Name: Caratterizzazione strutturale di Mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Impara a caratterizzare i polisaccaridi della parete cellulare vegetale usando l'elettroforesi su gel PACE. Questo metodo permette di analizzare la struttura e la quantità di mannano senza attrezzature costose.

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Il metodo ritmo è stato sviluppato e ottimizzato da vari membri del gruppo di Dupree (Università di Cambridge, UK) nel corso degli anni, e apprezziamo tutti i loro contributi. Questo lavoro è stato finanziato nell'ambito del DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) sostenuto da u. s. Department of Energy, Office of Science, ufficio di biologico e ricerca ambientale, attraverso contratto DE-AC02-05CH11231 tra Lawrence Berkeley National Laboratory e il u. s. Department of Energy. Ringraziamo anche Thea Pick e Vy Ngo per aiuto per preparare i campioni di csla9 .

1. raccolta di materiale vegetale <ol><li>raccolto materiale vegetale fresco (~ 20 mg) e immediatamente immergerlo in etanolo al 96% (v/v) e incubare a 70 ° C per 30 min; questo disattiva qualsiasi parete cellulare presenti enzimi degradativi. Per materiale secco, iniziare dal passaggio 2. 
	Attenzione: L'etanolo è infiammabile. 
	Nota: Una singola foglia di staminali o Rosetta fornirà abbastanza materiale per l'analisi. Tuttavia, meno errori derivano se una maggiore quantità di tessuto è riunite e analizzate dal momento che questo è più facile da pesare e gestire.</li>
	<li>Registrare accuratamente tessuto tipo e Stadio di sviluppo, come struttura di polisaccaride varia con entrambi. Ad esempio, con thaliana di Arabidopsis (usato qui), fase il tessuto secondo i metodi da Boyes et al. 15 Nota: nel presente protocollo, abbiamo usato la metà inferiore del fusto infiorescenza, dove il primo anemofila è completamente allungato ma non ingiallimento.</li></ol>
 2. residuo insolubile preparazione dell'alcool (aria) <ol><li>preparare aria, seguendo il metodo di Mortimer et al. 9 o un altro metodo simile, al fine di produrre una polvere priva di zuccheri solubili, come saccarosio e amido.</li>
</ol> 3. Aliquotare e pre-trattamento dell'aria Nota: l'esatta quantità di aria necessaria per ogni campione dipenderà (a) l'abbondanza di polisaccaride di interesse nel materiale e (b) la dimensione media degli oligosaccaridi rilasciato da il GH. Il metodo aggiunge una singola molecola fluorescente alla fine di ogni oligosaccaride, riducendo così il numero degli oligosaccaridi determina la sensibilità dell'esperimento. Indicativamente, per glucomannano in Arabidopsis staminali digerito con GH5/GH26 (come descritto), 500 µ g è consigliato 11, considerando che per xilano in Arabidopsis staminali digerito con GH11, 100 µ g è raccomandato come Mortimer &#39; Studio s 3. <ol><li>pesare aria (10-15 mg) in una provetta da centrifuga 15 mL e aggiungere H 2 O a una concentrazione finale di 2 mg/mL. Vortice per ottenere una sospensione anche. Se questo è problematico, quindi utilizzare un omogeneizzatore di vetro per aiutare questo processo.</li>
	<li>Aliquot 500 µ g in microfuge tubi. Asciugare le aliquote utilizzando una centrifuga vuoto (Vedi la Tabella materiali) durante la notte a 30 ° C.</li>
	<li>Pre-trattamento aria con 1 M NaOH (20 µ l) per 1 h a temperatura ambiente; questo de-acetila i polisaccaridi e gonfia le microfibrille di cellulosa, interrompendo la struttura di biomassa e consentendo l'accesso di GH. 
	Nota: Questo passaggio può essere ignorato per polisaccaridi purificati. ATTENZIONE &#8211; forte acido/base.
	<ol><li>Includono un'aliquota per un controllo di aria no-enzima (trattati allo stesso modo come tutti i campioni, eccetto il passaggio 4.1. è escluso).</li>
	</ol></li> <li>Aggiungere 200 µ l di H 2 O e 20 µ l 1 M HCl per neutralizzare. Prova che il pH è ~ 6-7 rimuovendo 1 µ l e spotting sulla carta nastri di indicatore di pH.</li>
	Tampone di acetato di ammonio 1 M di aggiungere 50 µ l di <li>, pH 6.0 (o qualunque pH è appropriato per il GHs utilizzato nello studio) e H 2 O per ottenere un volume totale di 500 µ l. 
	Nota: Acetato di ammonio è usato poiché esso sublima durante l'essiccazione, e quindi non aggiunge ulteriori sale al campione. Un eccesso di sale può portare a scarsa forma di banda e ad alta risoluzione sul gel ritmo.</li>
</ol> 4. Idrolisi dell'aria con Glycosyl Hydrolases (GHs) Nota: come accennato nella discussione, la purezza del GHs è critica. Utilizzare solo heterologously espressi, enzimi purificate per affinità. Al ricevimento di ogni lotto dal produttore, idrolizzano le aliquote definite di substrato (ad es., 500 µ g aria) con aumento della quantità di GH durante la notte (ad esempio, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unità / µ l). Quando c'è un eccesso di GH, l'impronta PACE avrà un aspetto identico. Un eccesso di enzima è necessario per fornire un risultato riproducibile perché deve essere certo che la reazione di idrolisi si sta avvicinando l'endpoint.
