Caratterizzazione strutturale di Mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare i polisaccaridi della parete cellulare delle piante. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo della biologia della parete cellulare vegetale, tra cui la struttura e la quantità del glucomannano. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede una formazione specializzata o attrezzature costose.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con l'interpretazione dei gel, quindi l'inclusione e la comprensione di tutti i controlli descritti è fondamentale. L'alcol e il residuo solubile, o ARIA, sono stati precedentemente preparati a partire da materiale vegetale raccolto come descritto nel protocollo di testo. Pesare sei milligrammi di ARIA in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e aggiungere acqua fino a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro.

Vortice per ottenere una sospensione uniforme. Aliquotare 500 microgrammi in tubi microfuge. Asciugare le aliquote utilizzando una centrifuga sottovuoto a 30 gradi Celsius durante la notte.

Pretrattare l'AIR comprensivo di un'aliquota per un controllo AIR senza enzimi con un idrossido di sodio molare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, aggiungere 200 microlitri di acqua e 20 microlitri di acido cloridrico molare a ciascun tubo per neutralizzare l'idrossido di sodio. Verifica che il pH sia di circa sei o sette rimuovendo un microlitro e posizionandolo sulle strisce indicatrici di pH di carta.

Aggiungere 50 microlitri di un tampone molare in acetato di ammonio pH 6,0 e aggiungere acqua per un volume totale di 500 microlitri a ciascuna provetta. Per iniziare questa procedura, aggiungere una quantità predeterminata di mannanasi alle aliquote e al tampone AIR. Includere controlli negativi appropriati e un controllo positivo.

Vorticare e poi girare brevemente per raccogliere la miscela di reazione sul fondo del tubo. Incubare a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione per una notte. Il giorno seguente, interrompere la reazione incubando a 95 gradi Celsius per 20 minuti.

Centrifugare alla massima velocità per 10 minuti. Conservare il surnatante e risospendere ogni pellet in 250 microlitri di acqua. Centrifugare nuovamente e conservare il surnatante.

Unire entrambi i surnatanti e asciugare in una centrifuga sottovuoto a 30 gradi Celsius per circa tre ore. Prima della procedura di derivatizzazione, preparare i reagenti necessari come descritto nel protocollo di testo. Riscaldare la soluzione madre di 0,2 ANTS molari a 60 gradi Celsius per sciogliere completamente il solido.

A ciascun campione, aggiungere cinque microlitri di ANTS, cinque microlitri di due-picolina-borano e 10 microlitri di tampone di derivatizzazione. Girare brevemente per raccogliere il fondo del tubo, vorticare a fondo e poi girare di nuovo brevemente. Incubare i campioni durante la notte a 37 gradi Celsius al riparo dalla luce.

Il giorno seguente, asciugare i campioni in una centrifuga sottovuoto a 30 gradi Celsius per circa due ore. Risospendere ogni campione in oligosaccaridi standard e 100 microlitri di urea a tre molari. Conservare a meno 20 gradi Celsius al riparo dalla luce fino al momento del bisogno.

L'assemblaggio dell'attrezzatura per la colata di gel dipenderà dalla marca. Per l'attrezzatura utilizzata in questa dimostrazione, un gel equivale a 50 millilitri. In una provetta da centrifuga da 50 millilitri, mescolare 20,2 millilitri di acqua, cinque millilitri di tampone PACE 10x, 24,6 millilitri di acrilammide al 40%, 200 microlitri di APS e 20 microlitri di TEMED.

Capovolgere delicatamente per amalgamare facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Utilizzare una pipetta sierologica o di altro volume per versare il gel risolutivo a circa quattro centimetri sotto la parte superiore delle lastre di vetro. Sovrapporre accuratamente il gel con alcol isopropilico.

Lasciare polimerizzare il gel per 20-30 minuti. Versare lo strato superiore. Asciugare il liquido in eccesso con carta assorbente.

Quindi, prepara il gel per impilare. In una provetta da centrifuga da 15 millilitri, mescolare 6,8 millilitri di acqua, un millilitro di tampone 10x PACE, 2,8 millilitri di acrilammide/bis-acrilammide, 80 microlitri di APS e otto microlitri di TEMED. Capovolgere per mescolare e sovrapporre sopra il gel risolutivo polimerizzato.

