Name: Protocollo di differenziazione cerebellare 3D semplificata con modifica 2D opzionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Impara un protocollo semplificato di differenziazione cerebellare 3D con hPSC per studiare i disturbi cerebrali infantili. Questo metodo utilizza mezzo definito e fattori di crescita ridotti per generare linee cellulari cerebellari.

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Siamo grati a Gerbren Jacobs e Jurjen Broeke per loro assistenza di tecnico esperti, di Prisca Leferink per contribuire alla generazione e alla caratterizzazione delle due linee di controllo iPSC e Lisa Gasparotto per dimostrare le nostre procedure.

<ol><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li>
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<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li>
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<li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6%2C+Tbr2%2C+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Complessità e i costi sono fattori rilevanti per ricercatori sulle cellule staminali quando scegliendo o lo sviluppo di protocolli di differenziazione. Ciò è particolarmente vero in quanto è una questione aperta di quanto controllo esterno è necessaria per generare tipi di cella desiderata, o — porre in modo diverso — come hPSCs competenti sono a produrre il proprio ambiente di sviluppo, se lasciati a se stessi con sufficiente sostanze nutrienti. Introduzione di fattori estrinseci in vitro può produrre molto bene i prodotti cella desiderata, ma potrebbe anche interferire con la capacità inerente allo sviluppo intrinseco avrebbero esibito cellule in vivo. Tali considerazioni sono importanti, soprattutto se l'obiettivo è uso di iPSCs derivate dal paziente per la modellazione di malattia. Ampio uso di campitura e/o fattori di crescita potrebbe mascherare fenotipi di malattia. I protocolli dettagliati in questo rapporto seguono l'andamento degli studi precedenti per ridurre la complessità, costo e/o utilizzo di fattori estrinseci patterning8,9.
Basato su risultati riportati da Muguruma et al., nostro recente studio, sembra che è possibile raggiungere la differenziazione verso destini cerebellare senza sforzi concertati per riprodurre condizioni in vivo , come hanno fatto gli studi più iniziali 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. la parte intrigante è che i due studi usato diversi insiemi di fattori di crescita, suggerendo che né insieme era necessarie, anche se entrambi utilizzati FGF2. Abbiamo fatto gli esami aggiuntivi, dove sono stati selettivamente escluso dal protocollo FGFs e ha mostrato che le cellule erano in grado di generare gli stessi prodotti senza estrinseca FGFs10. Differenze tra i nostri studi sono state qualificate dal fatto che abbiamo usato hPSC diverse linee e i metodi di coltura, ha indotto la differenziazione neurale con RA e incluso componenti per supportare la sopravvivenza delle cellule del granello e maturazione (BDNF, GDNF, SAG e KCL)11 –14. Inoltre, è stato impiegato un metodo di avvio meno complesso, rispetto al Muguruma et al.. Il protocollo ha cominciato generando EBs uniforme di 96WPs, che li isolati fisicamente e chimicamente da altro. Il protocollo qui aveva tutti i PSC relativamente affollati insieme in 6WPs durante la formazione di EB, che ha permesso loro di interagire liberamente. Come questo può differenzialmente influenzato l'ambiente fisico e chimico di EBs e successive organoids (compresa la produzione intrinseca di composti di segnalazione) è sconosciuto e potrebbe essere esplorato. Inoltre, mentre ci mostrano l'espressione di geni associati con — e così suggestivo di — origine cerebellare, situato all'interno di strutture morfologicamente simili a quelli riportati da Muguruma et al., non possiamo escludere la generazione di un neurone-come strutture che sono di identità non-cerebellare. Gli studi futuri, utilizzando un grande pannello di anticorpi simili a quelli riportati da Muguruma et al. (cioè, ATOH1, CALB, ecc.) renderebbe tali assegnazioni e confronto tra prodotti di entrambi i protocolli, più conclusivi.