<ol><li>Aggiungi un importo predeterminato (Vedi sopra) di mannanases (GH5 e GH26 11) per le aliquote di aria nel buffer da passo 3.5, nonché un positivo controllo (30 µ g di glucomannano di konjac) e un controllo negativo no-aria (enzima mix in un tubo vuoto). Vortice e spin poi brevemente a raccogliere la miscela di reazione nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Incubare per una notte a 37 ° C (oppure la temperatura appropriata per il GH di scelta) con movimentazione delicata (~ 100 giri/min).</li>
	<li>Fermare la reazione incubando a 95 ° C per 20 min. 
	Nota: Le chiusure Cap possono essere utilizzate per sigillare tubi del microfuge flip-top.
	<ol><li>Centrifugare utilizzando un panca superiore microfuge alla massima velocità per 10 min e conservare il surnatante.</li>
	</ol></li> <li>Risospendere il pellet in 250 µ l di H 2 O, centrifuga come sopra e conservare il surnatante.</li>
	<li>Combinare entrambi i surnatanti e asciugare in una centrifuga vuoto (Vedi la Tabella materiali) a 30 ° C (~ 3 h o durante la notte senza riscaldamento).</li>
</ol> 5. Preparazione di standard di oligosaccaride <ol><li>magazzino di 1 mM di preparare soluzioni in H 2 O di mannosio (uomo), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (Man 5) e mannohexaose (Man 6), tutti i β, 1-4 collegati. Aliquotare e conservare a-20 ° C fino a quando richiesto.</li>
	<li>Preparare 3 diverse concentrazioni di un uomo 1-6 miscela combinando 1 µ l (Standard S1), 2 µ l (S2) o 5 µ l (S3) di tutti e sei.</li>
	<li>Secco in una centrifuga vuoto (Vedi Tabella materiali) a 30 ° C (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization di oligosaccaridi <ol><li>preparare una soluzione stock di 0,2 M formiche (acido 8-amminonaftalen-1,3,6-trisulfonic) in H 2 O: acido acetico 17:3. Brodo caldo a 60 ° C per sciogliere completamente il solido. Conservare a-20 ° C, al riparo dalla luce, per 2-3 mesi.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 0,2 M di 2-Picolina borano (2-PB) in DMSO. Questo è estremamente igroscopico, quindi immediatamente risospendere tutta polvere al ricevimento in DMSO. Aliquotare e conservare a-20 ° C per 1-2 anni. Disgelare aliquote come richiesto (conservare a 4 ° C per 2 settimane e poi scartare).</li>
	<li>Preparare il tampone di derivatizzazione di H 2 O: acido acetico: DMSO alle 17:03:20.</li>
	<li>Per ogni campione, aggiungere 5 µ l di formiche, 5 µ l di 2-PB e 10 µ l di tampone di derivatizzazione. Spin brevemente per raccogliere sul fondo del tubo, vortice accuratamente e poi girare di nuovo brevemente. Vedere la Figura 1 per reazione descrizione.</li>
	<li>Incubare i campioni durante la notte a 37 ° C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Secco in una centrifuga vuoto (Vedi Tabella materiali) a 30 ° C (~ 2 h).</li>
	<li>Risospendere campioni e standard in 100 µ l 3 M urea. Conservare a-20 ° C, al riparo dalla luce fino a quando richiesto.</li>
</ol> 7. Preparazione del ritmo gel Nota: montaggio dell'attrezzatura di colata di gel dipenderà molto il marchio. Qui, abbiamo uSe un sistema di elettroforesi verticale (Vedi Tabella materiali), dotato di distanziali lastre di vetro di 18 x 24 cm e 1,5 mm.
<ol><li>Montare l'attrezzatura della colata gel per il produttore &#39; istruzioni s.</li>
	Buffer di ritmo di 10 x <li>make (1 M Tris-borato, pH 8.2) come segue: aggiungere 121,14 g di Tris-Base a ~ 400 mL di H 2 O e mescolare per sciogliere. Aggiustare il pH a 8.2 mediante aggiunta di acido borico solido (circa 60 g) e quindi rendere il volume fino a 1 L.</li>
	<li>Fare un 10% (p/v) di ammonio persolfato (APS) magazzino H 2 O. aliquota e memorizzare una volta alle aliquote di disgelo di-20 ° C., conservare a 4 ° C e scartare dopo 2 settimane.</li>
	<li>Fare e versare il gel di risoluzione. Per l'attrezzatura di cui sopra, 1 gel equivale a 50 mL. In una provetta da centrifuga 50 mL, mescolare H 2 O (20,2 mL), 5 mL di tampone per ritmo 10x, 24,6 mL 40% di acrilammide/Bis-acrilammide (29: 1 acrylamide:Bis). (Attenzione: tossici).
