Name: Un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per lanalisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di Drosophila di neurodegenerazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Scopri un dosaggio automatizzato di geotassi negativa per analizzare i deficit di arrampicata in Drosophila legati alla neurodegenerazione. Questo metodo offre misurazioni accurate dell'attività locomotoria con potenziali implicazioni terapeutiche.

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Ringraziamo il Bloomington Stock Center e il centro Vienna RNAi della drosofila per stock di volare. Il brevetto per l'apparato di anello appartiene a Shanghai Advanced Research institute, Accademia cinese delle scienze. Le richieste per il software di RflyDetection dovrebbe essere fatto per Fu-de Huang (Vedi lista dell'autore). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma di ricerca base nazionale della Cina (973 programma 2013CB945602) e National Natural Science Foundation of China (31270825 e 31171043). Ringraziamo i membri del laboratorio Ho per discussioni e commenti.

1. collezione fly <ol><li>mantenere le mosche sul cibo standard vola a 25 ° C, 70% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 h/12 h.</li>
	<li>Raccogliere UAS-Dicer2; DDC-GAL4 virginsunder volare anidride carbonica (CO 2) anestesia.</li>
	<li>Attraversare queste vergini per 2 giorno vecchie mosche maschi adulti che trasportano i seguenti genotipi: UAS-mCD8GFP (controllo), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux sovraespressione), e auxR 16182; auxGFP (salvataggio), con un maschio: rapporto femminile di 1:2.</li>
	<li>Separatamente raccogliere appena obtecta maschi e femmine in 3 fiale per ogni gruppo per esperimento, ponendo 10 mosche in ogni flaconcino di volare regolare con cibo standard a 25 ° C.</li>
	<li>a seconda dell'esperimento, tenere il raccolto Vola fino a 35 giorni e utilizzarli per l'analisi automatizzata di anello al giorno 5, 15, 25 e 35.</li>
</ol> 2. Automatizzati di analisi dell'anello <ol><li>trasferire 10 mosche raccolti (unisex) al genotipo in ogni fiala, quindi fissare il flaconcino con una vite. Analizzare il controllo mosche e mosche che trasportano diversi genotipi insieme per ogni set di esperimenti (fino a 10 fiale contemporaneamente, 10 mosche in ogni flaconcino).</li>
	<li>Attivare la fotocamera digitale posizionata davanti l'apparato, e iniziare a registrare una volta mosche sono tutti caricati e pronti.</li>
	<li>Dopo 1 min per mosche a stabilirsi in fiale, accendere il controllore passo-passo che controlla il driver passo; ciò spinge il motorino elettrico per controllare la leva in modo che consecutivamente sorge e rubinetti per l'apparato 4 volte in 2 s. Vedere la Figura 1.
	<ol><li>Dopo aver toccato, si noti che le mosche cominciano a salire la parete. Assicurarsi che la registrazione continua.</li>
	</ol></li> <li>Ripetere la sincronizzazione come descritto al punto 2.3 in intervallo 60-s per 3 a 5 prove consecutive.</li>
	<li>Ripetere l'esperimento per 5, 15, 25 e 35 giorno vecchie mosche. Almeno 3 esperimenti indipendenti per ogni gruppo, ogni esperimento con almeno 30 raccolti Vola (3 fiale).</li>
</ol> 3. Analisi dei dati <ol><li>importare il video registrato nel computer.</li>
	<li>Scattare un'istantanea del video a 6 s dopo aver toccato, per ogni prova.</li>
	<li>Importare l'immagine snapshot nel software RflyDetection (vedere Figura 2), utilizzando il &#39; File &#39; menu.</li>
	<li>Impostare le linee di base superiore e inferiore del flaconcino proprio da utilizzando l'icona della linea di base della barra degli strumenti e quindi utilizzando il cursore per contrassegnare le linee di base superiore e inferiore dell'immagine.</li>
	<li>Inserire il numero di mosche per flaconcino (ad esempio, 10 qui) il &#39; le mosche in rect &#39; lunghezza campo e flaconcino (ad es., 14cm qui) nella &#39; altezza del tubo di &#39; campo all'interno della barra di impostazioni.
	<ol><li>Nota che le singole posizioni di volare sono rilevate e identificate con puntini sullo schermo per ogni flaconcino. 
		Nota: Nella figura 2 indica le posizioni di tutti i menu pulsante click.</li>
	</ol></li> <li>Nota che il software automaticamente determina la distanza di arrampicata per ogni volo e vengono visualizzati i valori medi da 10 mosche in ogni flaconcino in una tabella sul pannello di destra. (Vedi Figura 2)</li>
	<li>Elaborare il numero arrampicato con software statistici (ad es., Prisma) per ulteriori analisi statistiche.</li>
	<li>Attualmente i dati come media ± SEM.</li>
	<li>Calcolare il p-valori di significatività (contrassegnati con un asterisco, * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0,01, * * * p &#60; 0.001) usando il One-way ANOVA con Bonferroni più confronto test.</li>
</ol>

