Name: Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Scopri come controllare otticamente le proteine neuronali utilizzando aminoacidi innaturali codificati geneticamente nei neuroni ippocampali. Questa tecnica consente di studiare la segnalazione neuronale con alta precisione spaziale e temporale.

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Ringraziamo il Dr. S. Szobota per l'utile discussione sulla coltura dei neuroni e la trasfezione Ca-P. L.W. riconosce il supporto del Salk Innovation Grant, del California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1) e del National Institutes of Health (1DP2OD004744).

Tutte le procedure in corso di studio sono state eseguite utilizzando Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) ha approvato i protocolli per la manipolazione degli animali presso il Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA. 1. SAU incorporazione in Kir2.1 ed espressione della risultante Pirk nella cultura primarie neuronali <ol><li> DNA costruzione <ol><li> Selezionare un sito di destinazione di Kir2.1 per SAU incorporazione. Exploit conoscenza preventiva e informazioni sulla struttura e la funzione di Kir2.1, in modo che il sito scelto con il fotosensibile SAU incorporato consente la modulazione ottica della funzione Kir2.1 21. </li><li> Costruire un gene Kir2.1 codifica del DNA ricombinante con il sito scelto mutato al TAG ambra codone di stop. Utilizzare le tecniche di clonazione standard di 25 per clonare il DNA Kir2.1-TAG in un plasmide di espressione di mammifero. </li><li> geni / sintetasi Clone tRNA che sono specifici per la SAU e incorporano la SAU in risposta ail codone di stop TAG in un&#39;altra espressione di mammifero plasmide 21. Nota: Per ottimale incorporazione SAU, diversi promotori e combinazioni di cassette geniche (per tRNA, sintetasi, e Kir2.1) possono essere testati in diversi plasmidi. </li><li> Ottenere DNA plasmide di alta qualità utilizzando miniprep o maxiprep kit commerciali secondo il protocollo del produttore. Intorno 1.9 del rapporto 260/280 è ottimale per il DNA purificato. Quando necessario, eseguire una elettroforesi su gel di agarosio per verificare la purezza del DNA preparata 25. DNA plasmide supercoiled con elevata purezza sono i migliori per la trasfezione neuronale. </li></ol></li><li> Cultura Rat neuroni dell&#39;ippocampo primaria <ol><li> coprioggetto posto vetro (cerchi, 12 mm di diametro) in piastre da 24 pozzetti, uno coprioggetto su ogni bene, e cappotto ogni pozzetto con 250 microlitri di 0,5 mg / ml di poli-D-lisina (in 100 mM tampone borato: 1,24 g borico acidi e 1,90 g di tetraborato di sodio in 400 ml di acqua distillata deionizzata H 2 o o DDH 2 </sub&gt; O a pH 8,5) per oltre 10 ore a temperatura ambiente, sigillato. Preparare circa 10-12 vetrini rivestiti al cucciolo. </li><li> Il giorno della dissezione, raccogliere i cervelli neonatali da cuccioli di ratto post-natale (1-4 al giorno postnatale) dopo di loro anestetizzare con isoflurano, e decapitare. Anestetizzare cuccioli in una camera contenente anestesia isoflurano (2-4%). Attendere fino a perdere coscienza e non riescono a rispondere a stimoli tattili e pizzicare delle zampe. </li><li> Utilizzando la tecnica standard 26, sezionare ippocampi dal cervello a caldo (~ 37 ° C) salina (10 mM HEPES e 20 mM D-glucosio aggiunto in soluzione salina bilanciata di Hank), e raccogliere ippocampi in un tubo conico con 4,5 ml di soluzione salina calda . </li><li> Aggiungere 500 ml di 2,5% tripsina al dell&#39;ippocampo (0,25% tripsina concentrazione finale) e incubare per 10 min in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Sciacquare il tessuto con soluzione salina (3 x 10 ml) e triturare. </li><li> Recuperare i neuroni dissociati in 1 ml wmezzi di crescita braccio contenenti Minimum Essential Medium (MEM) integrata con 5% siero fetale bovino (FBS), 21,2 mm D-glucosio, 2 mM L-glutammina, 2% B-27, e 0,1% di siero Extender. Nota: aggiungere L-glutamina e B-27 del giorno di dissezione per preparare mezzi di crescita fresco. </li><li> Contare le neuroni con un emocitometro e li piastra sul coprioggetto in piastre da 24 pozzetti a 1,0-1,5 x 10 5 cellule / pozzetto densità con terreni di crescita 500 microlitri dopo filtrata attraverso una rete di nylon 40 micron. </li><li> Incubare la coltura neuronale a 35 ° C in 5% CO 2: 95% incubatrice umidificata aria per 2-3 settimane. Per i migliori risultati, evitare di disturbare la cultura più possibile