Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

Basato sulla tecnologia microfluidica, l'isolamento e la caratterizzazione dei CTC dalle normali cellule del sangue non richiedono l'uso di biomarcatori CTC specifici ed è compatibile con la coltura cellulare. Questo protocollo facilita un alto tasso di estrazione del CTC e fornisce un'ampia analisi citologica dei CTC, valutando le caratteristiche citomorfologiche maligne. L'espressione PD-L1 da parte dei CTC ha un valore predittivo nella gestione del cancro ai polmoni.

Il miglioramento del suo rilevamento utilizzando questo test potrebbe promuovere una migliore gestione del paziente a lungo termine. Un'altra applicazione di questo protocollo include il rilevamento di aberrazioni genetiche mediante FISH o l'esecuzione di analisi trascrittomiche sui CTC, nonché l'isolamento delle cellule di origine fetale nelle madri. A dimostrare la procedura sarà Julie Balandier, un tecnico del nostro laboratorio.

Per l'arricchimento pre-analitico delle cellule tumorali circolanti, raccogliere prima 7,5 millilitri di sangue in un tubo EDTA di potassio e mantenere il campione sotto delicata agitazione per evitare la sedimentazione cellulare e la coagulazione. Entro sei ore dalla raccolta, utilizzare una pipetta sierologica sotto un armadio di sicurezza microbiologico, per trasferire fino a 7,5 millilitri di sangue intero in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare il campione per 10 minuti a 1600 volte G, a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere la frazione plasmatica senza disturbare il mantello buffy e diluire il plasma con un volume equivalente di PBS, fino a 7,5 millilitri.

Quindi, aggiungere con cura il tampone dilisi dei globuli rossi al campione di sangue, a un volume finale di 30 millilitri, e invertire delicatamente il tubo di raccolta del sangue tre volte, prima di posizionare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimuovere con cura tutti tranne gli ultimi quattro o cinque millilitri di supernatante. Utilizzare una micropipetta filtrata per rimuovere il supernatante rimanente e utilizzare una micropipetta P1000 con una punta filtrata per aggiungere un millilitro di tampone di resuspensione lungo la parete del tubo.

Per evitare di introdurre bolle, rimorsi il pellet di cella con pipettazione delicata, fino a quando il campione non è omogeneo. Quando il pellet è stato rimorsinato, aggiungere altri tre millilitri di tampone di sospensione alla parete del tubo, senza introdurre bolle, e mescolare delicatamente nuovamente le cellule. Per il dispositivo microfluidico a spirale che circola l'arricchimento delle cellule tumorali, caricare prima un nuovo chip microfluidico a spirale sul dispositivo e caricare un tubo di centrifuga vuoto da 50 millilitri in ciascuna delle porte di ingresso e uscita.

Fare clic su prime per innescare il dispositivo microfluidico a spirale per tre minuti. Rimozione dei tubi di ingresso e uscita alla fine del ciclo. Caricare il campione di sangue rimorsio nella porta di ingresso e caricare un tubo conico trasparente da 15 millilitri nella porta di uscita.

Quindi fare clic su Esegui e selezionare il programma tre per avviare il programma di arricchimento delle cellule tumorali circolante di 31 minuti. Alla fine del ciclo trasferire il tubo di uscita alla centrifuga e utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per rimuovere tutti tranne gli ultimi due millilitri del supernatante. Quindi utilizzare una micropipetta per rimuovere tutti gli ultimi 100 microlitri di supernatante.

Per la colorazione dell'immunofluorescenza, contare le cellule in un emocitometro e diluire il campione arricchito a una volta per dieci-quinta cellule per 100 microlitri con concentrazione di soluzione anti-legame dello 0,2%. Successivamente, utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di 50 microlitri di soluzione anti-legatura per inumidire il contorno della camera del campione e posizionare uno scivolo di vetro polilisina nella camera campione. Chiudere la camera e pipettare su e giù tre volte per rivestire una punta di micropipetta con la soluzione di legame prima di rimescolare il campione negli ultimi 100 microlitri del supernatante.