All'interno del protocollo 3D, è importante per cominciare e mantenere un numero sufficiente di cellule in coltura per assicurare un numero sufficiente di prodotti finiti per l'analisi. Data la significativa diminuzione presto nel protocollo, si consiglia di iniziare con più di 500 EBs/pozzetto durante i primi 3 giorni nella cultura (Figura 1). Questo non dovrebbe essere difficile da realizzare dato Colonia dimensioni per hPSCs nella cultura senza alimentatore, ma potrebbe non essere così facile per chi utilizza ancora metodi di alimentatore-dipendente. Dato il gran numero di celle, è importante da guardare per cambiamento di colore nel mezzo (che indica le variazioni del pH) e accumulo di cellule morte. Entrambi devono essere corretti per prevenire il collasso della cultura. Ci possono essere anche agglutinamento delle cellule e degli aggregati in strutture massicce. Anche se si potrebbero ancora aggregati che possono essere analizzati, quantità di prodotto sarà notevolmente ridotto, così li rompere in piccoli aggregati con delicata triturazione può essere utile. Tuttavia, evitare di inquietanti aggregati normali, che a loro volta possono crescere fino a grandi dimensioni (Figura 4). Se gli aggregati diventano troppo radi, si consiglia di combinare pozzi, in modo che gli aggregati non sono completamente isolati. Variabilità del prodotto (in numero, dimensioni e morfologia) è un problema ben noto nella coltura cellulare 3D, tra cui per tali protocolli a partire con passaggi formazione EB isolati, uniforme, suggerendo che una procedura di avvio meno complessa (ad esempio il protocollo descritto qui ) potrebbe essere più pratico8,15. Mentre questa eterogeneità è qualcosa che i ricercatori devono tenere a mente, in particolare durante l'analisi, il protocollo ha segnalato generato prodotti coerenti con quelli trovati in altri protocolli 3D8,9,15. Base alle dimensioni e morfologia, cadono all'interno della gamma di Rosetta neurale a organoid cerebrale, come descritto in una recente revisione di Kelava e Lancaster15, con la maggior parte la classificazione della sferoide di montaggio. Particolarmente degno di nota, sono indicativi di rosette neurale con lume, zone ventricolare (sub) e rombico-labbro come caratteristiche la presenza di strutture 3D (Figura 5 e Figura 6) come identificato da altri gruppi di8 , 15 , 16 , 17. dal momento che ogni esperimento produsse almeno una aggregazione con presunti VZ/SVZs e cerebellare-collegata marcatori (ZIC1, KIRREL2), quelli sono utili criteri per determinare il successo di una differenziazione 3D utilizzando il nostro protocollo, con RL-come funzionalità che fornisce ulteriore supporto. Estendere la lunghezza della cultura ultimi 35 giorni non è stato testato, ma potrebbe essere perseguito per determinare il limite massimo di crescita, complessità e maturità consentito da questa tecnica.
Il protocollo 2D utilizza la stessa formazione di EB non aderente e il processo di induzione neurale come il protocollo 3D e così le osservazioni di cui sopra si applicano anche. Una volta placcato, dovrebbe essere considerato un diverso insieme di considerazioni. L'EBs dovrebbe aderire in fretta per cellule di proliferare verso l'esterno sulla piastra. Se ci sono problemi con aderenza, aggiunta di RI (se non già utilizzato), ridotto volume di terreno, o possono essere applicate modifiche sperimentali nella concentrazione di PLO/LAM. È importante mantenere le cellule dalla crescita troppo denso o troppo radi (preferibilmente coltivati tra 20-80% confluency) nei pozzetti; monitoraggio quotidiano e tempestivo passaggio è importante, per evitare over-confluenza o galleggiante celle. A differenza del protocollo 3D, non dovrebbero esserci diminuzione significativa durante la coltura, anche se ci possono essere zone di scarsa crescita, o un rallentamento del tasso di proliferazione. Passaggio influisce sullo stato di maturazione delle cellule (ad esempio, rimuovere i processi delle cellule e reti sviluppate fra le cellule) e dovrebbe essere tenuto presente quando si avvicina punti dove le cellule verranno raccolti o analizzate in qualche modo. Ad esempio, per calcio imaging è molto importante per le cellule di passaggio tra 2-6 giorni prima dell'analisi. Passaggio troppo vicino alla analisi potrebbero significare le cellule non hanno avuto tempo per la connessione e/o matura e troppo lontano può provocare cellule sovraffollamento, rendendo difficile la formazione immagine. Sebbene esista variabilità fra gli esperimenti, i risultati sono coerenti con quelli segnalati in iniziale 2D protocolli cerebellare1,2. Analisi di espressione di macchiatura e gene ICC confermano la presenza di cellule positive per indicatore delle cellule del granello ZIC1, identificando anche gli indicatori connessi con altre identità neurale e cerebellare (Figura 7 e Figura 8). La formazione immagine del calcio, che coinvolge la stimolazione elettrica delle cellule incubate con tintura di fluor5, indicata attività neuronale funzionale (Figura 9, supplementare nella figura 1e supplementare nella figura 2), anche se non è confermato se questi erano cellule del granello. Si può sostenere che dando le cellule più tempo per maturare, estendendo la lunghezza della cultura ultimi 35 giorni, dovrebbe aumentare la quantità di attività neuronale funzionale. Questo potenziale potrebbe essere esplorato in futuro.