durante l&#39;incubazione. </li></ol></li><li> Fosfato di calcio (Ca-P) Trasfezione di primaria Cultura neuronale <ol><li> Fare soluzioni madre e conservare a 4 ° C: 0.5 M BES (N, N-bis [2-idrossi-etil] -2-aminoethanesulfonic acido) Buffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2.8 M NaCl (10x); DDH sterili 2 O; sterile 1 N NaOH. </li><li> Il giorno della transfezione, rendere fresca 2,5 M soluzione di CaCl 2 in DDH 2 O e filtro sterile con filtro 0,22 micron. Fare tampone 2x fresco BES-Buffered Saline (BBS) contenente 50 BES mm, 1,5 mm Na 2 HPO 4, e 280 mm NaCl a pH 7,00 (aggiustare il pH con NaOH) e filtro sterile con 0,22 micron filtro. Nota: Calcolare la quantità di soluzione di CaCl 2 e tampone BBS a seconda del numero di coprioggetto da transfettate. Anche guardare 1.3.4. </li><li> Sostituire i mezzi di crescita culturale con 500 terreni di crescita trasfezione ml fresca pre-riscaldato. (Mezzi di trasfezione possono essere fatte con MEM inclusa 21,2 mM D-glucosio). Nota: non gettare il vecchio supporto. </li><li> Calcolare la quantità di DDH 2 O e prepararsi ad aggiungere al fine di rendere la soluzione di trasfezione (33 microlitri per ogni coprioggetto) contenente 1,65 ml CaCl 2, 0.7 mg DNA, e 16.5 &amp;# 181; l 2x BBS. </li><li> Preparare la soluzione di trasfezione immediatamente prima di aggiungerlo alla cultura. Per preparare, prima combinare CaCl 2 e DDH 2 O mentre lentamente agitando il tubo. Continua agitazione e lentamente aggiungere DNA nella soluzione. Infine, aggiungere tampone 2x BBS goccia a goccia agitando. </li><li> Aggiungere immediatamente 30 ml di soluzione di trasfezione ad ogni vetrino della cultura neuronale. </li><li> Oscillare piatto cultura un paio di volte per miscelare la soluzione e incubare a 35 ° C in 5% CO 2: 95% incubatrice umidificata aria per 45 min-1 hr. Dopo neuroni vengono incubati con la soluzione di trasfezione, molto fini precipitati Ca-P formerebbero uno strato copre neuroni. </li><li> Sostituire il supporto trasfezione con 500 microlitri pre-riscaldato tampone di lavaggio (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM glucosio a pH 7.3, sterile filtrata con filtro 0,22 micron) e incubare a 356; C in CO 5% 2: 95% incubatrice umidificata dell&#39;aria per 15-20 min. precipitati Ca-P sparirebbero dopo la fase di lavaggio. </li><li> Sostituire il tampone di lavaggio con 500 microlitri terreni di coltura fresco. Anche in questo caso, sostituire i mezzi di crescita con il supporto originale salvato. </li><li> Aggiungere SAU Cmn (premiscelato in 50 microlitri di media crescita caldo) alla cultura per raggiungere 1 mM concentrazione finale. </li><li> Incubare la coltura transfettate a 35 ° C in 5% CO 2: 95% incubatrice umidificata aria per 12-48 ore prima del test. </li></ol></li><li> Tutta la registrazione delle cellule con l&#39;attivazione della luce <ol><li> Preparare le soluzioni extra / intracellulari. La soluzione intracellulare contiene 135 mM di potassio gluconato, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP e 0,3 mM Li 2 GTP a pH 7,4. La soluzione di registrazione extracellulare contiene 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio, e 10 mM HEPES a pH 7,4. </li><li&gt; Impostare l&#39;impianto di elettrofisiologia per patch di cellula intera bloccaggio: microscopio dotato di 4X e 20X obiettivi, contrasto interferenziale differenziale (DIC), e il filtro mCitrine (eccitazione: 495/10 nm, emissione: 525/25 nm); manipolatore; Amplificatore patch-clamp; digitalizzatore; acquisizione dati e software di analisi. <ol><li> Installare un diodo a emissione luminosa (LED) con emissione di 385 nm dal microscopio alla piattaforma per fornire luce al punto focale da 1 cm a 45 °. Controllare l&#39;alimentazione dei LED con un misuratore di potenza luminosa. </li></ol></li><li> Tirare le pipette di patch da elettrodi di vetro con un estrattore micropipetta commerciale di avere 3-6 MW resistenza pipetta. Seguire le istruzioni del produttore per impostare l&#39;estrattore micropipetta. <ol><li> Per testare la resistenza pipetta, prima riempire la pipetta con la soluzione intracellulare e posizionarlo sul supporto per elettrodi. Immergere la pipetta in un piatto di coltura 35 millimetri riempito con la soluzione extracellulare, collocato sul microscopio platform. Immergere un elettrodo di terra nel piatto per completare un circuito. </li><li> Accendere l&#39;amplificatore / digitalizzatore e avviare un software di acquisizione