Inserire delicatamente il pettine evitando di intrappolare bolle d'aria sotto i denti del pettine. Dopo che il gel si è polimerizzato, avvolgerlo in un fazzoletto umido e poi in un involucro di plastica e conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per aiutare a tenere traccia dell'ordine di carico e a identificare dove si trovano i pozzetti una volta rimosso il pettine, utilizzare un pennarello indelebile per etichettare le posizioni dei pozzetti sul vetro.

Rimuovere il pettine. Riempire i pozzetti con un tampone PACE one-X. Utilizzare una microsiringa da 10 microlitri per caricare due microlitri di standard e campioni nei pozzetti.

Evitare di utilizzare le corsie più esterne che tendono a far scorrere male i campioni e lasciano una corsia vuota tra i campioni. Assemblare la camera superiore dell'apparecchio per la corsa del gel e posizionare il gel in un serbatoio di corsa raffreddato contenente un tampone PACE di una volta. Riempi la camera superiore con un tampone PACE di una volta.

Accendi l'alimentazione e fai funzionare il gel a 200 volt per 30 minuti. Dopo 30 minuti, aumentare la tensione a 1.000 volt per un'ora e 40 minuti. Proteggere il gel dalla luce.

Inizia strofinando il sistema di imaging su gel con un panno umido privo di lanugine per assicurarti che sia privo di polvere. Rimuovere il gel dal serbatoio PACE e guardarlo brevemente mentre il gel è ancora nelle lastre di vetro per determinare se il fronte del colorante è ancora sul gel. Usa uno strumento a cuneo per aprire il gel e mentre il gel è ancora su una lastra di vetro, usa un tagliapizza per rimuovere sia il gel di impilamento che il fondo del gel se la parte anteriore del colorante è ancora sul gel.

Erogare circa cinque millilitri di acqua sulla superficie del transilluminatore e poi trasferire il gel direttamente sul transilluminatore. Utilizzando il software, impostare il filtro su UV 605 e accendere il transilluminatore UV a onde lunghe. Scatta diverse immagini con vari tempi di esposizione, assicurandoti di spegnere la luce UV tra le immagini per evitare di degradare la fluorescenza.

Assicurarsi che almeno due delle immagini non abbiano bande sature. Salva i file come immagini TIFF ad alta risoluzione. Viene mostrato un gel rappresentativo di un saggio PACE standard del contenuto di mannano della parete cellulare.

Le corsie uno, due e tre mostrano una scala di oligosaccaridi acquistati commercialmente rispettivamente a cinque, 10 e 50 picomoli. La corsia quattro mostra una digestione con mannanasi del glucomannano di konjac che funge da controllo positivo sia per la digestione enzimatica che per la reazione di derivatizzazione in presenza dell'enzima e dei sali tampone. La corsia cinque mostra l'impronta digitale PACE di un fusto di Arabidopsis wild-type.

La corsia sei mostra l'impronta digitale PACE dello stelo di una pianta di Arabidopsis priva della principale mannano sintasi. Rispetto al wild-type, è presente solo una piccola quantità di mannano, come evidenziato dalla ridotta intensità di banda per tutti gli oligosaccaridi derivati dalla mannanasi. La corsia 10 mostra l'impronta digitale PACE del legno di pino, che contiene galattoglucomannano e ha un modello di oligosaccaridi rilasciati chiaramente diverso da quello dell'Arabidopsis.

Le corsie sette, otto, nove e 11 sono vari controlli negativi che rivelano bande aspecifiche contrassegnate da asterischi che dovrebbero essere escluse dall'analisi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come analizzare la struttura del mannano utilizzando PACE. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata ad altri polisaccaridi di interesse utilizzando diverse glicosilidrolasi.

Abbiamo avuto successo nell'applicare questa tecnica a molte altre specie vegetali, oltre all'Arabidopsis, così come ad altre specie non vegetali come il lievito, la mannano.