Oltre le linee di ricerca suggerito sopra, sarebbe di interesse determinare differenze di identità di prodotto (quantità e qualità) tra i protocolli di 2D e 3D. L'importanza di FGFs estrinseca non è stato testato nel protocollo 2D, e sarebbe utile sapere se la mancanza di struttura 3D dopo il placcaggio, e così le vie di segnalazione associate, renderebbe la 2D culture più o meno dipendente da quelli presto patterning composti. Ulteriori protocolli Stripped-Down (ad es., no RA, BDNF, SAG) sono ugualmente plausibile linee per ulteriori indagini. Infine, gli studi futuri possono beneficiare di nuovi strumenti di ricerca per meglio caratterizzare (e valutare l'efficienza di generazione) umani specifici sottotipi neuronali cerebellare.
Con i dato avvertimenti in mente, entrambi segnalati protocolli possono essere utilizzati per differenziazioni cerebellare, con prodotti adatti a scopi diversi. Possono servire come punti di partenza pratici per ricercatori che intraprendono studi pilota, test di vitalità delle linee cellulari per tali differenziazioni, o come un modello di base per altri tipi di differenziazione neurale mirato.

Protocolli in vitro per la differenziazione hPSCs verso cerebellare lignaggi inizialmente operato sul principio di che imita in vivo sviluppo cerebellare1,2,3,4. Come tali, hanno richiesto una serie di fattori a qualcuno di presentarti a orari specifici per guidare la maturazione e pro-cerebellare patterning. Primo fra questi erano WNT, bone morphogenetic proteins (BMPs) e fattori di crescita del fibroblasto (FGFs) con ruoli noti Mid-hindbrain sviluppo e formazione di isthmic organizzatore5,6,7. Naturalmente, ogni ulteriore passaggio e fattore significa un aumento in manipolazioni alta intensità di lavoro e una maggiore spesa per il ricercatore, e così lo sviluppo di protocolli più semplici in grado di raggiungere risultati uguali è di interesse. Questo problema pratico ben combacia con la domanda ipotetica, se le cellule richiedono tale controllo stretto, esterno sul loro sviluppo in vitro.
Per differenziazione cerebellare, un protocollo pubblicato nel 2015 ha affrontato la necessità di utilizzare un vasto numero di fattori di crescita utilizzando solo FGF2, FGF19 e fattore di cellula-derivato stromal 1 (SDF1) per patterning fini8. Questo studio inoltre hanno differito da precedenti protocolli cerebellare, utilizzando un sistema di coltura 3D digalleggiante. Oltre a produrre cellule positive per marcatori cerebellare, il cervello "organoids" generato dalla loro tecnica sono stati indicati per esibire morfologia pertinente, non disponibile in colture monostrato 2D tradizionale, quali rombiche labbro-come le strutture. Anche se meno complesso e costoso riguardo ai fattori di crescita, altre caratteristiche quali la formazione di corpi embryoid uniformi (EBs) e cultura in piastre da 96 pozzetti (96WPs), rendeva proceduralmente complessa durante i primi passi. Un altro protocollo 3D pubblicato lo stesso anno, segnalato successo differenziazione neurale lignaggi utilizzando cella comune e poco costoso cultura tecniche9. Anche se questo gruppo stava indagando corticale piuttosto che di differenziazione cerebellare, applicazione del loro concetto di differenziazione cerebellare potrebbe non essere scontato.
