Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di controllare otticamente la funzione di una proteina neuronale utilizzando un amminoacido geneticamente codificato e innaturale nei neuroni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul contributo di una specifica proteina neuronale alla segnalazione neuronale nella funzione cerebrale con risoluzione temporale spaziale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha il potenziale per essere applicata a varie proteine neuronali per ottenere la regolazione ottica di vari processi neuronali.

Iniziare questa procedura placcando i neuroni dell'ippocampo su vetrini coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di terreno di crescita, dopo aver filtrato attraverso una rete di nylon di 40 micrometri. Successivamente, incubare la coltura neuronale a 35 gradi Celsius in un incubatore umidificato ad aria al 5% di anidride carbonica e al 95% per 2 o 3 settimane. Il giorno della trasfezione, preparare una soluzione fresca di cloruro di calcio 2,5 molari in acqua distillata doppia e filtrarla sterile con un filtro da 0,22 micrometri.

Quindi, prepara 2X BBS fresco a pH 7 e filtralo sterile con un filtro da 0,22 micrometri. Successivamente, sostituire il terreno di coltura con 500 microlitri di terreno di trasfezione fresco e preriscaldato e non gettare via il vecchio terreno di coltura. Preparare la soluzione di trasfezione immediatamente prima di aggiungerla alla coltura combinando cloruro di calcio e acqua bidistillata, agitando lentamente la provetta.

Continua ad agitare la provetta e aggiungi lentamente il DNA nella soluzione. Quindi, aggiungi il buffer BBS 2X in senso gocce. La preparazione del tampone BBS 2X è una fase fondamentale nella trasfezione del fosfato di calcio ed è una buona idea calibrare il pH ottimale per il tampone BBS 2X tra 6,90 e 7,15 per nuovi costrutti o preparazioni di DNA.

Quindi, aggiungere immediatamente 30 microlitri della soluzione di trasfezione a ciascun vetrino coprioggetti della coltura neuronale. Scuoti il piatto di coltura alcune volte per mescolare la soluzione e incubalo a 35 gradi Celsius per 45 minuti a un'ora. Dopo circa un'ora, si dovrebbe osservare uno strato di precipitati di fosfato di calcio fine che copre i neuroni.

Successivamente, sostituire il mezzo di trasfezione con 500 microlitri di tampone di lavaggio preriscaldato e incubarlo a 35 gradi Celsius per 15-20 minuti. I precipitati di fosfato di calcio dovrebbero scomparire dopo il lavaggio. A questo punto, sostituire il tampone di lavaggio con 500 microlitri di terreno di coltura fresco.

Successivamente, sostituire il terreno di coltura con il terreno originale salvato. Quindi, aggiungere alla coltura l'amminoacido Cmn premiscelato e innaturale in 50 microlitri di terreno di coltura caldo, ottenendo una concentrazione finale di un millimolare. Incubare la coltura trasfettata a 35 gradi Celsius per 12-48 ore prima della registrazione.

In questa procedura, preparare le soluzioni extracellulari e intracellulari. Nella nostra configurazione, il LED con emissione di 385 nanometri è installato accanto al microscopio per fornire luce a un centimetro di distanza dal punto focale con un angolo di 45 gradi. Quindi, estrarre alcune pipette patch con un elettrodo di vetro utilizzando un micro estrattore per pipette.

Successivamente, prendi un vetrino coprioggetti per colture neuronali dall'incubatrice e sciacqualo una volta nella soluzione extracellulare. Abbondantere il rig con soluzione extracellulare. Successivamente, posizionare il vetrino coprioggetti sulla piattaforma del microscopio elettrofisiologico, utilizzando le tecniche standard di patch clamping.

Cerotto su un neurone trasfettato con fluorescenze M-citrino. Successivamente, registra l'attività neuronale utilizzando il metodo del morsetto di corrente. Innanzitutto, regolare il potenziale di riposo a circa 72 millivolt negativi.

Quindi, iniettare una corrente di passo per indurre l'attivazione continua dei potenziali d'azione da cinque a 15 Hertz. Durante la registrazione, invia singoli impulsi LED al neurone e monitora i cambiamenti dei suoi potenziali d'azione. Quindi, aggiungere 0,5 millimolari di cloruro di bario al bagno, per recuperare i potenziali d'azione.

Nel contesto di una fetta cerebrale acuta, applicare un patch a un neurone con fluorescenti GFP M-cherry dalla regione neocorticale. Quindi, registrare l'attività PIRK utilizzando il metodo della rampa di tensione. In particolare, monitorare le correnti interne specifiche del Kir2.1 a 100 millivolt negativi.

Quindi, invia singoli impulsi LED al neurone durante la registrazione e monitora se le proteine PIRK sono attivate. Una volta attivato il PIRK, le correnti verso l'interno a 100 millivolt negativi aumenterebbero in modo significativo. Al termine, aggiungere 0,5 millimolari di cloruro di bario al bagno e verificare se PIRK è inattivato.

Qui sono mostrate immagini esemplari di colture neuronali ippocampali sane di ratto. E due neuroni sani che esibiscono corpi cellulari paffuti e dendriti e assoni pronunciati. Queste sono le immagini DIC e a fluorescenza di colture di neuroni ippocampali di ratto in vitro e trasfettate per l'espressione di PIRK senza CMN.

In presenza di un millimolare di CMN, i neuroni trasfettati sono in grado di esprimere le proteine PIRK M-citrino a lunghezza intera, mostrando così una fluorescenza verde. Ed ecco un esempio di un singolo impulso luminoso, che sopprime l'attività di un neurone ippocampale espresso da PIRK. Queste immagini a fluorescenza di neuroni corticali embrionali di topo mostrano il successo dell'incorporazione della CMN nelle proteine GFP e Kir2.1 in vivo.

In questo grafico, l'attivazione luce-dipendente di PIRK è indicata nelle correnti registrate dai neuroni neocorticali di topo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cerebrali causate dal malfunzionamento di specifiche proteine neuronali, ad esempio Kir2.1 mutata nella sindrome di Andersens, perché questa tecnica aiuta a scoprire quali circuiti cerebrali sono influenzati dai deficit di Kir2.1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per controllare la funzione delle proteine neuronali con luce ad alta specificità nei neuroni vivi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare amminoacidi innaturali nelle proteine nei neuroni per ottenere il controllo fotografico sulle proteine neuronali di interesse.