dati. Monitor resistenza pipetta con un protocollo di test a membrana. </li></ol></li><li> Estrarre un vetrino della cultura neurone dall&#39;incubatore e lavare una volta nella soluzione extracellulare. Utilizzando grasso per vuoto, tenere premuto il vetrino nel bel mezzo di un piatto della cultura 35 millimetri riempito con la soluzione fresca extracellulare. </li><li> Posizionare il vetrino / piatto sulla piattaforma elettrofisiologia microscopio. </li><li> Utilizzando le tecniche di patch di fissaggio standard rattoppare un neurone con mCitrine fluorescenza 27. attività neuronale record utilizzando pinza attuale metodo (I-clamp). Innanzitutto, regolare il potenziale di riposo a circa -72 mV iniettando una piccola corrente. Poi, iniettare una corrente passo (10-200 Pa) per indurre combustione continua (5-15 Hz) dei potenziali d&#39;azione. </li><li> Manualmente o utilizzando il software di acquisizione dati, lampeggiare un impulso (peccatoGLE impulso di 100 msec -1 durata sec) della luce LED per il neurone durante la registrazione, e vedere se i potenziali d&#39;azione sono interessati. </li><li> Aggiungere 0,5 mM BaCl 2 al bagno e verificare se i potenziali d&#39;azione sono recuperati. </li></ol></li></ol> 2. SAU incorporazione in Kir2.1 ed espressione della risultante Pirk nel embrionali di topo cervello In Vivo <ol><li> DNA costruzione <ol><li> Progettare il DNA plasmidico similmente come nel passo 1.1. Per l&#39;espressione in vivo, utilizzare un forte promotore come CAG (pollo beta-actina promotore con CMV enhancer). </li><li> Purificare DNA con un maxiprep kit commerciale privo di endotossine secondo il protocollo del produttore. Eseguire estrazione con fenolo-cloroformio seguita da precipitazione in etanolo 25 per l&#39;acquisizione del DNA di qualità estremamente elevata (condensato di 2-5 mg / mL). </li></ol></li><li> Elettroporazione in utero al embrionali di topo neocorteccia Nota: Il techni baseque per elettroporazione in utero è stato descritto in precedenza 28. <ol><li> Anestetizzare un mouse incinta cronometrato al giorno embrionale 14,5 (E14.5) con sodio pentobarbital (iniezione intraperitoneale, 50 mcg per grammo di peso corporeo) o isoflurano (inalazione, 2-4%). Monitorare profondità dell&#39;anestesia controllando la perdita di coscienza e nessuna risposta a stimoli tattili e pizzicare delle zampe. </li><li> Fai una piccola incisione sulla linea mediana addominale. esporre delicatamente le corna uterine con una pinza e dita. </li><li> Iniettare circa 1 ml soluzione DNA (2-5 mg / mL di ciascun plasmide, a seconda del costrutto) nel ventricolo laterale di ciascun littermate con una pipetta di vetro inserito attraverso la parete uterina. Nella maggior parte dei casi, circa il 60-80% del totale embrioni vengono iniettati. </li><li> Elettroporazione gli embrioni con un elettroporatore (33-35 V, 50 durata msec, 950 msec intervallo, 4-8 impulsi). </li><li> Riportare le corna uterine alla cavità addominale delicatamente con perporcini e punta delle dita. Suturare la parete muscolare e quindi la pelle con sutura chirurgica per consentire gli embrioni di continuare lo sviluppo. </li></ol></li><li> SAU microiniezione <ol><li> Fai una piccola incisione sulla linea mediana addominale di nuovo a E16.5, ed esporre delicatamente le corna uterine con una pinza e dita. </li><li> Iniettare circa 2-5 ml Cmn-Ala (500 mM) al lato elettroporate o entrambi i lati del ventricolo laterale con una pipetta di vetro inserito attraverso la parete uterina. Per aumentare la biodisponibilità Cmn, utilizzare il dipeptide Cmn-Ala (CMN-alanina) per fornire CMN nel vivo 21. </li><li> Anche in questo caso, riportare le corna uterine alla cavità addominale delicatamente con una pinza e punta delle dita. Suturare la parete muscolare e quindi la pelle con sutura chirurgica per consentire gli embrioni di continuare lo sviluppo. </li></ol></li><li> Ottenere acuta del cervello Fette <ol><li> Fare 1 L liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mm MgCl 2, 2,5 mM CaCl <sub&gt; 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26.2 mM NaHCO 3, e 11 mM di glucosio a pH 7.3. </li><li> Prendete 200 ml ACSF e di congelamento rapido a -80 ° C per 20-30 minuti. Bubble il resto ACSF con 5% di CO 2: 95% O 2 gas a temperatura ambiente. </li><li> Preparare e sterilizzare gli strumenti chirurgici per raccogliere i cervelli da embrioni. Anche preparare un secchio di ghiaccio. </li><li> Rendere ~ 100 ml 4% soluzione di agarosio