	<ol><li>Aggiungere 200 µ l di APS e 20 µ l di N, N, N, n-tetrametil-etilendiammina (TEMED). Invertire delicatamente per mescolare (per evitare di introdurre bolle d'aria). Versare il gel utilizzando un sierologici o altri pipetta di grande volume, a ~ 4 cm sotto la parte superiore delle lastre vetrate. Prestare attenzione alla possibilità di essere intrappolati nel gel le bolle d'aria. Se essi fare, smettere di versare e tilt/toccare il gel per liberarli.</li>
	</ol></li> <li>Il gel con isopropanolo (infiammabile cautela :) o, con attenzione, con H 2 O. Consenti gel per polimerizzare (20-30 minuti), poi versare lo strato superiore di overlay. Se è stato utilizzato isopropanolo, quindi lavare 2x con H 2 O. a secco liquido in eccesso con carta assorbente.</li>
	<li>Fare e versare il gel d'impilamento. Mix di 6,8 mL H 2 O, 1 mL di tampone di ritmo 10x, 2,8 mL acrilammide/Bis-acrilammide (Attenzione: tossici), 80 µ l APS e 8 µ l di TEMED in una provetta da centrifuga da 15 mL. Inverti per mescolare e overlay sopra gel polimerizzato di risoluzione. Inserire delicatamente pettini, evitando bolle d'aria intrappolamento sotto i denti del pettine.</li>
	<li>Consenti gel per polimerizzare (20-30 min.), avvolgere in tessuto umido e poi nella pellicola trasparente e conservare a 4 ° C fino a quando richiesto. Negozio con i pettini in luogo. 
	Nota: Ritmo gel possono essere memorizzati per un massimo di 2 settimane (anche se meno di una settimana è l'ideale), se sono mantenuti umidi.</li>
</ol> 8. In esecuzione di un ritmo Gel <ol><li>utilizzare un pennarello indelebile per etichettare le posizioni bene sul vetro, che aiuterà a tenere traccia di ordine di caricamento, e nell'individuare dove i pozzi sono una volta rimosso il pettine.</li>
	<li>Rimuovere il pettine. Riempire i pozzetti con buffer di ritmo di 1 x.</li>
	<li>Utilizzare un 10 µ l microsiringa per caricare 2 µ l di standard e campioni nei pozzetti. Evitare di utilizzare le corsie più esterne, che tendono a correre campioni poco.</li>
	<li>Montare la camera superiore dell'apparato gel-esecuzione e inserire il gel in un serbatoio in esecuzione raffreddato (~ 10 ° C) (° C 10) contenente 1 x ritmo tampone. Riempire la camera superiore con buffer di ritmo di 1 x.</li>
	<li>Accendere il potere ed eseguire il gel a 200 V (costante V) per 30 minuti e quindi aumento di tensione fino a 1000 V per 1h 40 min. Proteggere il gel dalla luce (ad esempio, eseguendo il wrapping serbatoi in sacchi neri della spazzatura). 
	Nota: Controllare i gel ~ 5 min dopo aver acceso la tensione e poi un altro 5 minuti dopo l'aumento della tensione fino a 1000 V. Se l'alimentatore è in grado di mantenere la tensione, poi c'è probabilmente un problema di buffer. Rimuovere il gel dal serbatoio. Rimontare l'alloggiamento superiore, verificare attentamente il posizionamento di tutte le guarnizioni. Un grande chip sul bordo superiore della lastra di vetro può impedire la piastra formando una buona tenuta con la guarnizione. Questo di solito può essere temporaneamente risolto aggiungendo una goccia di agarosio fuso 5% (p/v) per la parte scheggiata del vetro, prima di aggiungere l'alloggiamento superiore.</li>
</ol> 9. Visualizzazione di un gel di ritmo Nota: utilizzare un gel dotato di lungo-fluttuano UV bulbi nel transilluminatore e un filtro di emissione per la fotocamera che è adatto per il fluoroforo, qui 530 nm sistema di imaging. In alternativa, uno scanner laser può essere utilizzato anche, come descritto in Goubet 2.
<ol><li>Garantire il gel sistema di imaging è privo di polvere pulendo con tessuto umido privo di lanugine.</li>
	<li>Rimuovere il gel nel serbatoio di ritmo e mostra brevemente mentre il gel è ancora nelle lastre di vetro (&#60; 80 ms) per determinare se la parte anteriore della tintura è ancora sul gel.</li>
	<li>Aprire il gel utilizzando uno strumento di Cuneo e mentre il gel è ancora su un vetro piatto, utilizzare una taglierina della pizza per rimuovere sia il gel d'impilamento e, se la parte anteriore della tintura è ancora sul gel, il fondo del gel.</li>
	<li>Mettere ~ 5 mL H 2 O sulla superficie del transilluminatore e quindi trasferire il gel direttamente sul transilluminatore. Impostare il filtro UV 605 e accendere il transilluminatore UV longwave (Vedi Tabella materiali) utilizzando il software. 
