. Chiedere al paziente di inalare l'aerosol attraverso il boccaglio con la respirazione corrente. Il livello di aerosol e l'impostazione della ventola possono essere aumentati a seconda della tolleranza del paziente.In caso di costrizione toracica o disagio respiratorio, interrompere la procedura ed eseguire una spirometria per misurare il valore FEV1 del paziente. Dopo i cinque minuti di inalazione, o in caso di tosse o nausea, interrompere il nebulizzatore. Chiedere al paziente di rimuovere la clip per il naso, di sciacquare la bocca e di fare due gargarismi con acqua di rubinetto e di gettare quest'acqua nel lavandino.Quindi, come il paziente per tossire l'espettorato e sputare ciò che esce dalla gola in un contenitore di plastica. Eseguire la prima manovra respiratoria per misurare il FEV1. Dopo ogni tentativo di produzione di espettorato, misuriamo il valore FEV1.Se il valore di FEV1 scende di oltre il 20%, interrompiamo la procedura e diamo ai pazienti la nebulizzazione di ipratropio bromuro, che è un anticolinergico che agirà in combinazione con beta-due agonisti che abbiamo già somministrato durante la procedura. Se il valore FEV1 non scende di oltre il 20%, si procede con la procedura per un tempo totale di 10-20 minuti a seconda della qualità e del volume di espettorato prodotto dal paziente. Una volta ottenuto il campione di espettorato, conservarlo in frigorifero fino alla lavorazione.Quindi la seconda parte consiste nell'elaborazione dell'espettorato e, per questo, dobbiamo prima preparare le due soluzioni che utilizzeremo per questa elaborazione. Quindi dobbiamo preparare il Ditiotreitolo noto anche come DTT. La soluzione deve essere preparata mediante diluizione del DTT con acqua sterile in modo da ottenere una soluzione da 6,5 millimolari.Quindi bisogna evitare di esporre il DTT all'aria ambiente, e per questo usiamo una siringa e un ago. In secondo luogo, è necessario preparare la soluzione di blu di tripano, e per questo è necessario eseguire una diluizione di DPBS con blu di tripano, per ottenere una soluzione dello 0,08%Quindi, per quanto riguarda l'espettorato, è necessario trasferire l'intero espettorato in una provetta di plastica a fondo conico da 50 ml e pesare il campione. Aggiungere un peso triplo di soluzione DPBS.Agitare lentamente il campione per 30 secondi, centrifugare a 800 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in una provetta di plastica a fondo conico da 50 ml, dopo la filtrazione attraverso due singoli strati di garza sterile. Allocare il surnatante in provette di plastica da 2 ml e conservare a meno 80 gradi Celsius.Si noti che i campioni di surnatante ci sono utili come componente trifase dell'espettorato. Se il volume del pallet delle celle è inferiore a 5 ml, aggiungere DPBS per raggiungere un volume di 5 ml di sospensione delle cellule. Diluire la sospensione cellulare con un volume di DTT a 6,5 millimolari.Far oscillare la sospensione cellulare per 20 minuti a temperatura ambiente con un lavoratore al banco. Diluire la sospensione cellulare almeno tre volte con DPBS. Centrifugare la sospensione cellulare diluita a 550 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il surnatante. Sospendere la tavolozza delle celle in circa un ml DPBS. Valutare e registrare il volume esatto della sospensione cellulare.Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare a 50 microlitri di soluzione diluita di blu di tripano e omogeneizzare. Mettere il campione sotto il vetrino coprioggetto di un citometro emocile e metterlo sotto un microscopio ottico. Valutare la concentrazione cellulare della sospensione cellulare, la percentuale di cellule squamose e la percentuale di vitalità delle cellule non squamose.Diluire un'allocazione della sospensione con DPBS per ottenere almeno 350 microlitri di sospensione cellulare a 500.000 cellule per mL. Assemblare il concentratore di celle secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascuno dei tre scomparti del concentratore cellulare.Centrifugare due minuti a 150 g a temperatura ambiente in una centrifuga cyto. Scartare il surnatante. Lasciare asciugare lo scivolo all'aria.Colorare il vetrino con div quick o un kit di macchie di valenza in nichel secondo le istruzioni del produttore. Montare con un supporto di montaggio e un vetrino coprioggetti. Posizionare il vetrino sotto il microscopio ottico con immersioni in olio.Contare almeno 500 cellule non squamose, i neutrofili, gli eosinofili, i macrofagi, i linfociti e le cellule epiteliali e registrare i valori assoluti e la percentuale e il tipo di cellula. Per quanto riguarda i risultati, utilizzando l'emocitometro, dobbiamo contare le cellule viventi non squamose che non sono colorate. Inoltre, le cellule morte non squamose che sono colorate in blu.E le cellule squamose. Queste cellule sono cellule epiteliali che provengono dalla bocca. Sono grandi, quindi sono facili da riconoscere rispetto alle piccole cellule umane.Quindi bisogna evitare di contare anche batteri, lieviti o scarti. Se la sospensione cellulare contiene più dell'80% di cellule squamose, questo campione è considerato di scarsa qualità e non adatto per un vetrino di cytospin. Il campione è pertanto considerato non riuscito.Il conteggio sul citospin colorato viene eseguito in base al colore delle cellule e alla loro morfologia. I neutrofili, la caratteristica principale è il nucleo multilobulato che ha reso le cellule facili da identificare. Queste celle sono rotonde, piccole e colorate in rosa neutro.Gli eosinofili, queste cellule sono composte da granuli rossi, facili da identificare. La dimensione di queste cellule è vicina ai neutrofili. I macrofagi, sono da due a cinque volte più grandi dei neutrofili e sono colorati in blu.Il citoplasma può contenere detriti e vacuoli. I linfociti, queste cellule sono rotonde e piccole, colorate in blu e possiedono un nucleo grande e denso. Le cellule degli epiteli hanno una forma colonnare, sono colorate di rosa e spesso presentano ciglia nella parte superiore.Ecco alcuni esempi di campioni di citospin illeggibili con più dell'80% di cellule squamose. Penso che sia una tecnica molto utile, tuttavia dobbiamo essere molto cauti perché l'induzione dell'espettorato deve essere fatta sotto controllo medico, ma la tecnica dell'induzione dell'espettorato ti dà molte informazioni sullo stato infiammatorio dei pazienti nelle vie aeree. Può consentire di misurare diversi marcatori biochimici nel surnatante e si possono anche misurare cose diverse sulle parti cellulari, quindi l'espettorato indotto consente di eseguire citometria a flusso, proteomica, trascrittomica e persino genomica.

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