<ol><li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Madabattula, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+Climbing+Defects+in+a+Drosophila+Model+of+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders.</a> J Vis Exp. (100), e52741(2015).</li>
<li>Podratz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+climbing+apparatus+to+measure+chemotherapy-induced+neurotoxicity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster.</a> Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+rapid+iterative+negative+geotaxis+assay+and+its+use+in+a+genetic+screen+for+modifiers+of+Abeta%2842%29-induced+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila.</a> Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SH2B1+is+Involved+in+the+Accumulation+of+Amyloid-beta42+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease.</a> J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxilin+Underlies+Progressive+Locomotor+Deficits+and+Dopaminergic+Neuron+Loss+in+a+Drosophila+Model+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease.</a> Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+RBO-PI4KIII%CE%B1+Facilitates+A%CE%B242+Secretion+and+Ameliorates+Neural+Deficits+in+A%CE%B242-Expressing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila.</a> J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).</li>
<li>Riemensperger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dopamine+pathway+underlies+progressive+locomotor+deficits+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il test automatizzato anello qui descritto consente un'analisi di alto-rendimento del comportamento di volare geotassi negativa per centinaia di mosche contemporaneamente. In precedenza strategie esistenti per l'analisi di arrampicata adulti comportano l'osservazione di una singola Mosca in un singolo flaconcino, e volare posizione manualmente viene rilevata dall'occhio. Questo processo piuttosto noioso a volte potrebbe causare fraintendimento o errata interpretazione dei dati, come pure laborioso lavoro. Nostra analisi ...

Una varietà di protocolli e metodi sono stati sviluppati per analizzare il comportamento di arrampicata adulto della drosofila . Piuttosto laborioso, l'analisi tradizionale principalmente consiste nel mettere una singola Mosca in una fiala di singola e utilizza una forza manuale per toccare mosche giù per sincronizzazione1,2,3,4. È noioso e richiede tempo, inadatto per i grandi studi di alto-rendimento ed ha potenziale variazioni della forza manuale utilizzato per toccare giù le mosche, così come altre limitazioni. Per migliorare il test, un test rapido iterativo geotassi negativa (anello) è stato sviluppato che permette l'analisi di alto-rendimento sopra numerose mosche al tempo stesso5. Tuttavia, il test richiede comunque una forza manualmente esercitando per sincronizzare volare azione. La nostra versione del test RING, riveduto al momento l'analisi precedente, comprende una base di metallo hosting più flaconcini contenenti volare controllate automaticamente da un motore elettrico a guidare volare sincronizzazione6. Al momento della registrazione, al volo arrampicata immediatamente dopo sincronizzazione è registrato poi analizzato utilizzando un software di auto-progettato. Il nostro saggio anello automatizzato ha eliminato il processo noioso e laborioso nella raccolta di dati da un singolo fly, uno alla volta e attivato il processo di acquisizione di dati essere più efficiente. Inoltre, il test automatizzato di anello è stato impiegato in una serie di studi per delucidare il meccanismo sottostante Alzheimer e morbo di Parkinson, convalida l'approccio con alta efficienza7,8,9 .
In questo articolo, dimostriamo il test automatizzato anello utilizzando la DDC-Gal4 guidato RNAi mosche. DDC-Gal4 è una linea di Gal4 specificamente esprimendo in (DA) neuroni dopaminergici e serotoninergici, rappresentando quindi un ottimo strumento per analizzare gli effetti del gene bersaglio associati a deficit motorio che accompagna la neurodegenerazione10. Inoltre, incorporiamo UAS-Dicer2, una linea di volo che migliora l'efficienza di RNAi, per generare il UAS-Dicer2; DDC-Gal4 strumento linea. Le mosche di RNAi scegliamo di usare è il auxilin (aux), RNAi v16182 (auxR16182), un gene che precedentemente abbiamo identificato per esporre un effetto su attività locomotrice8per volare. auxGFP mosche sono preparati anche per analizzare gli effetti sopra aux sovraespressione. Mostreremo come utilizzare il test automatizzato di anello per misurare volare geotassi negativa, presentare i risultati e discutere eventuali implicazioni acquisite dai risultati.