	Nota: Il fluoroforo formiche qui utilizzato ha un'eccitazione/emissione di 353/520 nm.</li>
	<li>Prendere diverse immagini a diversi tempi di esposizione (per esempio, 100 ms a 10 s). Accertarsi che la luce UV è spento tra le immagini cliccando sul pulsante di luce UV (per disattivarlo) per evitare di degradare la fluorescenza. Non garantire che almeno 2 delle immagini bande saturi (il software di imaging di gel lo indicherà).</li>
	<li>Salva file come immagini ad alta-resolution.tif. 
	Nota: Immagini possono essere analizzati utilizzando il software fornito con il gel sistema di imaging, o utilizzando software di analisi di immagine liberamente disponibili, come ad esempio ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Vedere la sezione di risultati per una discussione di quantificazione.</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

PACE è un metodo semplice per caratterizzare la struttura del polisaccaride. Può essere applicato a qualsiasi polisaccaride per cui sono noti GHs con attività caratterizzate, vedere numerosi esempi nella letteratura1,6,9,11. TT è stato applicato anche alla caratterizzazione di romanzo GHs12,13,18 e glicosiltrasferasi9, facendo uso di substrati definito polisaccaride e accettori.
Risultati riproducibili, interpretabili dipendono dai tre passaggi chiave. In primo luogo, il GHs utilizzato dovrebbe essere esente da contaminanti attività. Questo è il miglior ottenuta utilizzando solo heterologously espressi, purificate per affinità, enzimi. In secondo luogo, per la maggior parte degli esperimenti, è importante che l'idrolisi enzimatica dei substrati è al completamento. Questo farà sì che la stessa biomassa idrolizzata con il GH stesso dà la stessa impronta in ogni esperimento. Infine, ci dovrebbe essere un eccesso di fluoroforo nella reazione di derivatizzazione. Questo assicura che le estremità riducente disponibili siano etichettate al vicino al 100%. Questo si tradurrà in alta riproducibilità dei risultati, nonché i dati quantitativi.
Gel e reagente di qualità sono fondamentali per garantire dati riproducibili. Buffer di scarsa qualità, soprattutto del pH errato, aria bolle nel gel, e campioni con un eccesso di sale possono tutti fattore di risoluzione e ritenzione effetto di oligosaccaridi. Tuttavia, l'inclusione dei controlli consigliati descritti nella sezione protocollo e risultati permetteranno di risoluzione dei problemi.
RITMO è limitata dalla sua capacità di identificare gli oligosaccaridi. Per alcuni esperimenti, un'impronta digitale semplice è tutto ciò che è necessario. Tuttavia, per veramente quantificare la quantità di glucomannano in un campione di aria, ad esempio, l'identità di tutti gli oligosaccaridi rilasciati è richiesto, che è un processo che richiede tempo. Questo è più semplice per meno polisaccaridi complessi come xilano3. Poiché esistono pochi oligosaccaride standard disponibile in commercio, non essere sempre possibile o desiderabile per identificare tutte le bande. In questo caso, ritmo può fornire dati molto gratuiti alla spettrometria di massa (cioè, MALDI-CID9 o ESI-MS7e NMR6). Per questi metodi, è spesso utile fare una preparazione su larga scala, separare dalla cromatografia di esclusione dimensionale e quindi analizzare ciascuna frazione da entrambi PACE prima del MS o NMR. Mentre è stato segnalato che bande possono essere asportati e identificati dal MALDI-CID, in pratica abbiamo trovato che questo ha un basso tasso di successo (probabilmente a causa di interazioni di oligosaccaridi etichettati con il gel di acrilammide quando esposto ai raggi UV).
L'altra limitazione importante del ritmo è la velocità effettiva. Per ottenere una buona qualità, interpretabile gel con gli opportuni controlli, ogni gel avrà solo ~ 10 campioni sperimentali, e un ricercatore può aspettare eseguire ~ 4 ritmo gel al giorno. Recentemente, una versione del ritmo mediante elettroforesi capillare (CE) è stato sviluppato19, che permette la preparazione di campioni in piastre da 96 pozzetti. Esso è stato utilizzato con successo per caratterizzare le attività enzimatiche glycosyltransferase e polisaccaride strutture6,19, anche se richiede l'accesso a una macchina CE, che possa essere costosa da acquistare e mantenere.

Polisaccaride analisi mediante elettroforesi su gel (PACE) è un metodo per la caratterizzazione dettagliata di polisaccaridi1,2,3. Polisaccaridi di parete delle cellule vegetali sono notoriamente difficili da analizzare, e la maggior parte dei metodi richiedono attrezzature costose, operatori specializzati e grandi quantità di materiale purificato. Qui, descriviamo un semplice metodo per ottenere dettagliate informazioni strutturali polisaccaride, compresa la risoluzione di isomeri strutturali.
