Un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per l'analisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di Drosophila di neurodegenerazione
12 settembre 2017
Questo protocollo dettagliato analizza il comportamento di geotassi negativa di Drosophila utilizzando un sistema automatico di multi-cilindro che ospita centinaia di mosche e sincronizza la loro azione da un motore elettrico. Al momento della sincronizzazione, volare geotassi negativo comportamento viene analizzato, registrata digitalmente ed analizzati utilizzando il software di RflyDetection auto-progettato.
L'obiettivo generale di questo saggio automatizzato di geotassi negativa rapida e iterativa è analizzare i deficit di arrampicata degli adulti di Drosophila associati alla neurodegenerazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze come il meccanismo dei deficit locomotori associati alla neurodegenerazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'attività di arrampicata delle mosche può essere analizzata in modo automatizzato e altamente professionale.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia e la diagnosi della neurodegenerazione, poiché le malattie neurodegenerative sono frequentemente associate a una perdita progressiva della capacità di movimento e ridotta durata della vita e alla neurodegenerazione dipendente dall'età. Abbiamo avuto per primi l'idea per questo metodo. Volevamo misurare l'attività locomotoria degli adulti di Drosophila in modo più accurato.
Per effettuare la raccolta delle mosche, iniziare mantenendo le mosche su cibo standard per mosche a 25 gradi Celsius, 70% di umidità e a ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Raccogliere le vergini UAS-Dicer2 DDC-GAL4 sotto anestesia con anidride carbonica. Incrociare le vergini con mosche maschi adulte di due giorni con i seguenti genotipi, con un rapporto maschio/femmina di uno a due.
Raccogliere separatamente i maschi e le femmine appena occlusi in tre provette per ogni gruppo per esperimento, posizionando 10 mosche in ogni provetta standard per mosche con cibo standard. Quindi impostare le provette a 25 gradi Celsius. Per eseguire il saggio automatizzato RING, trasferire 10 mosche unisex per genotipo in ogni provetta.
Fissare poi la provetta con una vite. Analizzare le mosche di controllo e le mosche con diversi genotipi insieme per ogni serie di esperimenti. Accendere la fotocamera digitale posizionata di fronte all'apparato e, una volta che le mosche sono caricate e pronte, iniziare la registrazione.
La fotocamera dovrebbe essere posizionata orizzontalmente e la fotocamera a una distanza adeguata dall'apparato RING per catturare le posizioni in località relativamente accurate di tutte le mosche. Dopo aver lasciato un minuto affinché le mosche si stabilizzino nelle provette, accendere il controllore di passo che controlla il driver di passo. Questo aziona il piccolo motore elettrico per controllare la leva attaccata, in modo che salga consecutivamente e colga l'apparato quattro volte in due secondi.
Dopo aver colpito l'apparato, notare che le mosche iniziano ad ascendere lungo la parete. Con la registrazione ancora attiva, ripetere la sincronizzazione come appena dimostrato, a intervalli di 60 secondi per tre o cinque prove consecutive. Ripetere l'esperimento per mosche di 5, 15, 25 e 35 giorni.
Condurre almeno tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo per ogni esperimento, con almeno 30 mosche raccolte o tre provette. Per analizzare i dati, importare il video registrato nel computer. Per ogni prova, fare uno scatto del video a sei secondi dopo il colpo.
Nel software di rilevamento R-fly, utilizzare il menu file per importare l'immagine dell'istantanea. Poi, utilizzando l'icona di base sulla barra degli strumenti, impostare con precisione le linee di base superiore e inferiore della provetta e poi utilizzare il cursore per marcare le linee di base superiore e inferiore sull'immagine. All'interno della barra delle Impostazioni, nel campo Mosche nel rettangolo, inserire il numero di mosche per provetta e, nel campo Altezza del Tubo, inserire la lunghezza della provetta.
Le posizioni individuali delle mosche vengono rilevate e etichettate con punti sullo schermo per ogni provetta. Notare che in una tabella sul pannello di destra, il software determina automaticamente la distanza di arrampicata per ogni mosca e visualizza i valori medi di 10 mosche in ogni provetta. Presentare i dati come media più o meno SEM.
Calcolare i valori P di significatività utilizzando un'ANOVA a una via con un test di confronto multiplo di Bonferroni. L'analisi delle mosche designate Dicer2 utilizzando il saggio RING automatizzato presentato in questo video ha mostrato un decremento dipendente dall'età nella distanza di arrampicata in un arco di tempo di sei secondi sia per le mosche maschi che per quelle femmina, suggerendo che l'espressione aux nei neuroni dopaminergici o DA è cruciale per l'attività locomotoria della mosca. L'abilità di arrampicata non sembra essere influenzata dalla sovraespressione di auxGFP nei neuroni DA e dalla co-espressione di auxR e auxGFP nei neuroni DA recuperati dal fenotipo RNAi.
Una volta padroneggiato, questo può essere fatto in due o tre ore se eseguito correttamente. Avere questo sviluppo è ora un modo per i ricercatori nel campo delle neuroscienze di esplorare la neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Non dimenticare che lavorare con l'apparato RING elettrico può essere estremamente pericoloso e ogni conferma deve essere fissata saldamente e controllata attentamente prima di eseguire questa procedura.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo automatizzato per l'analisi del comportamento di geotassi negativa di Drosophila, concentrandosi sui difetti di arrampicata negli adulti legati alla neurodegenerazione. La tecnica utilizza un sistema a cilindri multipli per sincronizzare e registrare i movimenti delle mosche, fornendo informazioni sui deficit locomotori.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Analisi del Comportamento
- Neurodegenerazione
Sfondo
- Drosophila funge da organismo modello per lo studio delle malattie neurodegenerative.
