Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans
17 dicembre 2021
Qui, viene presentato un metodo per l'analisi della cinetica di aggregazione proteica nel nematode Caenorhabditis elegans. Gli animali di una popolazione sincronizzata con l'età vengono ripresi in diversi punti temporali, seguiti dal conteggio dell'inclusione semiautomatica in CellProfiler e dall'adattamento a un modello matematico in AmyloFit.
I meccanismi di aggregazione proteica sono stati finora studiati principalmente in vitro. Con il nostro protocollo possiamo fare studi quantitativi simili nell'organismo modello C.elegans. Il vantaggio principale del nostro metodo è la quantificazione imparziale dei numeri di inclusione.
E adattando questi dati di alta qualità a modelli matematici, possiamo ottenere informazioni sul meccanismo di aggregazione. L'aggregazione proteica si verifica in molte malattie, tra cui l'Alzheimer e l'Huntington. Comprendere il meccanismo molecolare dell'aggregazione proteica in vivo è fondamentale per sviluppare nuove terapie.
Inizia posizionando 10 nematodi adulti su una piastra NGM seminata di 6 cm con un plettro di verme di platino per eseguire una deposizione sincronizzata delle uova. Lasciare gli adulti a deporre le uova per circa due ore a 20 ° C prima di rimuoverle dal piatto. Posizionare le piastre con le uova nell'incubatrice a 20 C.Monitorare lo sviluppo degli animali fino a quando non raggiungono l'età adulta all'incirca il terzo giorno dopo la deposizione delle uova.
Preparare la piastra da 384 pozzetti riempiendo il numero richiesto di pozzetti con 100 L di tampone M9 integrato con 25 mM di azide di sodio come anestetico. Riempi un pozzetto per ceppo da fotografare. Per ogni ceppo, trasferire 20 animali in un pozzo utilizzando un plettro di verme di platino.
Coprire la piastra con il coperchio per evaporazione preventiva e visualizzare la piastra entro un'ora dalla preparazione. Accendere lo strumento e aprire il software. Fare clic sul pulsante Riproduci accanto a Scarica piastre di pozzo e posizionare la piastra a 384 pozzetti nel microscopio.
In Elenco azioni e Acquisizione fluorescenza 3D fare clic su Test e selezionare i worm contenenti il pozzo. Impostare Elaborazione immagini su Nessuno. E fai clic sul pulsante Riproduci per determinare la distanza di spostamento ottimale alla quale i worm sono centrati correttamente.
Impostare Distanza ascendente a 50 m, Distanza discendente a 50 m e Intervallo di taglio a 2 m per catturare l'intero spessore degli animali nella pila z. Impostare Elaborazione immagini su Massimo. Selezionare i pozzetti da visualizzare in Impostazione scansione piastra pozzo.
Quindi seleziona Affianca e acquisisci tutto bene. Salvare l'impostazione di misurazione. E fai clic su Avvia misurazione per avviare l'esperimento.
Aprire CellProfiler e trascinare la pipeline nella finestra Rilascia un file di pipeline qui. Fare clic su Sì per caricare il progetto. Quindi, trascina le immagini cucite nella finestra Rilascia file e cartella qui.
Fare clic sul modulo di input dei metadati. Regolare l'espressione regolare per estrarre dal nome del file in base ai nomi delle immagini cucite. Fare clic sul modulo di input NamesAndTypes e regolare Seleziona i criteri della regola in modo che corrispondano ai canali nei nomi dei file.
Quindi, fare clic su Impostazioni di output per selezionare una cartella in cui salvare l'output da CellProfiler. Fare clic su Avvia modalità test per verificare le impostazioni della pipeline utilizzando il primo set di dati di imaging. Fare clic su Step per eseguire la pipeline, un modulo alla volta.
Per regolare i contorni del worm, fare clic su Mostra guida nel modulo ModificaOggettimanualmente per visualizzare le istruzioni. Correggere i contorni. E quindi fare clic su Fine per continuare a eseguire la pipeline.
Fare clic su Esci dalla modalità test e analizza immagini. Aprire la cartella di output per visualizzare i file di output. E apri le immagini con il nome del file originale seguito da contorni per verificare se i worm e le inclusioni sono stati correttamente sovrapposti.
Per iniziare a utilizzare AmyloFit, assegna un nome al progetto e fai clic su Crea progetto. Fare clic su Apri per aprirlo. E crea una sessione dandogli un nome e facendo clic su Crea e carica sessione.
Clicca su Aggiungi dati e carica il file contenente il numero medio di inclusioni per animale, seguendo i requisiti di formato dei dati mostrati nel pannello di sinistra. Quindi, fai clic su Carica nuovi dati. Impostare Numero di punti su medio per offset di punto zero su 0 e Impostare Numero di punti in media su per plateau su 0 per saltare i passaggi di pre-elaborazione, che non sono necessari per i dati di conteggio dell'inclusione.
Quindi, fai clic su Invia. Ripetere questo passaggio per ogni concentrazione proteica. Selezionate Personalizzato nel pannello Modello.
Immettere l'equazione per la nucleazione indipendente nella casella Equazione. E fai clic su Carica modello. Per Ncells, impostare il tipo di parametro su Costante globale e impostare Valore su 95, corrispondente al numero di cellule muscolari della parete corporea.
Impostate i tipi di parametro su Global fit per Kcell e n. E a Costante per m. Immettete i valori di m per i diversi ceppi nel pannello di sinistra.