<table><tbody><tr><td>Forma Environmental Chamber</td><td>Thermo</td><td>3949</td><td></td></tr><tr><td>Cilindri di anidride carbonica</td><td>FuLian GAS Technology</td><td>GB/T6052</td><td></td></tr><tr><td>Videocamera HDR</td><td>SONY</td><td>HDR-CX220E</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio binoculare</td><td>Xin Zhen</td><td>SMZ-168BL</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>MinQiao</td><td>SL1002N</td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero</td><td>Haier</td><td>SC-350</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di agar-agar</td><td>Sinopharm</td><td>10000561</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sinopharm</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>Farina di mais</td><td>Sinopharm</td><td>5464654</td><td></td></tr><tr><td>Zucchero di canna</td><td>LiuCaiYuan</td><td>45467936</td><td></td></tr><tr><td>Lievito secco istantaneo</td><td>AB MAURI</td><td>20886</td><td></td></tr><tr><td>AuxR16182</td><td>VDRC</td><td>7187</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington</td><td>24650</td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCD8GFP</td><td>Bloomington</td><td>32185</td><td></td></tr><tr><td>DDC-Gal4</td><td></td><td></td><td>Un regalo da Fude Huang</td></tr><tr><td>AuxGFP</td><td></td><td></td><td>Un regalo da Henry Chang</td></tr></tbody></table>

un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per l'analisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di drosophila di neurodegenerazione

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Malattie neurodegenerative sono associate frequentemente con una progressiva perdita di capacità di movimento, durata della vita ridotta e neurodegenerazione età-dipendente. Per capire il meccanismo di questi cellulari eventi e loro relazioni causali con a vicenda, Drosophila melanogaster, con i suoi sofisticati strumenti genetici e diverse caratteristiche comportamentali, vengono utilizzati come modelli di malattia per la valutazione neurodegenerative fenotipi. Qui descriviamo un metodo di alto-rendimento per analizzare il comportamento di adulto geotassi negativa di Drosophila , come un'indicazione per eventuali difetti motore associato di neurodegenerazione. Una macchina automatica è stata progettata e sviluppata per la sincronizzazione volare utilizzando un iniziale impulso elettrico, più tardi che permette la registrazione del comportamento negativo geotassi sopra un corso di secondi per minuti in auto. Immagini dal video registrata digitalmente vengono poi elaborati con il software RflyDetection self-progettato per la manipolazione di dati statistici. Diverso del dosaggio controllato manualmente geotassi negativa basata su singolo fly, questo protocollo preciso, veloce e ad alta velocità permette l'acquisizione di dati da più di centinaia di mosche fornendo al contempo, un approccio efficace per far avanzare la nostra comprensione nel meccanismo sottostante dei deficit motorio associato a neurodegenerazione.

In questo articolo viene illustrato l'utilizzo di un test automatizzato di anello nel valutare il comportamento di volare geotassi negativa. A differenza del precedente saggio di anello, la nostra analisi include un apparecchio automatizzato che fornisce una forza elettrica per sincronizzare volare azione e analizza fino a centinaia di mosche contemporaneamente (Figura 1). Analisi di Dicer2 di ; DDC &#62; auxR16182 mosche hanno mostrato u...

Questo protocollo dettagliato analizza il comportamento di geotassi negativa di Drosophila utilizzando un sistema automatico di multi-cilindro che ospita centinaia di mosche e sincronizza la loro azione da un motore elettrico. Al momento della sincronizzazione, volare geotassi negativo comportamento viene analizzato, registrata digitalmente ed analizzati utilizzando il software di RflyDetection auto-progettato.

