Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'RNA, ad esempio qual è il significato biologico di RdRP o TERT nelle cellule umane? Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo test si è affermato come il primo metodo sensibile per rilevare l'attività umana di RdRP espressa nelle cellule. Iniziare questa procedura con la preparazione delle cellule HeLa come descritto nel protocollo di testo.

Lavare le celle una volta con 10 millilitri di PBS. Quindi, centrifugare il campione a 1.450 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Utilizzare un millilitro di tampone di lisi A ghiacciato per 10 milioni di cellule per lisare le cellule mediante pipettaggio delicato.

Sonicare il campione in un tubo da 1,5 millilitri con un'amplificazione del sonicatore del 25% per 10 secondi. Dopo la sonicazione, centrifugare il campione a 20, 400 volte la gravità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante e trasferire un millilitro ciascuno di surnatante in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Pre-cleared il lisato aggiungendo 40 microlitri di perle di proteina A-agarosio prelavate per un millilitro di lisato. Mescolate bene capovolgendo più volte il tubo. Quindi, ruotare il campione per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Centrifugare il campione a 13.000 volte la gravità per un minuto a quattro gradi Celsius e recuperare il surnatante. Successivamente, aggiungi 40 microlitri di perle di proteina A-agarosio prelavate e 10 microgrammi di anticorpi TERT anti-umani nel lisato pre-eliminato. Mescolare bene capovolgendo più volte la provetta e ruotare il campione a quattro gradi Celsius durante la notte.

Dopo la centrifugazione a 3, 300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante. Quindi, lavare le perline con Wash Buffer One. Aggiungere un millilitro di Wash Buffer One alle perline e mescolare bene capovolgendo il tubo.

Quindi, ruotare il campione per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare il campione a 3.300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e ripetere questo passaggio altre tre volte.

Dopo il lavaggio della soluzione AGC come descritto nel protocollo di testo, trattare le perle con nucleasi micrococcica risospendendole in 60 microlitri della miscela di reazione nucleasi micrococcica mediante pipettaggio delicato. Quindi, agitare delicatamente il campione su una piattaforma girevole di un agitatore posizionato in un'incubatrice di tipo Peltier per 15 minuti a 25 gradi Celsius. Dopo aver centrifugato il campione a 3.300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante.

Infine, lavare le perle due volte con una soluzione AGC contenente tre millimolari di EGTA e lavare le perle una volta con il Wash Buffer Two come descritto nel protocollo di testo. Preparare la miscela di reazione RdRP in una nuova provetta come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere sei microlitri di uridina trifosfato marcato sul gruppo alfa fosfato con P dash 32 alla miscela di reazione e mescolare bene mediante pipettaggio.

Quindi, aggiungi un microlitro di RNA stampo alla miscela e mescola bene. Risospendere le perle con 20 microlitri della miscela di reazione RdRP risultante. Quindi, agitare delicatamente il campione su una piattaforma girevole di un agitatore posizionato in un'incubatrice di tipo Peltier per due ore a 32 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, aggiungere 5,4 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K e 45,4 microlitri di tampone 2X Proteinasi K alla miscela di reazione. Miscelare pipettando e agitare il campione in un'incubatrice di tipo Peltier per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver aggiunto 109,2 microlitri di acqua priva di RNasi al campione, aggiungere 200 microlitri di fenolo-cloroformio acido.

Mescolare bene a vortice prima di centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Ripetere questo passaggio una volta.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di acetato di sodio a tre molari, pH 5,2, quattro microlitri di vettore di precipitazione e 250 microlitri di etanolo alla fase acquosa. Agitare bene il tubo per mescolare. Centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.

Successivamente, lavare il pellet con 300 microlitri di etanolo freddo al 70% in volume conservato a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e asciugare il pellet all'aria.

Risospendere il pellet in 20 microlitri di acqua priva di RNasi. Preparare la miscela di reazione RNasi in una nuova provetta come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 180 microlitri della miscela di reazione RNasi al campione.

Quindi, incubare la provetta per due ore a 37 gradi Celsius. Aggiungere 2,3 microlitri di SDS al 10% di volume per volume al campione e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere due microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K al campione e incubare per altri 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Ora, aggiungere 205 microlitri di fenolo-cloroformio acido al campione. Dopo la miscelazione e la centrifugazione come prima, trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Aggiungere tre molari di acetato di sodio, vettore di precipitazione ed etanolo alla fase acquosa, quindi miscelare, centrifugare e lavare il pellet come eseguito in precedenza.

Di seguito sono riportati tre risultati rappresentativi del test IP-RdRP in cellule HeLa trattate con nocodazolo o DMSO per cellule non manipolate. Come modello è stato utilizzato un RNA a 34 nucleotidi sintetizzato chimicamente. Dopo l'esposizione notturna, i prodotti RdRP possono essere visti tra i 20 e i 30 nucleotidi, in particolare nelle cellule HeLa all'interno della fase mitotica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare l'attività RdRP del TERT umano.