a basso punto di fusione in un pallone mediante riscaldamento in un forno a microonde. Raffreddare la soluzione per circa 5 minuti prima che cominci a solidificare. </li><li> Euthanize l&#39;hr del mouse 12-24 dopo Cmn-Ala di iniezione di CO 2 overdose. Fare grandi incisioni nella zona addominale, e sezionare gli embrioni elettroporate / microiniettati dall&#39;utero con le forbici sottili e pinze. </li><li> cervelli Harvest da embrioni con le forbici sottili e pinze. </li><li> Posizionare ogni cervello su un piatto della cultura 10 centimetri posto sul secchio di ghiaccio. Dividere due emisferi con una lama affilata, e porre ognisemisfera sul piatto con il piano sagittale mediano toccare il fondo del piatto. versare rapidamente sulla soluzione di agarosio su cervelli (circa 500 microlitri per ogni emisfero). </li><li> Utilizzando una lama affilata, piazza tagliare l&#39;agarosio intorno ad un cervello per fare un blocco di agarosio cervello-embedded. </li><li> Usando tessuto adesivo, colla giù la superficie piano sagittale mediano del blocco agarosio su un supporto per vibratome. Riempire la camera vibratome con ACSF pre-raffreddata e tagliare 200 micron fettine di cervello sagittali. </li><li> Incubare fette acuta in ACSF integrato con 3 mM Myo-inositolo, acido ascorbico 0,4 mm, e 2 mm di sodio piruvato a 33 ° C per 42 min, mentre ribolle con 5% di CO 2: 95% O 2 gas. </li><li> Dopo 42 min, spegnere il riscaldatore e continuare ad incubare le fette a temperatura ambiente con spumeggiante. Avviare la registrazione di patch a cellula intera almeno 15 minuti dopo aver spento il riscaldamento. </li></ol></li><li> Tutta la registrazione delle cellule con l&#39;attivazione della luce <ol><li> Preparare il Intracsoluzione ellular contenente 130 mm gluconato di potassio, 4 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, 1,1 mm EGTA, 3,4 mm Na 2 ATP, 10 mM creatina fosfato di sodio, e 0,1 mM Na 3 GTP a pH 7,3 regolato con KOH. </li><li> Tirare le pipette di patch da elettrodi di vetro con un estrattore micropipetta commerciale di avere 3-6 MW resistenza pipetta. </li><li> Impostare l&#39;elettrofisiologia rig fetta di patch di bloccaggio intero-cellula e superfuse camera di registrazione con ACSF a 2 ml / min velocità di una pompa di perfusione. Regolare la temperatura della camera a circa 33 ° C. Nota: L&#39;impianto fetta elettrofisiologia è dotato di una camera di perfusione, un obiettivo immersione in acqua ed un regolatore di temperatura. Inoltre, il filtro GFP (eccitazione: 480/30 nm, emissione: 535/40 nm) e filtro mCherry (eccitazione: 580/20 nm di emissione: 675/130 nm) sono necessari. <ol><li> Installare un LED con emissione di 385 nm dal microscopio alla piattaforma per fornire luce per il punto focale da 1 cm di distanza a a 45 °angolo. Controllare l&#39;alimentazione dei LED con un misuratore di potenza luminosa. </li></ol></li><li> scegliere con cura una fetta cervello con una pipetta di vetro e posto nella camera di perfusione. Tenere premuto il fetta con l&#39;arpa. </li><li> Patch un neurone con mCherry / fluorescenza GFP dalla regione neocorticale 27. attività Pirk record utilizzando il metodo morsetto di tensione (V-clamp). In primo luogo, tenere il potenziale di membrana a -60 mV. Poi, le correnti registrano a potenziali fisse negative di membrana (-100 mV) o rampe di tensione (-100 mV a +40 mV). In particolare, il monitoraggio Kir2.1 specifiche correnti verso l&#39;interno a -100 mV. </li><li> Manualmente o utilizzando il software di acquisizione dati, lampeggiare un impulso (un singolo impulso di 100 msec -1 durata sec) della luce LED per il neurone durante la registrazione, e vedere se si attivano le proteine ​​Pirk. Una volta Pirk è attivato, le correnti verso l&#39;interno a -100 mV aumenterebbero in modo significativo. </li><li> Aggiungere 0,5 mM BaCl 2 al bagno e verificare se Pirk è inattivato di nuovo. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per raggiungere efficace foto-modulazione, l&#39;importante primo passo è quello di decidere dove incorporare il fotosensibile SAU nella proteina bersaglio. informazioni strutturali e funzionali della proteina bersaglio è molto utile per guidare la selezione dei siti candidati. Allo stesso tempo, allo scopo di regolazione della luce sarebbe determinare quale sito è più adatto. Dopo aver scelto i siti candidati, si consiglia di testare i siti in linee cellulari di mammiferi come il rene embrionale umano (HEK) celle per f...

