Analisi quantitativa della migrazione casuale di celle usando Time-lapse Microscopia Video

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare quantitativamente la migrazione delle cellule in tempo reale utilizzando la microscopia video time lapse. Ciò si ottiene rivestendo prima una piastra di coltura a sei pozzetti con collagene e poi seminando sparsamente le cellule di interesse sulla piastra rivestita. In una seconda fase, viene creata una ferita nella piastra utilizzando un puntale per pipetta, garantendo ampio spazio per la migrazione.

Successivamente, il microscopio viene configurato e le immagini vengono acquisite a intervalli regolari utilizzando un sistema di controllo della temperatura per consentire il monitoraggio continuo delle cellule in migrazione in tempo reale. In definitiva, il protocollo di tracciamento delle particelle viene utilizzato per valutare le differenze nella velocità media e nello spostamento totale delle celle di test e di controllo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di migrazione in camera evitante, è che non si basa su misurazioni quantitative della migrazione in.

Invece, consente di monitorare e calcolare continuamente diversi parametri. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del cancro, ad esempio in che modo particolari geni o farmaci influenzano la migrazione delle cellule tumorali? Due giorni prima della procedura, aggiungere 1,5 millilitri di collagene diluito in opti media a ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti, quindi incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius un giorno prima della procedura.

Risospendere le cellule di interesse in due millilitri di DMEM più FBS per pozzetto e trasferire le cellule in ciascun pozzetto della piastra rivestita di collagene ENC, incubando le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno della procedura. Utilizzare la punta di una pipetta per creare una ferita nelle cellule coltivate durante la notte e lavare ogni pozzetto con PBS per rimuovere eventuali detriti che si sono formati a seguito della ferita.

Aggiungere DMEM plus FBS ai pozzetti risciacquati e quindi controllare al microscopio per confermare che sia stato creato uno spazio pulito per la ferita. Dopo aver acceso la fotocamera del microscopio e l'apparecchio per l'imaging di cellule vive, posizionare la piastra sul tavolino del microscopio. Copri la piastra con la nuova camera di controllo ambientale a celle vive e imposta il termostato a 37 gradi Celsius e l'anidride carbonica al 5%Ora apri il software del libro di diapositive nella barra dei menu.

Selezionare il controllo della messa a fuoco facendo clic sul pulsante F all'interno di un cerchio. Nella casella dell'obiettivo, utilizzare la finestra a discesa per definire l'obiettivo Nella casella del set di filtri, selezionare le impostazioni per dirigere il percorso della luce verso il pezzo I. Selezionare il filtro appropriato per l'illuminazione in campo chiaro, quindi fare clic su Apri luminoso.

Per aprire l'otturatore a campo chiaro. Ora selezionate il filtro per il campo chiaro sulla torretta e osservate il campione attraverso l'oculare per trovare i campi appropriati e mettere a fuoco il campione. Quindi spostare la torretta del filtro per modificare il percorso della luce verso la fotocamera Per l'acquisizione di immagini nel software del libro di diapositive, fare clic sul controllo della messa a fuoco, selezionare XY per selezionare diverse posizioni attraverso il pezzo I, quindi fare clic sul punto di impostazione per bloccare in ciascuna posizione.

Per l'acquisizione delle immagini, regolate manualmente la messa a fuoco dell'immagine della videocamera visualizzata sullo schermo, quindi utilizzate gli strumenti nella finestra dei controlli di messa a fuoco per regolare la posizione Z dello stage. Per ottenere i migliori risultati, concentrarsi sulle sporgenze cellulari piatte vicino al contatto con la piastra per facilitare la messa a fuoco. Utilizzare il cursore per regolare i tempi di esposizione in modo che si trovino in un intervallo appropriato per la messa a fuoco.

Se sono state selezionate più posizioni XY, regolare la messa a fuoco per ogni singola posizione selezionando il controllo della messa a fuoco. Poi xy, poi punto di visita. Nella diapositiva selezionare l'immagine della fotocamera dalla barra dei menu, selezionare il tipo di acquisizione, quindi time-lapse per selezionare la durata dell'esperimento.

Dal menu a discesa, digitare il ritardo desiderato tra l'inizio di un punto temporale e l'inizio del successivo. Nei campi dell'intervallo, il terzo campo viene calcolato automaticamente in base ai valori inseriti manualmente. In Acquisizione XY multipla, seleziona l'elenco multipunto per gli esperimenti con più di una posizione XY.

Infine, assegna un nome al file per salvare il file, vai al controllo di acquisizione e seleziona Avanzate, quindi spool. Quindi cattura in memoria e salva nel file di spool dopo ogni punto temporale. Inizia cliccando sull'immagine.

Nella barra dei menu del libro di diapositive, seleziona importa dal menu a discesa, quindi fai clic su bobina del libro di diapositive. Seleziona i file della diapositiva desiderati generati dall'esperimento di migrazione per vari campi e punti temporali. Apri il primo file, quindi seleziona maschera sulla barra dei menu e scegli il protocollo di tracciamento delle particelle dal menu a discesa.

Nel menu di tracciamento delle particelle, scegli il protocollo di tracciamento manuale delle particelle. Apparirà una finestra con i punti temporali di inizio e fine Per analizzare la migrazione casuale, selezionare maschera, quindi protocollo di tracciamento delle particelle. Anche in questo caso, per determinare le coordinate per il centro dell'oggetto, selezionare il centro dell'area.

Quindi fare clic su traccia e continua. Ora scegli le statistiche desiderate per ogni percorso, come lo spostamento e la velocità media. Come mostrato di seguito, fare clic su Calcola per visualizzare le statistiche.

In questo riquadro viene mostrato un esempio di analisi di migrazione casuale quantificata in termini di velocità. Nel grafico di Whiskers, in questo esperimento, c'è stato un aumento della velocità media in M-D-A-M-B 2 31 cellule con un gene oncosoppressore abbattuto. Rispetto alle celle di controllo M-D-A-M-B 2 31 qui, la migrazione casuale delle cellule dalla prima figura è stata analizzata in termini di spostamento cellulare.

Ancora una volta, il gruppo knockdown del gene oncosoppressore totale aveva un aumento dello spostamento cellulare rispetto al controllo M-D-A-M-B 2 31. Le cellule in questo film di controllo al microscopio video time lapse MDA MB 2 31 cellule sono state posizionate sul collagene durante la notte. Le immagini sono state poi scattate a intervalli di un'ora per un totale di 18 ore durante la migrazione casuale.

Si noti come le celle si allontanano dalle loro posizioni originali nel tempo. In questo filmato, è stata registrata e analizzata la migrazione delle cellule del test M-D-A-M-B 2 31 dopo la semina notturna sul collagene. Si noti che le cellule di test sono più migratorie rispetto alle celle di controllo del filmato precedente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'invasione cellulare e le dinasi per rispondere a ulteriori domande come: quali sono i ruoli delle cellule nelle metastasi del cancro dopo il suo sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la migrazione cellulare utilizzando linee cellulari tumorali isolate.