Comprensione pianta parete cellulare polisaccaride struttura è necessaria per quei ricercatori esplorare la biosintesi della parete cellulare di pianta o il ruolo della parete delle cellule vegetali in via di sviluppo di pianta. Recentemente, tuttavia, è diventato interessante per un più ampio gruppo di ricercatori a causa del fuoco sull'utilizzo di biomasse vegetali (essenzialmente la parete cellulare) come materia prima per produrre biocarburanti e prodotti biochimici4composizione parete cellulare vegetale. Ad esempio, efficiente saccarificazione enzimatica di questo materiale richiede una comprensione dettagliata delle strutture polisaccaride, affinché cocktail enzimatico ottimizzato può essere selezionato5.
PACE ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi che lo rendono ideale per l'analisi rapida di glycan complesse strutture. In primo luogo, non richiede purificazione del polisaccaride in questione, come è richiesto per la soluzione dello stato a risonanza magnetica nucleare (NMR)6. In secondo luogo, il ritmo può risolvere isomeri strutturali, a differenza di spettrometria di massa (MS, ad es., matrix-assistita laser desorption/ionization (MALDI) e ionizzazione electrospray (ESI)), che può anche essere difficile da eseguire mediante cromatografia liquida (LC) 7. in terzo luogo, il ritmo è molto sensibile, con risoluzione bassa-picomole, a differenza di cromatografia di strato sottile (TLC) o cromatografia su carta. Infine, non richiede costose attrezzature o specialista conoscenza, come è il caso per MS, NMR e LC.
Il metodo di ritmo si basa sulla specificità degli enzimi di glicosil idrolasi (GH), che prendono di mira alcuni legami glicosidici in una miscela di polisaccaridi. Quando l'enzima GH agisce sulla catena polisaccaride, rivela una riduzione fine che può quindi essere chimicamente derivatizzati, in questo caso con un'etichetta fluorescente. La mangiavano parte del campione è pertanto sottoposta a rendering non rilevabile da questo metodo. Gli oligosaccaridi con etichettati vengono quindi separati in un gel di acrilammide grande formato tramite l'elettroforesi. Questo dà un'eccellente risoluzione di molecole molto simili, ad esempio, i trisaccaridi Glc-uomo-uomo e uomo-Glc-Glc avrà un diverso Rf.
RITMO è stato usato estesamente per caratterizzare xilano diverse strutture attraverso pianta specie8, per identificare glycosyltransferase mutanti di Arabidopsis6,9,10,11 , per eseguire analisi di glycosyltransferase9e caratterizzare nuovi GH attività12,13. Abbiamo anche recentemente ha utilizzato per caratterizzare mannan della parete cellulare lievito (mensa e Mortimer, in preparazione). Qui descriviamo un metodo per la caratterizzazione di struttura della pianta parete cellulare glucomannano, basata su precedenti rapporti11,14.

<table><tbody><tr><td>Standard Oligosaccaharide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazima</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannano (Konjac; Bassa viscosità)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Altri prodotti chimici speciali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td><td>(Sonde molecolari) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picolina borano</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrilammide/bis-acrilammide (29:1 acrilammide:Bis)</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>Attrezzature speciali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit colata gel</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>lastre di vetro 18x24 cm, distanziali 0,75 mm</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua a ricircolo di raffreddamento&nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Deve essere in grado di mantenere la temperatura a ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Ordina con filtri appropriati al fluoro e il transilluminatore deve essere dotato di lampadine UV a onde lunghe</td></tr><tr><td>Alimentatore ad alta tensione</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga sottovuoto (Speedvac)</td>Sistema di elettroforesi verticale su gel <td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>Glicosil idrolasi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Questi possono essere ottenuti da aziende come Megazyme (https://www.megazyme.com/) o Prozomix (http://www.prozomix.com/), oppure possono essere espressi internamente richiedendo il plasmide alla ricerca pertinente gruppo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Forniture di laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Provetta per centrifuga ( Provette per centrifuga Falcon, Polipropilene, sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 ml ( Provette per centrifuga Falcon, Polipropilene, sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging su gel ( Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione strutturale di mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Polisaccaridi di parete delle cellule vegetali sono notoriamente difficili da analizzare, e la maggior parte dei metodi richiedono attrezzature costose, operatori specializzati e grandi quantità di materiale purificato. Qui, descriviamo un semplice metodo per ottenere dettagliate informazioni strutturali polisaccaride, compresa la risoluzione di isomeri strutturali. Analisi di polisaccaride tramite elettroforesi del gel (PACE), materiale della parete cellulare vegetale è idrolizzato con glicosil idrolasi specifici per il polisaccaride di interesse (ad esempio, mannanases per mannan). Gel di poliacrilammide di grande formato vengono quindi utilizzati per separare gli oligosaccaridi rilasciati, che sono stati etichettati fluorescente. Gel possono essere visualizzati con un gel modificato sistema di imaging (Vedi Tabella materiali). L'impronta di oligosaccaride risultante sia paragonabile qualitativamente o, con la replica, quantitativamente. Sollevatore e ramificazione informazioni può essere stabilite utilizzando ulteriori glicosil idrolasi (ad es., mannosidases e galactosidases). Mentre questo protocollo descrive un metodo per analizzare la struttura di glucomannano, può essere applicato a qualsiasi polisaccaride per cui esistono caratterizzato glicosil idrolasi. In alternativa, può essere utilizzato per caratterizzare nuovi glicosil idrolasi utilizzando substrati definito polisaccaride.