Un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per l'analisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di Drosophila di neurodegenerazione

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

L'obiettivo generale di questo saggio automatizzato di geotassi negativa rapida e iterativa è analizzare i deficit di arrampicata degli adulti di Drosophila associati alla neurodegenerazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze come il meccanismo dei deficit locomotori associati alla neurodegenerazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'attività di arrampicata delle mosche può essere analizzata in modo automatizzato e altamente professionale.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia e la diagnosi della neurodegenerazione, poiché le malattie neurodegenerative sono frequentemente associate a una perdita progressiva della capacità di movimento e ridotta durata della vita e alla neurodegenerazione dipendente dall'età. Abbiamo avuto per primi l'idea per questo metodo. Volevamo misurare l'attività locomotoria degli adulti di Drosophila in modo più accurato.Per effettuare la raccolta delle mosche, iniziare mantenendo le mosche su cibo standard per mosche a 25 gradi Celsius, 70% di umidità e a ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Raccogliere le vergini UAS-Dicer2 DDC-GAL4 sotto anestesia con anidride carbonica. Incrociare le vergini con mosche maschi adulte di due giorni con i seguenti genotipi, con un rapporto maschio/femmina di uno a due.Raccogliere separatamente i maschi e le femmine appena occlusi in tre provette per ogni gruppo per esperimento, posizionando 10 mosche in ogni provetta standard per mosche con cibo standard. Quindi impostare le provette a 25 gradi Celsius. Per eseguire il saggio automatizzato RING, trasferire 10 mosche unisex per genotipo in ogni provetta.Fissare poi la provetta con una vite. Analizzare le mosche di controllo e le mosche con diversi genotipi insieme per ogni serie di esperimenti. Accendere la fotocamera digitale posizionata di fronte all'apparato e, una volta che le mosche sono caricate e pronte, iniziare la registrazione.La fotocamera dovrebbe essere posizionata orizzontalmente e la fotocamera a una distanza adeguata dall'apparato RING per catturare le posizioni in località relativamente accurate di tutte le mosche. Dopo aver lasciato un minuto affinché le mosche si stabilizzino nelle provette, accendere il controllore di passo che controlla il driver di passo. Questo aziona il piccolo motore elettrico per controllare la leva attaccata, in modo che salga consecutivamente e colga l'apparato quattro volte in due secondi.Dopo aver colpito l'apparato, notare che le mosche iniziano ad ascendere lungo la parete. Con la registrazione ancora attiva, ripetere la sincronizzazione come appena dimostrato, a intervalli di 60 secondi per tre o cinque prove consecutive. Ripetere l'esperimento per mosche di 5, 15, 25 e 35 giorni.Condurre almeno tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo per ogni esperimento, con almeno 30 mosche raccolte o tre provette. Per analizzare i dati, importare il video registrato nel computer. Per ogni prova, fare uno scatto del video a sei secondi dopo il colpo.Nel software di rilevamento R-fly, utilizzare il menu file per importare l'immagine dell'istantanea. Poi, utilizzando l'icona di base sulla barra degli strumenti, impostare con precisione le linee di base superiore e inferiore della provetta e poi utilizzare il cursore per marcare le linee di base superiore e inferiore sull'immagine. All'interno della barra delle Impostazioni, nel campo Mosche nel rettangolo, inserire il numero di mosche per provetta e, nel campo Altezza del Tubo, inserire la lunghezza della provetta.Le posizioni individuali delle mosche vengono rilevate e etichettate con punti sullo schermo per ogni provetta. Notare che in una tabella sul pannello di destra, il software determina automaticamente la distanza di arrampicata per ogni mosca e visualizza i valori medi di 10 mosche in ogni provetta. Presentare i dati come media più o meno SEM.Calcolare i valori P di significatività utilizzando un'ANOVA a una via con un test di confronto multiplo di Bonferroni. L'analisi delle mosche designate Dicer2 utilizzando il saggio RING automatizzato presentato in questo video ha mostrato un decremento dipendente dall'età nella distanza di arrampicata in un arco di tempo di sei secondi sia per le mosche maschi che per quelle femmina, suggerendo che l'espressione aux nei neuroni dopaminergici o DA è cruciale per l'attività locomotoria della mosca. L'abilità di arrampicata non sembra essere influenzata dalla sovraespressione di auxGFP nei neuroni DA e dalla co-espressione di auxR e auxGFP nei neuroni DA recuperati dal fenotipo RNAi.Una volta padroneggiato, questo può essere fatto in due o tre ore se eseguito correttamente. Avere questo sviluppo è ora un modo per i ricercatori nel campo delle neuroscienze di esplorare la neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Non dimenticare che lavorare con l'apparato RING elettrico può essere estremamente pericoloso e ogni conferma deve essere fissata saldamente e controllata attentamente prima di eseguire questa procedura.

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