Trasferire la soluzione cellulare nella camera campione e citospinare il campione in una centrifuga dedicata a 400 rotazioni al minuto per quattro minuti, a bassa accelerazione. Al termine della centrifugazione, posizionare un isolatore di silicone intorno all'area di deposizione e lasciare asciugare lo scivolo sotto un armadio di sicurezza microbiologico per due minuti, quindi fissare il campione di citospunto con 100 microlitri di paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi di due minuti con 200 microlitri di PBS per lavaggio, a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, bloccare qualsiasi legame non specifico con incubazione di 30 minuti nel blocco del reagente a temperatura ambiente, seguito dall'etichettatura con 100 microlitri della soluzione anticorpale di interesse.

Posizionare lo scivolo etichettato in una piastra di Petri da 100 per 15 millilitri su un pezzo di carta assorbente inumidito con due millilitri di acqua sterile e posizionare la piastra chiusa, a quattro gradi Celsius durante la notte, protetta dalla luce. La mattina seguente, lavare il campione tre volte con PBS come dimostrato e montare il campione con 10 microlitri di una soluzione di montaggio appropriata e uno scivolo di copertura in vetro. Quindi sigillare lo scivolo del coperchio con smalto chiaro.

Per immagini i campioni di citospunti, caricare lo scivolo su un microscopio fluorescente dritto con una piattaforma motorizzata X Y e selezionare un obiettivo 20x e i canali appropriati in base ai fluorofori utilizzati per l'etichettatura degli anticorpi. Accendere la lampada al mercurio e adattare il microscopio e il software associato a un servizio di ripresa semiautomatico. Quando la lampada è pronta, nel menu di acquisizione definire i quattro canali, impostare il tempo di esposizione e definire le tessere da scansionare.

Fare clic sui riquadri e sull'esperimento avanzato e definire l'area da analizzare. Quindi regolare lo stato attivo sullo schermo e fare clic su Avvia esperimento. Alla fine dell'esperimento, esportare i file TIF per ogni canale e denominare in modo specifico il file per includere il campione, il numero di volte, il colorante e il numero di sotto-riquadri.

Per l'analisi delle immagini, aprire il software di analisi delle immagini dal sito Web del Broad Institute e fare clic su file, pipeline da file e analisi di quattro canali CTC. Rilasciare i file nell'elenco dei file e aggiornare i metadati per raggruppare i file in base ai riquadri. Quindi fare clic su Analizza immagini per aprire il file del foglio di calcolo corrispondente ai parametri di intensità della misura.

Senza il protocollo di decontaminazione ottimizzato, si osserva un'elevata contaminazione batterica nelle colture tissutali di linee cellulari A549 arricchite dopo solo 24 ore, causando morte e cambiamenti citomorfologici nelle cellule eucariotiche. Al contrario, dopo il protocollo di pulizia, le cellule A549 viventi vengono ottenute in colture 2D dopo 10 ore di coltura tissutale e rimozione media, in condizioni di coltura 3D e all'interno di campioni di pazienti. Utilizzando un saggio di colorazione immunofluorescente liquida o un saggio di colorazione immunofluorescente su vetri rivestiti di polilisina con citospino, si può osservare una chiara distinzione nel numero di nuclei enumerati tra i due saggi.

Senza il passo del citospino, è difficile differenziare i globuli bianchi dalle cellule tumorali, a causa dei contorni sfocati nei prep delle cellule non citospin. Qui si possono osservare diversi risultati rappresentativi di diversi campioni di pazienti, con il conteggio residuo dei globuli bianchi in particolare determinato come fortemente variabile e dipendente dall'intero campione di sangue. Un'elevata variabilità è stata osservata anche nelle sotto-popolazioni di cellule tumorali circolanti ottenute.

Ogni cella sul citospino è identificata dal software di analisi delle immagini e consente il tracciamento della cella e manualmente di confermare i risultati se necessario. In effetti, un'analisi pilota ha dimostrato una concordanza tra l'enumerazione manuale e l'enumerazione del software di analisi delle immagini. La configurazione della piastra di petri umida progettata internamente per l'ibridazione proteina-anticorpo è fondamentale, poiché il dispositivo rimane sufficientemente umido per tutto il tempo di incubazione.