Qui vi mostriamo un gel di ritmo esempio eseguito per ogni protocollo, insieme alla descrizione di assistervi nell'interpretazione dei dati e risoluzione dei problemi, e questo è seguito da una guida generale per successo ritmo gel interpretazione13,16. Un gel rappresentativo di un ritmo standard è illustrato nella Figura 2analisi del contenuto di mannano parete cellulare ed è descritto lane di corsia.
Standard Corsie 1, 2 e 3 mostrano una scaletta di oligosaccaridi acquistati in commercio (Man1- Man6) a 5 (S1), 10 (S2) e 50 (S3) pmol concentrazione. Quando si riceve un nuovo lotto di un oligosaccaride commerciale, è importante controllare la purezza su un gel. Molti oligosaccaridi, particolarmente tetrasacccharides e più a lungo, può avere una contaminazione significativa con oligosaccaridi di altri gradi di polimerizzazione (DPs), come mostrato qui per Man6 (contrassegnati con *). Mentre la quantificazione di un gel, è importante avere almeno 3 concentrazioni degli standard, poiché è necessario per il calcolo della curva standard. Calcolo della curva standard può anche essere utile per garantire che la reazione di derivatizzazione è essenzialmente al completamento. Standard di concentrazioni note consentire confronti tra gel e un controllo utile per qualità di separazione e derivatizzazione.
Controllo positivo Corsia 4 Mostra una digestione mannanasi di glucomannano di konjac. Glucomannano di konjac è disponibile commercialmente, e mentre non ha la stessa struttura che, ad esempio, è trovato in Arabidopsis, serve a due scopi. In primo luogo, è un controllo importante per la digestione enzimatica. Il ricercatore deve stabilire che cosa un substrato commerciale digerito con loro GHs di scelta sembra quando digerito a completamento (cioè, un vasto eccesso di GH viene aggiunto alla reazione). Se in futuro esperimenti il modello cambia, questo può indicare sia una perdita di attività o contaminazione dello stock GH. In secondo luogo, serve come controllo per la reazione di derivatizzazione in presenza di sali di enzima e buffer. Se le norme sembrano buone, ma il controllo positivo è scarso, quindi questo potrebbe indicare che un componente della reazione di idrolisi è inibitorio per la derivatizzazione.
Wild type (WT) Arabidopsis gambo aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Lane 5 Mostra l'impronta di ritmo di uno stelo di Arabidopsis WT (confronta con riferimenti11,14).
csla9 Arabidopsis gambo aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Lane 6 Mostra l'impronta del ritmo dello stelo da un Arabidopsis pianta carente i principali spettacoli mannano sintasi11del gambo. Confrontare il WT e controllo negativo le impronte digitali. Mentre la maggior parte del mannan è assente in questa pianta, rimane una piccola quantità, come testimoniano le intensità di banda ridotto per tutti gli oligosaccaridi mannanasi-derivato questo è sintetizzato da ulteriori mannano sintasi (CSLA2, 3)11.
Controllo negativo - enzima solo Lane 8 mostra bande sul gel che non sono specifiche che derivano da contaminanti nella mannanasi cocktail e dovrebbero essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Controllo negativo - WT aria solo Lane 9 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Controllo negativo- csla9 Aria solo Lane 10 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Pino legno aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Corsia 7 Mostra l'impronta di ritmo di legno di pino, che contiene galactoglucomannan. Questo ha chiaramente un diverso modello di oligosaccaridi rilasciati per Arabidopsis, grazie alla sua struttura diverso.
Controllo negativo - pino aria solo Lane 11 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Interpretare un gel di ritmo è relativamente semplice, ma richiede la consapevolezza dei seguenti punti. Per dati affidabile, si raccomanda di effettuare ritmo su almeno 3 indipendentemente coltivati biologica replica, e si consiglia di eseguire almeno 2 tecnici replicati su ogni replica biologico. I comandi descritti sono fondamentali per l'interpretazione, come fasce non specifiche devono essere escluse. Si consiglia inoltre di caricamento di campioni in un ordine diverso sui gel di replicare, per escludere effetti derivanti dall'illuminazione irregolare del transilluminatore. Accurata interpretazione richiede analisi delle fasce che non sono saturi. Poiché alcune impronte oligosaccaride possono contenere entrambi polisaccaridi abbondanza molto alta e bassa, si consiglia di analizzare le esposizioni multiple del gel stesso. Gli standard possono essere utilizzati per normalizzare tra immagini diverse.
Per alcuni tipi di esperimenti, può essere desiderabile per quantificare l'importo del polisaccaride nella preparazione aria. Mentre è possibile quantificare un gel di ritmo, richiede conoscenza dell'esatta identità molecolare di ogni oligosaccaride rilasciato dal GHs e dove si trova il ritmo gel. Questo attualmente non è completamente noto per mannan, ma è stato determinato per altri polisaccaridi ad esempio xilano3. Gli standard forniscono un modo di normalizzazione tra gel, anche quando non si esegue la quantificazione e così vi assisterà in ogni analisi semi-quantitativa o qualitativa.