Lasciate invariato il numero di luppoli del bacino e fate clic su Adatta (Fit) nel pannello Raccordo (Fitting). Infine, estrai l'adattamento facendo clic su Scarica dati e Adatta. I numeri di inclusione sono stati monitorati in quattro ceppi di C.elegans che esprimono diverse concentrazioni di Q40.
Il modello di nucleazione indipendente descrive bene la cinetica di aggregazione. L'adattamento ha prodotto un ordine di reazione di 2,1 e una velocità di nucleazione di 0,38 molecole al giorno per cellula ad una concentrazione proteica intracellulare di 1 mM. Due repliche biologiche indipendenti in uno studio precedente hanno mostrato valori strettamente corrispondenti per l'ordine di reazione e la velocità di nucleazione.
Una cosa che dovrebbe essere tenuta a mente è che hai bisogno di set di dati di alta qualità per più concentrazioni di proteine per ottenere adattamenti affidabili. Questo metodo può essere utilizzato per trovare modi per interferire con l'aggregazione proteica in un organismo vivente, come abbattimenti genetici o trattamenti a piccole molecole.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per analizzare la cinetica di aggregazione proteica nel nematode Caenorhabditis elegans. Il protocollo consente una quantificazione imparziale dei numeri di inclusione attraverso l'imaging e la modellazione matematica.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Aggregazione proteica
Sfondo
- L'aggregazione proteica è collegata a varie malattie, tra cui Alzheimer e Huntington.
- Studi precedenti si sono concentrati principalmente su metodi in vitro.
- Comprendere i meccanismi in vivo è cruciale per sviluppare terapie.
- Caenorhabditis elegans serve come organismo modello per tali studi.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per studiare l'aggregazione proteica in un organismo vivente.
- Quantificare accuratamente i numeri di inclusione e trarre informazioni sui meccanismi di aggregazione.
- Facilitare l'esplorazione di interventi terapeutici.
Metodi utilizzati
- I C. elegans sincronizzati per età vengono fotografati in vari punti temporali.
- Il conteggio delle inclusioni viene eseguito utilizzando CellProfiler.
- I dati sono adattati a modelli matematici utilizzando AmyloFit.
- Le condizioni sperimentali includono specifiche preparazioni di temperatura e buffer.
Risultati principali
- Il modello di nucleo indipendente descrive efficacemente la cinetica di aggregazione.
- È stato determinato un ordine di reazione di 2,1 e un tasso di nucleo di 0,38 molecole al giorno per cellula.
- I dataset di alta qualità sono essenziali per adattamenti affidabili.
- Il metodo può essere applicato per indagare interventi genetici o farmacologici.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un quadro robusto per studiare l'aggregazione proteica in vivo.
- Le intuizioni acquisite possono informare le strategie terapeutiche per malattie correlate.
- Studi futuri potrebbero esplorare ulteriori concentrazioni proteiche e condizioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying protein aggregation kinetics in vivo addresses a critical gap in neurodegenerative disease research, where in vitro models often fail to capture cellular complexity. This method enables unbiased, time-resolved measurement of inclusion formation in a genetically tractable organism, supporting target validation and mechanistic de-risking. By linking quantitative imaging to mathematical modeling, it provides predictive confidence for evaluating proteostasis modifiers and therapeutic candidates in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying aggregation kinetics in living muscle cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through unbiased inclusion counting across genetic strains.
- Predictive Value: Fitting data to independent nucleation models clarifies mechanism and informs target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved inclusion counts suitable for assay standardization.
- Operational Value: Integrates high-throughput imaging with automated image analysis for reproducible outputs.
- Scalability: Uses 384-well plate format to enable screening of genetic or pharmacological modulators.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human protein aggregation diseases like Huntington’s via polyQ expression in C. elegans.
- Mechanistic De-risking: Derives nucleation rate and reaction order to distinguish between aggregation mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies effects of interventions on aggregation kinetics to inform go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where quantitative aggregation data informs target selection and compound screening.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about nucleation-dependent aggregation using time-lapse inclusion data.
- Screening: Produces assay-ready, quantitative readouts for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Employs mathematical fitting to extract kinetic parameters (Kcell, n) that enable condition comparison.
- Translational Research: Uses disease-relevant polyQ model to bridge in vivo findings to human pathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow for chronic proteinopathy studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking inclusion counts to biophysical models of aggregation.
- Operational Value: Standardizes quantification via automated pipelines, minimizing inter-observer variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic, not just endpoint, aggregation data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanism and modulation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, image analysis (CellProfiler), and kinetic modeling (AmyloFit).
- Dependent on instrumentation capable of 3D fluorescence z-stacking in multi-well formats.
- Necessitates standardization of worm handling, staining, and imaging timing across operators.
- Adaptation to other tissues or models may require adjustments to segmentation and signal thresholds.
- Relies on high-quality, multi-concentration datasets for reliable model fitting, as noted in the transcript.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Growth of an Age-Synchronized Population of C. elegans
1:12
Sample Preparation of C. elegans in a Multiwell Plate
1:43
Image Acquisition on the High-Throughput Confocal Microscope
2:45
Automated Inclusion Counting Using CellProfiler
4:07
Global Fitting of Inclusion Count Data Using AmyloFit
5:39
Results: Fitting the Data to a Mathematical Model in AmyloFit
6:16
Conclusion
