Metodologia per l'induzione dell'espettorato e laboratorio di lavorazione

La tecnica dell'espettorato indotto è stata sviluppata nei primi anni '90. La tecnica è stata proposta per studiare nuove informazioni nelle malattie ostruttive delle vie aeree come l'asma, la BPCO e, più recentemente, c'è stato un interesse anche per esaminare nuove informazioni nella fibrosi polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente non invasiva rispetto alla broncoscopia.

L'elaborazione richiede lavoro di laboratorio e richiede tempo, quindi è piuttosto impegnativa, richiede tempo e richiede una certa esperienza in laboratorio, quindi è chiaramente una tecnica difficile da ottenere in tutti i centri. La tecnica dell'espettorato indotto è composta da due parti, la prima parte è l'induzione e la seconda parte è l'elaborazione. Prima di indurre l'espettorato, dobbiamo eseguire una spirometria, che è una valutazione del volume e della portata che il paziente è in grado di produrre.

E dobbiamo farlo perché l'induzione dell'espettorato da sola può causare bronchiospasmo, quindi abbiamo assolutamente bisogno di conoscere il valore basale della spirometria dei pazienti. Quindi prima eseguiamo una spirometria, poi diamo ai pazienti broncodilatatori, di solito diamo 400 microgrammi di salbutamolo, per aprire al massimo le vie aeree dei pazienti, e anche per prevenire un bronchiospasmo che può verificarsi durante la fase di induzione. E dopo 15 minuti, misuriamo di nuovo la spirometria, per avere quello che chiamiamo il valore basale della spirometria, e in particolare guardiamo il FEV1 che è il volume che il paziente è in grado di espirare in un secondo.

Versare l'acqua distillata nella camera del nebulizzatore fino al livello consigliato. Posizionare una tazza pulita nella camera del nebulizzatore. Coprire il tappo riempito con l'apposito coperchio.

Riempire la tazza con 50 ml di soluzione fisiologica ipertonica al 5% se il FEV1 post-broncodilatatore è superiore al 65% previsto, o 50 ml di soluzione salina isotonica al 9% se il FEV1 post-broncodilatatore è inferiore al 65% previsto. Aggiungere 1,75 soluzione di salbutamolo solfato alla concentrazione di cinque milligrammi per ml nella tazza. Collegare i tubi e le valvole secondo le istruzioni del produttore.

La tecnica deve essere eseguita sotto controllo medico. Spiegare il principio del test al paziente. Chiedi al paziente di utilizzare una clip per il naso.

Avviare il nebulizzatore e selezionare il livello più basso di aerosol e l'impostazione della ventola. Chiedere al paziente di inalare l'aerosol attraverso il boccaglio con la respirazione corrente. Il livello di aerosol e l'impostazione della ventola possono essere aumentati a seconda della tolleranza del paziente.

In caso di costrizione toracica o disagio respiratorio, interrompere la procedura ed eseguire una spirometria per misurare il valore FEV1 del paziente. Dopo i cinque minuti di inalazione, o in caso di tosse o nausea, interrompere il nebulizzatore. Chiedere al paziente di rimuovere la clip per il naso, di sciacquare la bocca e di fare due gargarismi con acqua di rubinetto e di gettare quest'acqua nel lavandino.

Quindi, come il paziente per tossire l'espettorato e sputare ciò che esce dalla gola in un contenitore di plastica. Eseguire la prima manovra respiratoria per misurare il FEV1. Dopo ogni tentativo di produzione di espettorato, misuriamo il valore FEV1.

Se il valore di FEV1 scende di oltre il 20%, interrompiamo la procedura e diamo ai pazienti la nebulizzazione di ipratropio bromuro, che è un anticolinergico che agirà in combinazione con beta-due agonisti che abbiamo già somministrato durante la procedura. Se il valore FEV1 non scende di oltre il 20%, si procede con la procedura per un tempo totale di 10-20 minuti a seconda della qualità e del volume di espettorato prodotto dal paziente. Una volta ottenuto il campione di espettorato, conservarlo in frigorifero fino alla lavorazione.

Quindi la seconda parte consiste nell'elaborazione dell'espettorato e, per questo, dobbiamo prima preparare le due soluzioni che utilizzeremo per questa elaborazione. Quindi dobbiamo preparare il Ditiotreitolo noto anche come DTT. La soluzione deve essere preparata mediante diluizione del DTT con acqua sterile in modo da ottenere una soluzione da 6,5 millimolari.