Individuare la struttura di oligosaccaridi individuali può essere raggiunto utilizzando cocktail di GHs. sequenziale aggiunta di ulteriore GHs può rivelare informazioni dettagliate sui collegamenti e sostituzioni di oligosaccaridi rilasciati (per esempio, l'aggiunta di β - 1,4 - glucosidasi che agisce all'estremità non riducente rivelerà quali oligosaccaridi nella miscela contengono tale funzionalità). Enzimi disponibili includono galactosidases, glucuronidases e glucosidasi (Vedi il database di Chriss16 per ulteriori informazioni); vedere Hogg, d. et al. 17 come un esempio.
Il protocollo di cui sopra può essere utilizzato per caratterizzano l'attività del GHs sconosciuto. In questo caso, una biomassa definito, come Arabidopsis staminali o konjac glucomannan, dovrebbe essere utilizzato per schermata il GHs sconosciuto13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Figura 1 : Questo Mostra lo schema per la derivatizzazione fluorescente di oligosaccaridi con formiche. Per l'ultima volta da Goubet2.<a href="//ecsource.jov%20href="></a>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"target = blank" &gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Figura 2 : Gel rappresentante ritmo mostrando l'impronta di mannano da Arabidopsis, pino e un mutante di Arabidopsis (csla9) che ha alterato la biosintesi di mannano. AlR è idrolizzato con un cocktail di mannanasi, e gli oligosaccaridi rilasciati sono stati derivatizzati con un fluoroforo. Gli oligosaccaridi sono stati separati mediante elettroforesi in base a dimensione, forma e carica. Una scaletta di manno-oligosaccaridi (Man1-6) è indicata per aiutare a identificare la relativa mobilità di oligosaccaridi rilasciati, e un'idrolisi di mannano purificato (derivato da konjac) è indicata come controllo positivo. * = fasce non specifiche. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Un protocollo per l'analisi strutturale dei polisaccaridi mediante elettroforesi su gel (APCE), utilizzando mannano come esempio, è descritto.

Caratterizzazione strutturale di Mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare i polisaccaridi della parete cellulare delle piante. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo della biologia della parete cellulare vegetale, tra cui la struttura e la quantità del glucomannano. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede una formazione specializzata o attrezzature costose.In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con l'interpretazione dei gel, quindi l'inclusione e la comprensione di tutti i controlli descritti è fondamentale. L'alcol e il residuo solubile, o ARIA, sono stati precedentemente preparati a partire da materiale vegetale raccolto come descritto nel protocollo di testo. Pesare sei milligrammi di ARIA in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e aggiungere acqua fino a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro.Vortice per ottenere una sospensione uniforme. Aliquotare 500 microgrammi in tubi microfuge. Asciugare le aliquote utilizzando una centrifuga sottovuoto a 30 gradi Celsius durante la notte.Pretrattare l'AIR comprensivo di un'aliquota per un controllo AIR senza enzimi con un idrossido di sodio molare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, aggiungere 200 microlitri di acqua e 20 microlitri di acido cloridrico molare a ciascun tubo per neutralizzare l'idrossido di sodio. Verifica che il pH sia di circa sei o sette rimuovendo un microlitro e posizionandolo sulle strisce indicatrici di pH di carta.Aggiungere 50 microlitri di un tampone molare in acetato di ammonio pH 6,0 e aggiungere acqua per un volume totale di 500 microlitri a ciascuna provetta. Per iniziare questa procedura, aggiungere una quantità predeterminata di mannanasi alle aliquote e al tampone AIR. Includere controlli negativi appropriati e un controllo positivo.Vorticare e poi girare brevemente per raccogliere la miscela di reazione sul fondo del tubo. Incubare a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione per una notte. Il giorno seguente, interrompere la reazione incubando a 95 gradi Celsius per 20 minuti.Centrifugare alla massima velocità per 10 minuti. Conservare il surnatante e risospendere ogni pellet in 250 microlitri di acqua. Centrifugare nuovamente e conservare il surnatante.Unire entrambi i surnatanti e asciugare in una centrifuga sottovuoto a 30 gradi Celsius per circa tre ore. Prima della procedura di derivatizzazione, preparare i reagenti necessari come descritto nel protocollo di testo. Riscaldare la soluzione madre di 0,2 ANTS molari a 60 gradi Celsius per sciogliere completamente il solido.A ciascun campione, aggiungere cinque microlitri di ANTS, cinque microlitri di due-picolina-borano e 10 microlitri di tampone di derivatizzazione. Girare brevemente per raccogliere il fondo del tubo, vorticare a fondo e poi girare di nuovo brevemente. Incubare i campioni durante la notte a 37 gradi Celsius al riparo dalla luce.Il giorno seguente, asciugare i campioni in una centrifuga sottovuoto a 30 gradi Celsius per circa due ore. Risospendere ogni campione in oligosaccaridi standard e 100 microlitri di