Rispetto alla stimolazione elettrica convenzionale, fotostimolazione offre una maggiore risoluzione temporale e spaziale, con un minimo al sistema fisiologico di esemplari. Dal momento che la manifestazione di utilizzare il laser per stimolare i neuroni nel 1971 1, molti modi creativi sono stati inventati per controllare esogena attività neuronale con la luce. Rilascio ottica di agonisti photocaged è stato a lungo utilizzato per studiare la risposta fisiologica della rete neuronale di ligandi 2,3,4. Questa tecnica ha limitato specificità dovuta alla diffusione di agonisti gabbia. Specificità genetica si ottiene che esprimono canali ectopicamente opsine sensibili alla luce e pompe 5,6,7, ed è stato applicato con successo per modulare reti neuronali selezionati in diversi organismi modello. Tuttavia, sarebbe difficile applicare questo metodo per controllare otticamente varie altre proteine ​​neuronali, poiché l&#39;innesto photoresponsiveness dalle proteine ​​opsin ad altre proteine ​​would richiedono engineering intensa che possono alterare le caratteristiche naturali della proteina in esame. Chimicamente legare un ligando esogeno fotosensibile ad una proteina ha dimostrato un altro modo per controllare la funzionalità delle proteine ​​canale 8,9,10. Il legante è presentato o ritirato dal sito di legame della proteina attraverso la fotoisomerizzazione della porzione azobenzene. Tethering chimica limita l&#39;applicazione principalmente al lato extracellulare di proteine ​​di membrana, escludendo il lato intracellulare e proteine ​​intracellulari. Fotoresponsivi Uaas, dopo essere stato incorporato nelle proteine, forniscono una strategia generale per manipolare le proteine ​​con la luce. Nel primi sforzi, tRNA acilata chimicamente con Uaas photocaged stati microiniettati in ovociti di Xenopus per incorporare le Uaas in recettori di membrana e canali ionici 11, che hanno avanzato la comprensione delle loro relazioni struttura-funzione 12,13,14.Questo approccio microiniezione è principalmente limitata alle grandi ovociti. Costituzione genetica di una SAU bypassa il tecnicamente impegnativo tRNA acilazione e microiniezione utilizzando una coppia di tRNA / sintetasi ortogonale, che incorpora la SAU attraverso la traduzione della proteina endogena in cellule vive 15,16,17,18. SAU incorporazione in proteine ​​neuronali è stata dimostrata in neuroni primari e le cellule staminali neurali 19,20. Più recentemente, fotosensibile SAU è stata geneticamente incorporato in una proteina neuronale nel cervello dei mammiferi in vivo per la prima volta 21. Questi progressi permettono di studiare le proteine ​​neuronali con Uaas nel loro ambiente cellulare nativo. Canale del potassio Rettificante internamente Kir2.1 è un forte raddrizzatore che passa K + correnti più facilmente in quanto dalla cellula, ed è essenziale nella regolazione dei processi fisiologici tra cui eccitabilità cellulare, tono vascolare, frequenza cardiaca, reflusso di sale finale e rilascio di insulina 22. Sovraespressione di Kir2.1 Hyperpolarizes del potenziale di membrana del neurone bersaglio, che diventa meno eccitabile 23,24. Per controllare otticamente Kir2.1 nelle sue cellule native, Kang et al. Geneticamente incorporato una foto-sensibile SAU in Kir2.1 espresso in cellule di mammifero, i neuroni e cervello embrionali di topo 21. Un breve impulso di luce è in grado di convertire il SAU in un amminoacido naturale Cys, attivando così la proteina Kir2.1 bersaglio. Quando questa foto-inducibile canale proteina interiormente rettificazione potassio (Pirk) è stato espresso in ratto neuroni ippocampali primari, è soppressa neuronale in risposta all&#39;attivazione luce. Inoltre, il canale Pirk stato espresso nella neocorteccia embrionali di topo, e la corrente di luce-attivato Pirk nei neuroni corticali è stato misurato. Il successo dell&#39;attuazione della tecnologia SAU in vivo nel cervello dei mammiferi si apre la porta per controllare otticamente proteine ​​neuronalinel loro ambiente nativo, che permetterà la dissezione ottica di processi neuronali e meccanismi a livello molecolare. In questo protocollo si descrivono le procedure per incorporazione genetica di Uaas in neuroni primari nella cultura e nel cervello embrionale del mouse in vivo. Il fotosensibile SAU Cmn e Kir2.1 sono utilizzati per illustrare il processo. I metodi per valutare il successo incorporazione SAU e controllo ottico di attività della proteina neuronale sono forniti. Questo protocollo fornisce una guida chiara per geneticamente codifica Uaas nei neuroni e in vivo, e alla regolamentazione otticamente la funzione delle proteine ​​neuronali attraverso una SAU fotosensibile. Ci aspettiamo che questo protocollo per facilitare l&#39;adozione della tecnologia in vivo SAU per le neuroscienze e studi biologici optogenetic.