Recentemente abbiamo segnalato un protocollo di differenziazione cerebellare 3D utilizzando un ridotto numero di fattori di campitura (vale a dire, FGF2, 4 e 8), così come una configurazione semplificata mantenendo le cellule in piastre da 6 pozzetti (6WPs) tutto il tempo per ridurre al minimo i requisiti medi10. Per facilitare la produzione di cellule del granello, levigato agonista (SAG) è stato utilizzato durante la fase di maturazione finale. L'abbassamento è un'alternativa meno costosa di chimica di sonic hedgehog (SHH), che era stato usato in precedenza cerebellare protocolli, dovuto il relativo ruolo nel promuovere la crescita dei granuli delle cellule precursori (GCPs) in vivo1,2, 11,12,13. Prodotti di differenziazione erano costanti con quelli di altri protocolli 3D, compresa la presenza di marcatori cerebellare-collegata in strutture morfologicamente competenti8,9. Tali risultati rafforzano il messaggio precedente che dettagliate mimetismo di nella vivo ambiente potrebbe non essere necessario per i protocolli complessi 3D in vitro di differenziazione.
Oltre al protocollo 3D, questo rapporto descrive un protocollo 2D, progettato con la stessa configurazione rapida, materiali di base e ridotto numero di fattori di crescita. È in grado di produrre cellule staminali embrionali umane (hESC) o indotta da cellule staminali pluripotenti (hiPSCs), positivo per gli indicatori associati all'inizio neurale, cerebellare e identità delle cellule del granello. Inoltre, la formazione immagine del calcio indica la presenza di neuroni umani funzionali. La possibilità di scegliere tra protocolli, aggiunge un livello di flessibilità per i ricercatori, per coloro che sono interessati in entrambi: (1) generazione cellulari specifici tipi, lo sviluppo del cervello umano (2) modellazione e strutture, (3) analisi ottimizzato nello strato monomolecolare associate le impostazioni (ad es., registrazioni di patch-clamp), o (4) interazioni cellula-cellula in colture miste neurale. Loro natura semplice e a basso costo li rende accessibili per i ricercatori che sono nuovi al campo hPSC, o hanno bisogno di procedure di hPSC base da cui partire per esplorare ulteriormente le opzioni di differenziazione.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>glutammina fortificata DMEM/F12</td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>integratore di base neurale</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>integratore B27</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td>Imgen PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poli (2-idrossietilmetacrilato)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>alias Poli-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 medium e integratore</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC medium e integratore</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (inibitore ROCK)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Rivestimento aderente idoneo per hPSC (PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Filtro da 0,2 um</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo Eppendorf</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>involucro per piastre per colture</td></tr><tr><td>criotubi</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td> agente <td>di dissociazione a base di tripsina</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina definito (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R& D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato dal cervello</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato gliale</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrofico Fattore 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Agonista levigato (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert 40C Microscopio</td> per <td>imaging in campo chiaro</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging in campo chiaro - acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>Centrifuga Eppendorf 5810</td><td>Centrifuga Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipette sierologiche</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipette sierologiche</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 6 pozzetti</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 12 pozzetti</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESC</td><td>WiCELL</td><td></td><td>linea H01</td></tr></tbody></table>

protocollo di differenziazione cerebellare 3d semplificata con modifica 2d opzionale

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Ridurre la complessità e il costo dei protocolli di differenziazione è importante per i ricercatori. Questo interesse si adatta con le preoccupazioni circa possibili effetti non intenzionali che fattori estrinseci patterning potrebbero introdurre in cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) modelli di sviluppo del cervello o di patofisiologia, come mascheramento fenotipo della malattia. Qui, presentiamo due protocolli di differenziazione cerebellare per hPSCs, progettato con metodo di avvio più semplice, meno fattori di patterning e meno richieste di materiale rispetto ai protocolli precedenti. Recentemente, abbiamo sviluppato procedure di cultura, che generano digalleggiante 3-dimensionale (3D) prodotti coerenti con altri protocolli di "organoid" del cervello, tra cui morfologie rilevanti per lo sviluppo del cervello come sub/ventricolare zona - di modellazione e rombiche labbro-come le strutture. La seconda utilizzata una routine monostrato aderente, 2D alla completa differenziazione, che si è dimostrata in grado di generare neuroni cerebellari funzionali, come prodotti sono positivi per gli indicatori cerebellare-collegata ed esibiscono gli afflussi del neurone-come calcio. Insieme, questi protocolli offrono gli scienziati una scelta di opzioni adatte a scopi di ricerca differenti, come pure un modello base per testare altri tipi di differenziazioni neurale semplificate.