urea a tre molari. Conservare a meno 20 gradi Celsius al riparo dalla luce fino al momento del bisogno.L'assemblaggio dell'attrezzatura per la colata di gel dipenderà dalla marca. Per l'attrezzatura utilizzata in questa dimostrazione, un gel equivale a 50 millilitri. In una provetta da centrifuga da 50 millilitri, mescolare 20,2 millilitri di acqua, cinque millilitri di tampone PACE 10x, 24,6 millilitri di acrilammide al 40%, 200 microlitri di APS e 20 microlitri di TEMED.Capovolgere delicatamente per amalgamare facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Utilizzare una pipetta sierologica o di altro volume per versare il gel risolutivo a circa quattro centimetri sotto la parte superiore delle lastre di vetro. Sovrapporre accuratamente il gel con alcol isopropilico.Lasciare polimerizzare il gel per 20-30 minuti. Versare lo strato superiore. Asciugare il liquido in eccesso con carta assorbente.Quindi, prepara il gel per impilare. In una provetta da centrifuga da 15 millilitri, mescolare 6,8 millilitri di acqua, un millilitro di tampone 10x PACE, 2,8 millilitri di acrilammide/bis-acrilammide, 80 microlitri di APS e otto microlitri di TEMED. Capovolgere per mescolare e sovrapporre sopra il gel risolutivo polimerizzato.Inserire delicatamente il pettine evitando di intrappolare bolle d'aria sotto i denti del pettine. Dopo che il gel si è polimerizzato, avvolgerlo in un fazzoletto umido e poi in un involucro di plastica e conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per aiutare a tenere traccia dell'ordine di carico e a identificare dove si trovano i pozzetti una volta rimosso il pettine, utilizzare un pennarello indelebile per etichettare le posizioni dei pozzetti sul vetro.Rimuovere il pettine. Riempire i pozzetti con un tampone PACE one-X. Utilizzare una microsiringa da 10 microlitri per caricare due microlitri di standard e campioni nei pozzetti.Evitare di utilizzare le corsie più esterne che tendono a far scorrere male i campioni e lasciano una corsia vuota tra i campioni. Assemblare la camera superiore dell'apparecchio per la corsa del gel e posizionare il gel in un serbatoio di corsa raffreddato contenente un tampone PACE di una volta. Riempi la camera superiore con un tampone PACE di una volta.Accendi l'alimentazione e fai funzionare il gel a 200 volt per 30 minuti. Dopo 30 minuti, aumentare la tensione a 1.000 volt per un'ora e 40 minuti. Proteggere il gel dalla luce.Inizia strofinando il sistema di imaging su gel con un panno umido privo di lanugine per assicurarti che sia privo di polvere. Rimuovere il gel dal serbatoio PACE e guardarlo brevemente mentre il gel è ancora nelle lastre di vetro per determinare se il fronte del colorante è ancora sul gel. Usa uno strumento a cuneo per aprire il gel e mentre il gel è ancora su una lastra di vetro, usa un tagliapizza per rimuovere sia il gel di impilamento che il fondo del gel se la parte anteriore del colorante è ancora sul gel.Erogare circa cinque millilitri di acqua sulla superficie del transilluminatore e poi trasferire il gel direttamente sul transilluminatore. Utilizzando il software, impostare il filtro su UV 605 e accendere il transilluminatore UV a onde lunghe. Scatta diverse immagini con vari tempi di esposizione, assicurandoti di spegnere la luce UV tra le immagini per evitare di degradare la fluorescenza.Assicurarsi che almeno due delle immagini non abbiano bande sature. Salva i file come immagini TIFF ad alta risoluzione. Viene mostrato un gel rappresentativo di un saggio PACE standard del contenuto di mannano della parete cellulare.Le corsie uno, due e tre mostrano una scala di oligosaccaridi acquistati commercialmente rispettivamente a cinque, 10 e 50 picomoli. La corsia quattro mostra una digestione con mannanasi del glucomannano di konjac che funge da controllo positivo sia per la digestione enzimatica che per la reazione di derivatizzazione in presenza dell'enzima e dei sali tampone. La corsia cinque mostra l'impronta digitale PACE di un fusto di Arabidopsis wild-type.La corsia sei mostra l'impronta digitale PACE dello stelo di una pianta di Arabidopsis priva della principale mannano sintasi. Rispetto al wild-type, è presente solo una piccola quantità di mannano, come evidenziato dalla ridotta intensità di banda per tutti gli oligosaccaridi derivati dalla mannanasi. La corsia 10 mostra l'impronta digitale PACE del legno di pino, che contiene galattoglucomannano e ha un modello di oligosaccaridi rilasciati chiaramente diverso da quello dell'Arabidopsis.Le corsie sette, otto, nove e 11 sono vari controlli negativi che rivelano bande aspecifiche contrassegnate da asterischi che dovrebbero essere escluse dall'analisi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come analizzare la struttura del mannano utilizzando PACE. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata ad altri polisaccaridi di interesse utilizzando diverse glicosilidrolasi.Abbiamo avuto successo nell'applicare questa tecnica a molte altre specie vegetali, oltre all'Arabidopsis, così come ad altre specie non vegetali come il lievito, la mannano.

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