<table><tbody><tr><td>Occhiali di copertura, cerchi, 12 mm, spessore 0,13-0,17 mm</td><td>Carolina Biologicals</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td><td>Corning Discovery Labware</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di D-(+)-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Iris Spatola-curvo</td><td>Fine Science Tool</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>Coltello da dissezione - Punta</td> <td>angolata fineStrumento per le scienze fini</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Integratore GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Estensore di siero MITO+</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Filtro cellulare</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES (N,N-Bis(2-idrossietil)-2-amminoetanosolfonico, N,N-Bis(2-idrossietil)taurina)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>SORGENTE LUMINOSA A LED &ndash; Nero LED 385</td><td>Prizmatix Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, basso punto di fusione, grado analitico</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

controllo ottico di una proteina neuronale utilizzando un acido innaturale amino geneticamente codificata in neuroni

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

La fotostimolazione è un modo non invasivo per controllare gli eventi biologici con un'eccellente risoluzione spaziale e temporale. Sono necessari nuovi metodi per fotoregolare le proteine endogene espresse nel loro ambiente nativo. Qui, presentiamo un approccio per controllare otticamente la funzione di una proteina neuronale direttamente nei neuroni utilizzando un amminoacido innaturale (Uaa) geneticamente codificato. Utilizzando una coppia ortogonale tRNA/amminoacil-tRNA sintetasi per sopprimere il codone ambrato, un Uaa 4,5-dimetossi-2-nitrobenzil-cisteina (Cmn) foto-reattivo è incorporato site-specific nel poro di una proteina neuronale Kir2.1, un canale del potassio rettificante verso l'interno. L'ingombrante Cmn blocca fisicamente il poro del canale, rendendo Kir2.1 non conduttore. L'illuminazione della luce converte istantaneamente Cmn in un amminoacido naturale Cys più piccolo, attivando la funzione del canale Kir2.1. Esprimiamo questi canali del potassio (PIRK) a r ettificazioneverso l'interno nei neuroni primari dell'ippocampo di ratto e dimostriamo che l'attivazione alla luce di PIRK cessa l'attivazione neuronale a causa del deflusso di corrente K+ attraverso i canali Kir2.1 attivati. Utilizzando l'elettroporazione in utero, esprimiamo anche PIRK nella neocorteccia embrionale del topo in vivo, mostrando l'attivazione della luce di PIRK nei neuroni neocorticali. La codifica genetica degli Uaa non impone restrizioni sul tipo di proteina bersaglio o sulla posizione cellulare, ed è disponibile una famiglia di Uaas fotoreattivi per modulare diversi residui di amminoacidi naturali. Questa tecnica ha quindi il potenziale per essere generalmente applicata a molte proteine neuronali per ottenere la regolazione ottica di diversi processi nel cervello. L'attuale protocollo presenta una procedura accessibile per l'incorporazione complessa di Uaa nei neuroni in vitro e in vivo per ottenere il controllo fotografico dell'attività delle proteine neuronali a livello molecolare.

Per geneticamente incorporare un SAU in una proteina nei neuroni, il primo passo importante è quello di progettare gene appropriata costruisce per fornire ed esprimere i geni in modo efficiente in neuroni. Ci sono tre componenti genetiche per SAU incorporazione: (1) il gene bersaglio con il TAG ambra codone di stop introdotta nel sito prescelto per SAU incorporazione (2) un tRNA ortogonale riconoscere il mutato codone di stop TAG, e (3) un aminoacil ortogonali -tRNA sintetasi per caricar...

Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è controllare otticamente la funzione di una proteina neuronale mediante un aminoacido non naturale codificato geneticamente nei neuroni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sul ruolo di una specifica proteina neuronale nella segnalazione neuronale durante il funzionamento cerebrale, con risoluzione spaziotemporale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che potenzialmente può essere applicata a diverse proteine neuronali per ottenere una regolazione ottica di vari processi neuronali.Iniziare questa procedura seminando neuroni ippocampali su coprivetrini in una piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di terreno di crescita, dopo aver filtrato attraverso una maglia di nylon da 40 micrometri. Successivamente, incubare la coltura neuronale a 35 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata con 5 percento di anidride carbonica e 95 percento di aria per 2-3 settimane. Nel giorno della trasfezione, preparare una soluzione fresca di cloruro di calcio 2,5 molare in acqua bidistillata e filtrarla sterilmente con un filtro da 0,22 micrometri.Successivamente, preparare una soluzione di BBS 2X fresca a pH 7 e filtrarla in modo sterile mediante un filtro da 0,22 micrometri. Dopodiché, sostituire il terreno di coltura con 500 microlitri di terreno per la trasfezione fresco e preriscaldato, senza scartare il vecchio terreno di coltura. Preparare la soluzione di trasfezione immediatamente prima di aggiungerla alla coltura mescolando cloruro di calcio e acqua bidistillata, agitando lentamente il tubo.Continuare ad agitare il tubo e aggiungere lentamente il DNA nella soluzione. Successivamente, aggiungere il buffer BBS 2X goccia a goccia. La preparazione del buffer BBS 2X è un passaggio fondamentale nella trasfezione con fosfato di calcio, ed è consigliabile calibrare il pH ottimale del buffer BBS 2X compreso tra 6,90 e 7,15 per nuovi costrutti o preparazioni di DNA.Quindi, aggiungere immediatamente 30 microlitri della soluzione di trasfezione a ciascun coverslip della coltura neuronale. Agitare delicatamente la piastra di coltura alcune volte per mescolare la soluzione e incubarla a 35 gradi Celsius per 45 minuti fino a un'ora. Dopo circa un'ora, dovrebbe essere osservato uno strato di fini precipitati di fosfato di calcio che ricopre i neuroni.Successivamente, sostituire il mezzo di trasfezione con 500 microlitri di tampone di lavaggio preriscaldato e incubare a 35 gradi Celsius per 15-20 minuti. I precipitati di fosfato di calcio dovrebbero scomparire dopo il lavaggio. A questo punto, sostituire il tampone di lavaggio con 500 microlitri di mezzo di crescita fresco.In seguito, sostituire il mezzo di crescita con il mezzo originale conservato. Quindi, aggiungere all'coltura 50 microlitri di mezzo di crescita tiepido contenente l'amminoacido non naturale Cmn pre-miscelato, ottenendo una concentrazione finale di un millimolare. Incubare l'coltura trasfettata a 35 gradi Celsius per 12-48 ore prima della registrazione.In questa procedura, preparare le soluzioni extracellulari e intracellulari. Nel nostro apparato, il LED con emissione di 385 nanometri è installato accanto al microscopio per fornire luce a un centimetro di distanza dal punto focale con un angolo di 45 gradi. Successivamente, tirare alcune pipette per il patch con un elettrodo di vetro utilizzando un tiratore di micropipette.In seguito, prelevare una coprislitta con colture di neuroni dall'incubatrice e risciacquarla una volta nella soluzione extracellulare. Perfondere il sistema con soluzione extracellulare. Successivamente, posizionare la coprislitta sulla piattaforma del microscopio per elettrofisiologia, utilizzando tecniche standard di patch clamping.Effettuare una registrazione su un neurone trasfettato con fluorescenza M-citrine. Successivamente, registrare l'attività neuronale utilizzando il metodo di clampaggio in corrente. Per prima cosa, regolare il potenziale di riposo intorno a -72 millivolt.Quindi, iniettare una corrente a gradino per indurre un'attivazione continua di potenziali d'azione a cinque-quindici hertz. Durante la registrazione, applicare impulsi singoli di luce LED al neurone e monitorare le variazioni dei suoi potenziali d'azione. Successivamente, aggiungere cloruro di bario 0,5 millimolare nel bagno per recuperare i potenziali d'azione.In un preparato di fetta cerebrale acuta, effettuare un'impaccettatura su un neurone con fluorescenza M-cherry GFP proveniente dalla regione neocorticale. Successivamente, registrare l'attività di PIRK utilizzando il metodo della rampa di tensione. In particolare, monitorare le correnti entranti specifiche per Kir2.1 a meno 100 millivolt.Quindi, somministrare impulsi singoli di LED al neurone durante la registrazione e monitorare se le proteine PIRK vengono attivate. Una volta attivato PIRK, le correnti entranti a meno 100 millivolt aumenterebbero in modo significativo. Alla fine, aggiungere 0,5 millimolare di cloruro di bario nel bagno e verificare se PIRK viene inattivato.Qui sono mostrate immagini esemplificative di colture neuronali sane di ippocampo di ratto. E due neuroni sani che presentano corpi cellulari voluminosi e dendriti e assoni ben sviluppati. Queste sono immagini in contrasto di interferenza differenziale (DIC) e in fluorescenza di colture di neuroni ippocampali di ratto in vitro, trasfettati per l'espressione di PIRK senza CMN.In presenza di un millimolare di CMN, i neuroni trasfettati sono in grado di esprimere proteine PIRK M-citrine a lunghezza intera, mostrando così una fluorescenza verde. Ecco un esempio di un singolo impulso luminoso che sopprime l'attività di un neurone ippocampale che esprime PIRK. Queste immagini di fluorescenza di neuroni corticali embrionali di topo mostrano l'incorporazione con successo di CMN in proteine GFP e Kir2.1 in vivo.In questo grafico, l'attivazione dipendente dalla luce di PIRK è indicata nelle correnti registrate dai neuroni neocorticali del topo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di malattie cerebrali causate dal malfunzionamento di specifiche proteine neuronali, ad esempio la Kir2.1 mutata nel sindrome di Andersen, poiché questa tecnica aiuta a scoprire quali circuiti cerebrali sono colpiti dai deficit di Kir2.1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per controllare con luce la funzione delle proteine neuronali con elevata specificità in neuroni vivi.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare aminoacidi non naturali nelle proteine nei neuroni per ottenere un controllo fotochimico sulle proteine neuronali di interesse.