Panoramica visiva di ridotta crescita fattore protocolli di differenziazione cerebellare 2D e 3D La figura 1 Mostra la sequenza temporale generale per i protocolli di differenziazione cerebellare 2D e 3D, identificando i fattori estrinseci e tempo di placcatura. Lo stato di avanzamento tipico per hPSCs in fase di differenziazione cerebellare 3D è raffigurato in Figura 2: con linea hESC H01 a partire come colonie nella cultura senza alimentatore al giorno 0 (parte superiore sinistra della figura); in fase di formazione di EB da giorno 2 (metà superiore); crescere in grandi aggregati di cellule con lume apparente dopo induzione neurale con RA e FGF8 al giorno 14 (alto a destra); Formazione di aggregati di varia grandezza e forma al giorno 28 (in basso a sinistra); lo sviluppo nella complessità con strutture diverse di un unico aggregato indicato al giorno 28 (metà inferiore); e ha continuato i cambiamenti morfologici per le stesse strutture al giorno 35 (basso a destra). Lo stato di avanzamento tipico per hPSCs in fase di differenziazione cerebellare 2D è raffigurato in Figura 3: con hESC linea H01 come colonie nella cultura senza alimentatore al giorno 0 (parte superiore sinistra della figura, con il cerchio che indica la zona di cellule differenziate tra le hESC colonie) ; in fase di formazione di EB da giorno 2 (metà superiore); crescere in grandi aggregati di cellule con lume apparente dopo induzione neurale con RA e FGF8 al giorno 13 (alto a destra); proliferano come cellule aderenti dopo il placcaggio al giorno 14 (in basso a sinistra); e poi come un monostrato di cellule con morfologia più complesso/maturo al giorno 35 sotto alto ingrandimento (basso a destra) e basso (metà inferiore).
Prodotti 3D presentano marcatori e strutture dei primi Neuroepithelium Figura 2 (immagine in basso a sinistra) e Figura 4 Mostra l'eterogeneità della morfologia di aggregata 3D visto in tutta la coltura, a causa di variabili di crescita e/o tassi di maturazione, come pure la fusione stocastico o spezzarsi di aggregati. Nonostante l'eterogeneità, ogni differenziazione produce aggregati espositrici marcatori precoci neurali e neuronali, compreso il marcatore di granuli cerebellari ZIC1, come indicato da immunocitochimica (ICC) colorazione nella Figura 5. Ancora più importante, nella figura 5 e Figura 6 suggeriscono che una semplice cultura 3D, con fattori di crescita ridotti, è in grado di generare aggregati con strutture complesse relazionati allo sviluppo del cervello come il neuroepithelium precoce e labbro rombico.