Quindi bisogna evitare di esporre il DTT all'aria ambiente, e per questo usiamo una siringa e un ago. In secondo luogo, è necessario preparare la soluzione di blu di tripano, e per questo è necessario eseguire una diluizione di DPBS con blu di tripano, per ottenere una soluzione dello 0,08%Quindi, per quanto riguarda l'espettorato, è necessario trasferire l'intero espettorato in una provetta di plastica a fondo conico da 50 ml e pesare il campione. Aggiungere un peso triplo di soluzione DPBS.

Agitare lentamente il campione per 30 secondi, centrifugare a 800 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in una provetta di plastica a fondo conico da 50 ml, dopo la filtrazione attraverso due singoli strati di garza sterile. Allocare il surnatante in provette di plastica da 2 ml e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Si noti che i campioni di surnatante ci sono utili come componente trifase dell'espettorato. Se il volume del pallet delle celle è inferiore a 5 ml, aggiungere DPBS per raggiungere un volume di 5 ml di sospensione delle cellule. Diluire la sospensione cellulare con un volume di DTT a 6,5 millimolari.

Far oscillare la sospensione cellulare per 20 minuti a temperatura ambiente con un lavoratore al banco. Diluire la sospensione cellulare almeno tre volte con DPBS. Centrifugare la sospensione cellulare diluita a 550 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante. Sospendere la tavolozza delle celle in circa un ml DPBS. Valutare e registrare il volume esatto della sospensione cellulare.

Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare a 50 microlitri di soluzione diluita di blu di tripano e omogeneizzare. Mettere il campione sotto il vetrino coprioggetto di un citometro emocile e metterlo sotto un microscopio ottico. Valutare la concentrazione cellulare della sospensione cellulare, la percentuale di cellule squamose e la percentuale di vitalità delle cellule non squamose.

Diluire un'allocazione della sospensione con DPBS per ottenere almeno 350 microlitri di sospensione cellulare a 500.000 cellule per mL. Assemblare il concentratore di celle secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascuno dei tre scomparti del concentratore cellulare.

Centrifugare due minuti a 150 g a temperatura ambiente in una centrifuga cyto. Scartare il surnatante. Lasciare asciugare lo scivolo all'aria.

Colorare il vetrino con div quick o un kit di macchie di valenza in nichel secondo le istruzioni del produttore. Montare con un supporto di montaggio e un vetrino coprioggetti. Posizionare il vetrino sotto il microscopio ottico con immersioni in olio.

Contare almeno 500 cellule non squamose, i neutrofili, gli eosinofili, i macrofagi, i linfociti e le cellule epiteliali e registrare i valori assoluti e la percentuale e il tipo di cellula. Per quanto riguarda i risultati, utilizzando l'emocitometro, dobbiamo contare le cellule viventi non squamose che non sono colorate. Inoltre, le cellule morte non squamose che sono colorate in blu.

E le cellule squamose. Queste cellule sono cellule epiteliali che provengono dalla bocca. Sono grandi, quindi sono facili da riconoscere rispetto alle piccole cellule umane.

Quindi bisogna evitare di contare anche batteri, lieviti o scarti. Se la sospensione cellulare contiene più dell'80% di cellule squamose, questo campione è considerato di scarsa qualità e non adatto per un vetrino di cytospin. Il campione è pertanto considerato non riuscito.

Il conteggio sul citospin colorato viene eseguito in base al colore delle cellule e alla loro morfologia. I neutrofili, la caratteristica principale è il nucleo multilobulato che ha reso le cellule facili da identificare. Queste celle sono rotonde, piccole e colorate in rosa neutro.

Gli eosinofili, queste cellule sono composte da granuli rossi, facili da identificare. La dimensione di queste cellule è vicina ai neutrofili. I macrofagi, sono da due a cinque volte più grandi dei neutrofili e sono colorati in blu.

Il citoplasma può contenere detriti e vacuoli. I linfociti, queste cellule sono rotonde e piccole, colorate in blu e possiedono un nucleo grande e denso. Le cellule degli epiteli hanno una forma colonnare, sono colorate di rosa e spesso presentano ciglia nella parte superiore.

Ecco alcuni esempi di campioni di citospin illeggibili con più dell'80% di cellule squamose. Penso che sia una tecnica molto utile, tuttavia dobbiamo essere molto cauti perché l'induzione dell'espettorato deve essere fatta sotto controllo medico, ma la tecnica dell'induzione dell'espettorato ti dà molte informazioni sullo stato infiammatorio dei pazienti nelle vie aeree. Può consentire di misurare diversi marcatori biochimici nel surnatante e si possono anche misurare cose diverse sulle parti cellulari, quindi l'espettorato indotto consente di eseguire citometria a flusso, proteomica, trascrittomica e persino genomica.