Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase
June 12th, 2018
Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) sintetizza non solo DNA telomerico, ma anche RNA double-stranded attraverso attività RNA polimerasi RNA-dipendente. Qui, descriviamo un neocostituita dosaggio per rilevare attività RNA polimerasi RNA-dipendente di TERT endogeno.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'RNA, ad esempio qual è il significato biologico di RdRP o TERT nelle cellule umane? Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo test si è affermato come il primo metodo sensibile per rilevare l'attività umana di RdRP espressa nelle cellule. Iniziare questa procedura con la preparazione delle cellule HeLa come descritto nel protocollo di testo.
Lavare le celle una volta con 10 millilitri di PBS. Quindi, centrifugare il campione a 1.450 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Utilizzare un millilitro di tampone di lisi A ghiacciato per 10 milioni di cellule per lisare le cellule mediante pipettaggio delicato.
Sonicare il campione in un tubo da 1,5 millilitri con un'amplificazione del sonicatore del 25% per 10 secondi. Dopo la sonicazione, centrifugare il campione a 20, 400 volte la gravità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante e trasferire un millilitro ciascuno di surnatante in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Pre-cleared il lisato aggiungendo 40 microlitri di perle di proteina A-agarosio prelavate per un millilitro di lisato. Mescolate bene capovolgendo più volte il tubo. Quindi, ruotare il campione per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Centrifugare il campione a 13.000 volte la gravità per un minuto a quattro gradi Celsius e recuperare il surnatante. Successivamente, aggiungi 40 microlitri di perle di proteina A-agarosio prelavate e 10 microgrammi di anticorpi TERT anti-umani nel lisato pre-eliminato. Mescolare bene capovolgendo più volte la provetta e ruotare il campione a quattro gradi Celsius durante la notte.
Dopo la centrifugazione a 3, 300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante. Quindi, lavare le perline con Wash Buffer One. Aggiungere un millilitro di Wash Buffer One alle perline e mescolare bene capovolgendo il tubo.
Quindi, ruotare il campione per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare il campione a 3.300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e ripetere questo passaggio altre tre volte.
Dopo il lavaggio della soluzione AGC come descritto nel protocollo di testo, trattare le perle con nucleasi micrococcica risospendendole in 60 microlitri della miscela di reazione nucleasi micrococcica mediante pipettaggio delicato. Quindi, agitare delicatamente il campione su una piattaforma girevole di un agitatore posizionato in un'incubatrice di tipo Peltier per 15 minuti a 25 gradi Celsius. Dopo aver centrifugato il campione a 3.300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante.
Infine, lavare le perle due volte con una soluzione AGC contenente tre millimolari di EGTA e lavare le perle una volta con il Wash Buffer Two come descritto nel protocollo di testo. Preparare la miscela di reazione RdRP in una nuova provetta come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere sei microlitri di uridina trifosfato marcato sul gruppo alfa fosfato con P dash 32 alla miscela di reazione e mescolare bene mediante pipettaggio.
Quindi, aggiungi un microlitro di RNA stampo alla miscela e mescola bene. Risospendere le perle con 20 microlitri della miscela di reazione RdRP risultante. Quindi, agitare delicatamente il campione su una piattaforma girevole di un agitatore posizionato in un'incubatrice di tipo Peltier per due ore a 32 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, aggiungere 5,4 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K e 45,4 microlitri di tampone 2X Proteinasi K alla miscela di reazione. Miscelare pipettando e agitare il campione in un'incubatrice di tipo Peltier per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver aggiunto 109,2 microlitri di acqua priva di RNasi al campione, aggiungere 200 microlitri di fenolo-cloroformio acido.
Mescolare bene a vortice prima di centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Ripetere questo passaggio una volta.
Quindi, aggiungere 20 microlitri di acetato di sodio a tre molari, pH 5,2, quattro microlitri di vettore di precipitazione e 250 microlitri di etanolo alla fase acquosa. Agitare bene il tubo per mescolare. Centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.
Successivamente, lavare il pellet con 300 microlitri di etanolo freddo al 70% in volume conservato a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e asciugare il pellet all'aria.
Risospendere il pellet in 20 microlitri di acqua priva di RNasi. Preparare la miscela di reazione RNasi in una nuova provetta come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 180 microlitri della miscela di reazione RNasi al campione.
Quindi, incubare la provetta per due ore a 37 gradi Celsius. Aggiungere 2,3 microlitri di SDS al 10% di volume per volume al campione e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere due microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K al campione e incubare per altri 15 minuti a 37 gradi Celsius.
Ora, aggiungere 205 microlitri di fenolo-cloroformio acido al campione. Dopo la miscelazione e la centrifugazione come prima, trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Aggiungere tre molari di acetato di sodio, vettore di precipitazione ed etanolo alla fase acquosa, quindi miscelare, centrifugare e lavare il pellet come eseguito in precedenza.