Prodotti 2D presentano segni cerebellari e attività neuronale funzionale Mentre 2D culture non possono riprodurre strutture 3D complesse, sono in grado di generare cellule che esibiscono marcatori precoci neurali e neuronali, tra cui indicatore delle cellule cerebellari del granello ZIC1, come indicato dalla ICC macchiatura nella Figura 7. Analisi dell'espressione genica tramite RT-PCR, come si vede nella Figura 8, supporta ICC colorazione risultati, anche se la presenza di marcatori precoci di cella granello ATOH1 è variabile tra esperimenti e linee. Formazione immagine del calcio è più facilmente gestibile nella cultura 2D. Come si vede in Figura 9, Supplemental Video 1e Video supplementare 2, cellule stimolate elettricamente mostrano gli afflussi di calcio che sono tipici di schemi di attivazione neuronale, suggerendo la generazione dei neuroni funzionali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Figura 1: Timeline di protocollo di differenziazione (a partire da giorno 0 di differenziazione). Linea continua caselle indicano quando fattori specifici vengono aggiunti al terreno di coltura, e linea tratteggiata caselle indicano piastra-rivestimento per modifica 2D opzionale. Per FGF2, la freccia in giù si riferisce a concentrazioni più basse (4 ng/mL), e la freccia si riferisce alle più alte concentrazioni (20 ng/mL). Questa figura è stata modificata da Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Figura 2: campo chiaro rappresentante immagini del protocollo 3D. hESC colonie al d0, EBs D2, aggrega dopo induzione a d14, aggregati di diverse dimensioni e morfologia (numerati 1-5) a d28, un unico aggregato con caratteristiche uniche, identificabili (indicati con lettere un–c) a d28, e cambiamenti visibili nelle stesse caratteristiche a d35. Barra della scala = 100 µm. Questa figura è stata modificata da Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Figura 3: campo chiaro rappresentante immagini del protocollo 2D. hESC colonie un d0, EBs D2, aggrega dopo induzione a d13, dopo il placcaggio aggregati a d14, dopo maturazione a d35, come si è visto a 5 x ingrandimento e 20 ingrandimenti. Il cerchio bianco nel pannello di sinistra superiore mostra l'area di cellule differenziate tra le colonie hESC. Barra della scala = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Figura 4: campo chiaro immagini di varie dimensioni e complessità a 3D cultura. Aggregati al giorno (A) 8 (hESC) e (B) d35 (hiPSCs). L'immagine di quest'ultima è composta di tre immagini separate per mostrare l'intero aggregato. Entrambi gli aggregati possono essere influenzati dalla fusione di più piccoli aggregati o perdita (rottura) delle strutture. Barra della scala = 200 µm. Questa figura è ripubblicata da Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Figura 5: ICC immagini di prodotti 3D mostrano gli indicatori pertinenti e strutture. Ai cultura d35, 3D prodotti mostrano: PAX6 (verde) e TBR2 (rosso) dal lumen di neurale rosetta-come formazione (prima fila); DCX (verde) e NeuN (rosso) diffusione da zona ventricolare del bordo esterno (VZ)-come struttura (seconda fila); KIRREL2, un indicatore connesso con neuroepithelium cerebellare (terza fila, a sinistra); e cellule ZIC1 un marcatore associato con granuli cerebellari (terza riga, destra). L'esperimento è stato condotto più volte utilizzando quattro hPSC diverse linee: linea hESC H01 (n = 5) e hvs88 linee iPSC (n = 4), hvs60 (n = 3) e hvs51 (n = 1). Frecce puntano al labbro rombico (RL)-come struttura. Barra della scala = 100 µm. Questa figura è ripubblicata da Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Figura 6: struttura del tipo di zona ventricolare su larga scala in 3D prodotto. Alla cultura d35, un aggregato hESC-derivato è positivo per PAX6 (verde) e TBR2 (rosso) comunemente associati con i primi neuroni trovati all'interno di zone ventricolare (VZs) e subventricular zone (SVZs), in vivo. (In alto) Un asterisco (*) contrassegna il lato apicale di una regione di VZ-come che corre lungo il bordo dell'aggregato, con tra parentesi che indica la profondità/divisione di VZ / SVZs. (al centro) Merged segnali mostrano sezioni sparse di PAX6 + / TBR2-cellule aumentando di dimensioni verso l'estremità destra superiore di VZ. (In basso) Immagine di ingrandimento superiore della sezione indicata da un rettangolo nel pannello centrale. Barra della scala = 100 µm. Questa figura è stata modificata da Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Figura 7: immagini di ICC di prodotti 2D mostrano gli indicatori pertinenti. Al cultura d35, esposizione