Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi

L'obiettivo generale di questo studio su un modello murino simile all'IPF è quello di monitorare longitudinalmente la fibrosi polmonare con tecniche di imaging non invasive come FMT e micro-CT. Questo metodo può far avanzare la sequenza per quanto riguarda questi specifici eventi molecolari che si verificano nella fibrosi polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i cambiamenti anatomici di specifici eventi molecolari possono essere monitorati in modo non invasivo.

Le applicazioni di queste tecnologie si estendono alla terapia della patologia IPF perché la fusione di FMT e micro-CT rappresenta la possibilità di studiare la progressione della malattia e la valutazione di nuove terapie. Inizia posizionando un topo anestetizzato sulla piattaforma di intubazione appendendolo per i suoi incisivi posti sul filo. Accendi il laringoscopio, quindi prendi un paio di pinze smussate e apri delicatamente la bocca.

Posizionare la lama del laringoscopio verso la parte posteriore della bocca fino a visualizzare l'apertura della trachea. Utilizzare l'altra mano per inserire il tubo di mandata collegato all'estremità del tubo in PE nella trachea. Ruotare la valvola a tre vie per erogare 50 microlitri di bleomicina.

Dopo l'installazione, rimuovere rapidamente il tubo dalla trachea per evitare il soffocamento. Tieni i mouse in posizione verticale per alcuni secondi. Per l'iniezione della sonda, prendere il mouse per la coda e lasciarlo afferrare il coperchio della gabbia.

Quindi afferra le spalle e tieni il topo per la collottola. Immergere la coda in un becher di acqua tiepida per far gonfiare le vene per facilitare la visualizzazione e l'inserimento dell'ago. Trova le due vene caudali su entrambi i lati della coda, non l'arteria sul lato inferiore della coda.

Inserire l'ago da 26 gauge della siringa da 1 millilitro caricata con MMP nella vena e iniettare la soluzione della sonda MMP a 10 millilitri per chilogrammo di peso corporeo. Per iniziare, inizializzare il software di acquisizione della data e aprire un nuovo studio nel database per l'esperimento. Prima di iniziare l'imaging, trasferire il topo rasato e anestetizzato al centro della cassetta di imaging.

Tenere il mouse piatto, sicuro e delicatamente compresso contro entrambe le finestre della cassetta di imaging. Quindi nella finestra di scansione del software, fare clic su Oggetto"e quindi visualizzare l'anteprima per vedere l'immagine dal vivo. Disegnare la regione di scansione sufficientemente grande in modo da catturare i tessuti che circondano l'area di fluorescenza prevista.

Una volta disegnato il ROY, fare clic su Aggiungi alla coda di ricostruzione"e quindi fare clic su Scansione"per visualizzare l'immagine del mouse. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, rimuovere il mouse dalla cassetta di imaging e riporlo nella gabbia domestica. Quantificare i picomoli di fluorescenza utilizzando lo strumento ROY e ridurre il ROY di circa 700-800 millimetri cubi sul segnale proveniente dalla regione polmonare.

Ripetere l'imaging ogni sette giorni o secondo necessità. Per eseguire l'imaging con micro-CT, accendere prima la micro-CT premendo il pulsante di accensione verde e avviare il software per riscaldare la sorgente di raggi X. Crea il database cliccando su "Nuovo database" e costruisci il browser in base al numero di topi nell'esperimento.

Prima di iniziare la scansione, selezionare i parametri di acquisizione nella finestra di controllo del software come segue. Impostare la tensione del tubo a raggi X a 90 kilovolt, la corrente del tubo a raggi X CT a 160 micro angstrom, la corrente del tubo a raggi X in tempo reale a 80 micro angstrom e il campo visivo a 36 millimetri. Selezionare nessuna tecnica di gating e alta risoluzione e quattro minuti per la tecnica di scansione.

Dopo aver anestetizzato il topo mediante inalazione di isoflurano al 3%, posizionarlo sul letto dell'animale inserito nel piccolo foro con un cono nasale che fornisce un apporto costante di anestetico. Immobilizzare le zampe con del nastro adesivo sul letto per consentire l'esposizione del torace. Sul lato successivo lo sportello dello strumento si è chiuso e attiva la modalità live per vedere la posizione del mouse in tempo reale premendo il pulsante di acquisizione.

Sposta la cuccia per allineare il torace con il campo visivo utilizzando i pulsanti sullo strumento CT. Una volta centrato il mouse, ruotare il gantry per confermare la posizione ottimale del letto selezionando 90 gradi e facendo clic su Imposta"Quindi fare clic sul pulsante di scansione TC. Fare clic su Sì" per il messaggio che informa che la sorgente di raggi X verrà attivata.

Dopo l'imaging, riposizionare gli animali nella gabbia e monitorarli fino a quando non si sono completamente ripresi dall'anestesia. Ripetere l'imaging ogni sette giorni o secondo necessità. La colorazione con il tricromo di Masson rivela la morfologia del tessuto polmonare.

Le immagini del gruppo trattato con bleomicina hanno mostrato un pattern pronunciato di fibrosi a partire dal settimo giorno, principalmente come singole masse fibrotiche e progredito al giorno 14 in conglomerati confluenti di collagene sostituito ed è rimasto inalterato fino al giorno 21. L'imaging micro-CT ripetuto ha permesso la quantificazione e la segmentazione delle vie aeree nei lobi polmonari della fibrosi. Le vie aeree erano divise in una parte centrale e una distale.

La parte distale delle vie aeree è il tratto intrapolmonare e si divide nei lobi polmonari come lobo cranico destro, lobo medio destro, lobo caudale destro, lobo accessorio destro e polmone sinistro. La quantificazione del raggio delle vie aeree ha mostrato un aumento del raggio nei topi trattati con bleomicina rispetto ai controlli salini. Ogni punto rappresenta l'errore medio standard della media di cinque animali per un totale di 30 topi.

La quantificazione della fibrosi polmonare totale di topi trattati con veicolo o bleomicina in diversi punti temporali dimostra che questi parametri micro-CT concordano con i risultati istologici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita di routine per lo screening antidroga. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fibrosi polmonare per esplorare l'efficacia del trattamento ripetuto in modelli animali simili all'IPF.