- Il comportamento di geotassi negativa è un indicatore dell'abilità locomotoria nei moscerini.
- La neurodegenerazione porta spesso a una perdita progressiva della mobilità e della durata della vita.
- I sistemi automatizzati aumentano l'accuratezza dei saggi comportamentali.
Scopo dello studio
- Analizzare i deficit di arrampicata in Drosophila associati alla neurodegenerazione.
- Esplorare i meccanismi alla base dei deficit locomotori.
- Migliorare l'accuratezza della misurazione dell'attività locomotoria delle mosche.
Metodi Utilizzati
- Sistema automatizzato con più cilindri per il movimento sincronizzato delle mosche.
- Registrazione digitale del comportamento di geotassi negativa.
- Analisi mediante software autoprogettato RflyDetection.
- Saggio rapido iterativo per la raccolta dati ad alto rendimento.
Risultati principali
- Sincronizzazione riuscita dei movimenti delle mosche per un'analisi accurata.
- Individuazione di deficit nell'arrampicata associati alla neurodegenerazione.
- L'analisi automatizzata si è dimostrata efficiente e affidabile.
- Possibili implicazioni per la terapia e la diagnosi delle malattie neurodegenerative.
Conclusioni
- Il saggio automatizzato fornisce un metodo robusto per lo studio del comportamento locomotorio in Drosophila.
- Le informazioni ottenute potrebbero orientare approcci terapeutici per la neurodegenerazione.
- Questa tecnica migliora la comprensione della relazione tra movimento e condizioni neurodegenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio automatizzato ad alto rendimento consente una rapida quantificazione dei deficit locomotori nei modelli di Drosophila di neurodegenerazione, supportando la validazione precoce dei bersagli fornendo letture comportamentali oggettive e riproducibili. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nella selezione preclinica permettendo l'analisi simultanea di centinaia di moscerini appartenenti a diversi genotipi e gruppi d'età, facilitando la valutazione efficiente di composti o modificatori genetici. La sua integrazione nei flussi di scoperta contribuisce a ridurre i rischi meccanicistici dei bersagli neurodegenerativi attraverso un fenotipaggio standardizzato e scalabile.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando deficit nell'arrampicata dipendenti dall'età, associati alla neurodegenerazione in modelli genetici.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli attraverso la misurazione ad alto rendimento dell'attività locomotoria come indicatore dell'integrità neuronale.
- Valore predittivo: Genera dati comportamentali quantitativi che supportano la selezione di portafogli identificando genotipi con deficit motorio significativo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce metriche standardizzate e riproducibili di geotassi negativa, adatte alla validazione di saggi in campagne di screening mirate alla neurodegenerazione.
- Valore operativo: Consente lo screening rapido di modificatori genetici o farmacologici mediante acquisizione video automatizzata e analisi con il software RflyDetection.
- Scalabilità: Elabora dati provenienti da centinaia di moscerini per ogni esecuzione, aumentando la produttività e riducendo la variabilità rispetto ai saggi manuali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza traslazionale: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per valutare fenotipi locomotori che rispecchiano i deficit motori clinici nei disturbi neurodegenerativi.
- Continuità preclinica: Permette la valutazione longitudinale in diverse età della Drosophila (5, 15, 25, 35 giorni) per modellare la neurodegenerazione progressiva.
- De-risking meccanicistico: Consente la valutazione di esperimenti di recupero genetico (ad esempio, co-espressione di auxR/auxGFP) per validare la specificità del bersaglio e il coinvolgimento delle vie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione della proteina bersaglio all'identificazione del composto attivo, offrendo un endpoint comportamentale quantitativo che collega la manipolazione genetica e l'esito fenotipico nei modelli di neurodegenerazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando l'espressione genica (ad esempio, aux in neuroni dopaminergici) alla funzione locomotoria mediante misurazioni iterative della geotassi negativa.
- Screening: Fornisce risultati standardizzati pronti per l'analisi (distanza percorsa nell'arrampicata in 6 secondi) che consentono confronti affidabili tra diverse condizioni sperimentali.
- Analisi: Produce dati espressi come media ± SEM con rigore statistico (ANOVA a un fattore, correzione di Bonferroni) per supportare confronti tra gruppi e test di significatività.
- Ricerca traslazionale: Collega i parametri comportamentali ai meccanismi neurodegenerativi, favorendo valutazioni fenotipiche allineate a biomarcatori in modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening comportamentale longitudinale su diversi genotipi, età e gruppi trattati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante fenotipizzazione comportamentale quantificabile e ad alta risoluzione.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione grazie alla sincronizzazione automatica, alla registrazione digitale e all'analisi basata su software.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo consentendo una rapida valutazione dei deficit locomotori su ampie dimensioni campionarie.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione degli obiettivi aggiustata per il rischio, basata su dati fenotipici robusti e sulla progressione dipendente dall'età.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella gestione di Drosophila, nel mantenimento di incroci genetici e nell’allestimento di saggi comportamentali.
- Richiede strumentazione specializzata, tra cui l’apparato RING automatizzato, il controllore di passo, una telecamera digitale e un sistema di illuminazione compatibile.
- Necessita di un’infrastruttura informatica per l’importazione dei video, l’estrazione di istantanee e l’esecuzione del software RflyDetection.
- Comprende la standardizzazione delle condizioni ambientali (25°C, umidità al 70%, ciclo luce/buio di 12 ore) e delle procedure di preparazione delle provette.
- Include considerazioni di sicurezza relative ai componenti elettrici; l’apparato deve essere fissato e verificato prima dell’uso.