di prodotti 2D, da hESCs (riga superiore) e hiPSCs (riga inferiore), celle positive per: indicatore delle cellule del granello ZIC1 e migratori neuroni cerebellari marcatore TAG1 (colonna sinistra); e il marcatore neuronale neurofilament (NF) e TAG1 (colonna destra). Barra della scala = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Figura 8: RT-PCR di prodotti 2D. analisi di espressione del mRNA della linea hESC H01 (riga superiore) e hiPSC linea hvs60 (riga inferiore) alla fine del 2D protocollo Mostra prodotti con elettroforesi del gel per: indicatore delle cellule del granello ZIC1, indicatore delle cellule del granello ATOH1, migratori neuroni cerebellari marker TAG1, Purkinje indicatore di cella calbindina (CALB), canale del calcio voltaggio-dipendenti CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), recettore di acido gamma - aminobutirrico (GABA) B 1 (G-Br1) e gene housekeeping EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Figura 9: calcio imaging/analisi dei prodotti 2D. A cultura d35, hPSC prodotti di differenziazione sono stati registrati per 2 min al microscopio, dopo incubazione con tintura di fluor5. 30 s, le cellule sono state stimolate elettricamente per 10 s a 10 Hz. (A) immagini fisse Visualizza hESCs a 0 s (a sinistra) e dopo l'inizio della stimolazione elettrica a 30 s (a destra). Le frecce indicano la regione di interesse (ROI) per l'analisi di afflusso del calcio. Risultati analisi grafica (B) cambiamento di fluorescenza relativa rispetto al tempo per ROI (cambiare in fluorescenza = (F-F0) / f0, dove F0 = (∑F1-n) / n), con picchi di neurone-come che si verificano prima, durante e dopo stimolazione. Barra nera indica la lunghezza della stimolazione elettrica. Scala bar (bianco) = 50 µm. completo di registrazione per hESC (come si vede qui) e una linea di hiPSC (non illustrato) sono disponibili nei supplementari Video 1 e Video supplementari 2, rispettivamente. Le registrazioni sono in formato AVI, alla velocità di 4x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Supplementare Video 1: calcio imaging video del prodotto 2D da hESC linea H01. A cultura d35, tingono i prodotti di differenziazione dalla riga hESC H01 sono stati registrati per 2 min al microscopio, dopo incubazione con fluor5. 30 s, le cellule sono state stimolate elettricamente per 10 s a 10 Hz. le registrazioni sono state fatte a 2 fotogrammi/s e trasformati in AVI video a ~ 7 fps, producendo un video durata ~ 30 s, alla velocità di ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Supplementare Video 2: calcio imaging video del prodotto 2D da hiPSC linea hvs51. A cultura d35, prodotti di differenziazione da hiPSC linea hvs51 sono stati registrati per 2 min al microscopio, dopo incubazione con tintura di fluor5. 30 s, le cellule sono state stimolate elettricamente per 10 s a 10 Hz. le registrazioni sono state fatte a 2 fotogrammi/s e trasformati in AVI video a ~ 7 fps, producendo un video durata ~ 30 s, alla velocità di ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Descriviamo un mezzo di protocollo per hPSCs, utilizzando definito di differenziazione 3D semplificato e ridotto di fattori di crescita, in grado di generare aggregati cellulari con prime neuroepithelial strutture e positive per marcatori cerebellare-collegata, come pure un optional Modifica 2D per differenziazione delle cellule come un monostrato per generare neuroni funzionali.

Protocollo di differenziazione cerebellare 3D semplificata con modifica 2D opzionale

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

L'obiettivo generale di queste colture di differenziazione è quello di generare linee cellulari cerebellari in ambienti 2D o 3D. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande di base riguardanti i nuovi sviluppi o i meccanismi patologici alla base dei disturbi cerebrali infantili utilizzando cellule staminali derivate da pazienti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha un avvio e una manutenzione semplici con pochi fattori e che può essere utilizzata come base per testare protocolli neurali più complessi. A dimostrare la procedura sarà Lisa, un tecnico del mio laboratorio. Per impostare la differenziazione con il metodo modificato, il metodo G di passaggio delle hPSC, trasferire il volume richiesto di terreno di mantenimento neurale in una provetta sterile e integrare con FGF2 da 4 nanogrammi per millilitro e dieci inibitori micromolari della roccia. Quindi, mantenere il tubo medio a temperatura ambiente o a bagnomaria a 37

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