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Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

Adulti-nato neuroni che esprimono ChR2 può essere manipolata in preparati fetta elettrofisiologici al fine di esaminare il loro contributo verso la funzione olfattiva di circuiti neurali.

Utilizzando conveniente array LED per la foto-stimolazione dei neuroni

Prendete una coltura di Corynebacterium glutamicum, trasformata con un plasmide che trasporta un gene reporter fluorescente a valle dell'anti-terminatore dell'acido ribonucleico o della sequenza RAT, in una piastra a più pozzetti.Durante la trascrizione, il RAT-RNA forma una struttura stem-loop che blocca l'RNA polimerasi, arrestando l'espressione del gene reporter.Il plasmide esprime anche costitutivamente LicV, una proteina di fusione che comprende la proteina legante l'RNA del ratto, LicT, e...

Controllo optogenetico dell'espressione genica nel Corynebacterium glutamicum

Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

In questo articolo si descrive un miglioramento della convenzionale fluorometria a tensione di tensione (VCF) in cui vengono utilizzati fluorocinosi aminoacidi innaturali (fUAA) anziché coloranti maleimidi, per sondare i riarrangiamenti strutturali nei canali ionici. La procedura prevede l'iniezione di DNA Xenopus oocyte, la coinjection RNA / fUAA e le misure contemporanee di corrente e fluorescenza.

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Questo protocollo descrive una strategia optogenetica per modulare l'attivazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) durante la differenziazione cellulare e lo sviluppo embrionale di Xenopus . Questo metodo consente l'attivazione reversibile del percorso di segnalazione MAPK nella coltura di cellule di mammiferi e negli organismi vivi multicellulari, come gli embrioni di Xenopus , con elevata risoluzione spaziale e temporale.

Modulazione reversibile mediata dalla luce del percorso proteico di kinasi attivato da Mitogen durante la differenziazione cellulare e<em&gt; Xenopus</em&gt; Sviluppo embrionale

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro su come combinare artificiale microRNA-mediata RNA interference con optogenetica per stimolare specificamente i boutons presinaptici con ridotta espressione dei geni selettivi all'interno di circuiti neuronali intatti.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Il controllo affidabile delle cellule di mammifero sensibili alla luce richiede la standardizzazione dei metodi optogenetici. Verso questo obiettivo, questo studio delinea una pipeline di costruzione di circuiti genici, ingegneria cellulare, funzionamento di apparecchiature optogenetiche e saggi di verifica per standardizzare lo studio dell'espressione genica indotta dalla luce utilizzando un circuito genico optogenetico a feedback negativo come caso di studio.

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

Questo protocollo descrive l'applicazione di un dominio di commutazione allosterica attivato dalla luce blu (LightR) ingegnerizzato per il controllo spaziotemporale reversibile dell'attività proteica. Utilizzando la tirosin-chinasi Src come modello, questo studio offre un protocollo elaborato per lo sviluppo e la caratterizzazione di Src regolata dalla luce (LightR-Src). Dimostra la versatilità di questo approccio in tutte le classi di enzimi.

Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Scopri come controllare otticamente le proteine neuronali utilizzando aminoacidi innaturali codificati geneticamente nei neuroni ippocampali. Questa tecnica consente di studiare la segnalazione neuronale con alta precisione spaziale e temporale.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

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