Un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per l'analisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di Drosophila di neurodegenerazione

L'obiettivo generale di questo test automatizzato di geotassi negativa iterativa rapida è analizzare i deficit di arrampicata adulta di Drosophila associati alla neurodegenerazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come il meccanismo dei deficit locomotori associati alla neurodegenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'attività di arrampicata al volo può essere analizzata in una professione automatizzata e ad alta prova.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia e la diagnosi della neurodegenerazione, perché le malattie neurodegenerative sono frequentemente associate a una progressiva perdita della capacità di movimento e a una ridotta durata della vita e alla neurodegenerazione dipendente dall'età. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta. Volevamo misurare l'attività locomotiva di Drosophila adulta in modo più accurato.

Per effettuare la raccolta delle mosche, iniziare mantenendo le mosche con il cibo standard per mosche a 25 gradi Celsius, 70% di umidità e ciclo di 12 ore di luce, 12 ore di buio. Raccogli le vergini mosca UAS-Dicer2 DDC-GAL4 in anestesia con anidride carbonica. Incrocia le vergini con mosche maschi adulti di due giorni che portano i seguenti genotipi, con un rapporto maschio/femmina di uno a due.

Raccogli separatamente i maschi e le femmine appena chiusi in tre fiale per ogni gruppo per esperimento, posizionando 10 mosche in ogni fiala di mosca normale con cibo standard. Quindi impostare le fiale a 25 gradi Celsius. Per eseguire il test RING automatizzato, trasferire in ciascuna fiala 10 mosche unisex raccolte per genotipo.

Quindi fissare la fiala con una vite. Analizza le mosche di controllo e le mosche che trasportano diversi genotipi insieme per ogni serie di esperimenti. Accendi la fotocamera digitale posta davanti all'apparecchio e, una volta che le mosche sono cariche e pronte, inizia a registrare.

La telecamera deve essere posizionata orizzontalmente e la telecamera a una distanza adeguata dall'apparato RING per catturare le posizioni in posizioni relativamente accurate di tutte le mosche. Dopo aver lasciato un minuto affinché le mosche si depositino nelle fiale, accendi il controller passo-passo che controlla il guidapasso-passo. Questo aziona il piccolo motore elettrico per controllare la leva collegata, in modo che si alzi e tocchi consecutivamente l'apparecchio quattro volte in due secondi.

Dopo aver toccato l'apparato, notare che le mosche iniziano a risalire il muro. Con la registrazione ancora attiva, ripetere la sincronizzazione come appena dimostrato, a intervalli di 60 secondi per tre o cinque prove consecutive. Ripeti l'esperimento per mosche di cinque, 15, 25 e 35 giorni.

Condurre almeno tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo per ogni esperimento, con almeno 30 mosche raccolte o tre fiale. Per analizzare i dati, importare il video registrato nel computer. Per ogni prova, scatta un'istantanea del video sei secondi dopo aver toccato.

Nel software di rilevamento R-fly, utilizzare il menu file per importare l'immagine dell'istantanea. Quindi, utilizzando l'icona della linea di base sulla barra degli strumenti, impostare con precisione le linee di base superiore e inferiore della fiala, quindi utilizzare il cursore per contrassegnare le linee di base superiore e inferiore sull'immagine. All'interno della barra delle impostazioni, nel campo Mosche nel retto, inserisci il numero di mosche per fiala e nel campo Altezza tubo, inserisci la lunghezza della fiala.

Le singole posizioni di volo vengono rilevate ed etichettate con punti sullo schermo per ogni fiala. Si noti che in una tabella sul pannello di destra, il software determina automaticamente la distanza di arrampicata per ogni mosca e visualizza i valori medi di 10 mosche in ogni fiala. Presenta i dati come media più o meno SEM.

Calcolare i valori P di significatività utilizzando un'ANOVA unidirezionale con un test di confronto multiplo di Bonferroni. L'analisi dei moscerini designati da Dicer2 utilizzando il saggio RING automatizzato presentato in questo video ha mostrato una diminuzione dipendente dall'età della distanza di arrampicata in un lasso di tempo di sei secondi sia per i moscerini maschi che per le femmine, suggerendo che l'espressione di aux nei neuroni dopaminergici o DA è cruciale per l'attività locomotoria del moscerino. La capacità di arrampicata non sembra essere influenzata dalla sovraespressione di auxGFP nei neuroni DA e dalla co-espressione di auxR e auxGFP nei neuroni DA salvati dal fenotipo RNAi.

Una volta padroneggiato, questo può essere fatto in due o tre ore se viene eseguito correttamente. Avere questo sviluppo è ora un modo per i ricercatori nel campo delle neuroscienze di esplorare la neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Non dimenticare che lavorare con apparecchi elettrici RING può essere estremamente pericoloso e ogni conferma deve essere fissata saldamente e controllata attentamente prima di eseguire questa procedura.