Di seguito sono riportati tre risultati rappresentativi del test IP-RdRP in cellule HeLa trattate con nocodazolo o DMSO per cellule non manipolate. Come modello è stato utilizzato un RNA a 34 nucleotidi sintetizzato chimicamente. Dopo l'esposizione notturna, i prodotti RdRP possono essere visti tra i 20 e i 30 nucleotidi, in particolare nelle cellule HeLa all'interno della fase mitotica.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare l'attività RdRP del TERT umano.
Panoramica
Questo studio presenta un nuovo saggio per rilevare l'attività della polimerasi RNA-dipendente (RdRP) della telomerasi inversa umana endogeno (TERT). Il metodo è significativo per comprendere il ruolo biologico di RdRP e TERT nelle cellule umane.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
Sfondo
- TERT sintetizza il DNA telomerico e mostra attività RdRP.
- Comprendere il ruolo di RdRP è cruciale nella biologia dell'RNA.
- Questo saggio è il primo metodo sensibile per rilevare l'attività umana RdRP.
- Le cellule HeLa sono utilizzate per la procedura sperimentale.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un saggio sensibile per rilevare l'attività RdRP nelle cellule umane.
- Esplorare il significato biologico di TERT e RdRP.
- Fornire un metodo affidabile per la futura ricerca nella biologia dell'RNA.
Metodi utilizzati
- Preparazione delle cellule HeLa e lisi usando il Buffer di lisi A.
- Pre-chiarificazione del lisato con perle di Proteina A-agarosa.
- Immunoprecipitazione usando l'anticorpo anti-TERT umano.
- Rilevazione dell'attività RdRP attraverso una serie di reazioni enzimatiche e lavaggi.
Risultati principali
- Rilevazione riuscita dei prodotti RdRP nelle cellule HeLa.
- I risultati indicano l'attività RdRP durante la fase mitotica.
- Il saggio dimostra specificità per l'attività RdRP mediata da TERT.
- Il metodo fornisce informazioni sul ruolo di TERT nella biologia dell'RNA.
Conclusioni
- Il saggio è uno strumento prezioso per studiare l'attività RdRP nelle cellule umane.
- I risultati migliorano la comprensione delle funzioni di TERT oltre al mantenimento dei telomeri.
- Studi futuri possono sfruttare questo metodo per esplorare ulteriormente la biologia dell'RNA.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This assay enables detection of RNA-dependent RNA polymerase activity in human TERT, providing mechanistic insight into non-canonical enzymatic functions relevant to RNA biology and cancer research. It supports target validation by clarifying TERT's role beyond telomere maintenance, aiding in the de-risking of therapeutic hypotheses involving RNA silencing pathways. The method offers a sensitive, cell-based approach to evaluate TERT-mediated RdRP activity, informing early discovery decisions in oncology and RNA-targeted therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates TERT's RNA-dependent RNA polymerase activity to clarify its biological significance in human cells.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking TERT to RNA silencing mechanisms in cancer contexts.
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by providing direct evidence of non-canonical enzymatic function for hypothesis-driven target assessment.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Establishes a sensitive, reproducible method for detecting endogenous RdRP activity in cell lysates.
- Operational Value: Enables standardized immunoprecipitation-based workflows for consistent RdRP product detection.
- Operational Value: Facilitates quantitative analysis via radiolabeled nucleotide incorporation and gel electrophoresis for activity measurement.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects TERT's RdRP activity to mitotic phase-specific function in HeLa cells, supporting disease-relevant system modeling.
- Translational Value: Provides a mechanistic bridge between telomere maintenance and RNA biology in cancer phenotypes.
- Translational Value: Supports risk-adjusted advancement by clarifying TERT's multifunctional role in cellular pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target de-risking and mechanistic insight are prioritized before assay development or screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of TERT's non-canonical functions in RNA silencing and regulatory networks.
- Analytics: Generates quantitative RdRP product readouts via autoradiography to compare activity across conditions or treatments.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable immunoprecipitation-activity assay platform adaptable to other RNA-modifying enzymes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining TERT's RNA polymerase activity independent of telomere synthesis.
- Operational Value: Delivers a standardized, sensitive protocol for detecting low-abundance RdRP activity in cellular systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying target multifunctionality and potential off-target RNA effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of TERT-targeting strategies based on RNA-mediated mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, radioactive nucleotide handling, and nucleic acid electrophoresis.
- Dependent on access to scintillation detection, phosphorimaging, or autoradiography equipment for product visualization.
- Necessitates RNase-free environments and controlled incubation conditions to preserve RNA integrity and enzyme activity.
- Involves optimization considerations for antibody specificity, bead blocking, and template RNA design across cell types.
- Limited by the need for radioactive labeling, which may require radiation safety protocols and waste management procedures.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Immunoprecipitation (IP)-RdRP Assay: Preparation of Cell Lysate
1:34
IP-RdRP Assay: Immunoprecipitation
3:54
IP-RdRP Assay: RdRP Reaction
6:19
IP-RdRP Assay: RNase Treatment
7:38
Results: RdRP Products of Endogenous TERT in Mitotic HeLa Cells
8:10
Conclusion
