Name: Rilevamento semi-quantitativa dellattività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri come rilevare l'attività RdRP della TERT umana nelle cellule HeLa con questo saggio immunoprecipitazione. Questo metodo sensibile permette di studiare il ruolo biologico della TERT nella biologia dell'RNA.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal progetto per lo sviluppo di ricerche Innovative sulle terapeutica del cancro (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) e il progetto per la ricerca sul cancro e l'evoluzione terapeutica (P-creare) (16cm 01061150001, K.M.) dal Giappone Agenzia per la ricerca medica e sviluppo, AMED; la Fondazione di scienza di Takeda (Y.M.); Concessione della principessa Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); e pagine JSP KAKENHI Grant numero JP16K07133 (Y.M.).

1. reagente Setup
<ol><li>
Reagenti utilizzati per la sincronizzazione delle cellule
	<ol>
<li>Per generare medio dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) contenente timidina 2,5 mM, sciogliere 30,28 mg di timidina per 1 mL di acqua di grado di coltura del tessuto per preparare timidina 125 mM. Filtrare la soluzione con un'unità di filtro di 0,22 μm siringa. Aggiungere 1 mL di timidina preparata 125 mM per 50 mL di DMEM completati con 10% (vol/vol) siero bovino fetale (FBS).</li>
		<li>Per generare DMEM contenente 0,1 μg/mL di nocodazole, sciogliere nocodazole in dimetilsolfossido (DMSO) per preparare 5 μg/μL nocodazole. Aggiungere 1 µ l di 5 µ g / µ l nocodazole per 50 mL di DMEM supplementato con 10% FBS (vol/vol).</li>
		<li>Per generare DMEM contenente 0,002% (vol/vol) di DMSO, aggiungere 1 µ l di DMSO per 50 mL di DMEM supplementato con 10% FBS (vol/vol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagenti utilizzati per l'analisi di IP-RdRP
	<ol>
<li>Preparare il lysis buffer a: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) e 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 5 x tampone acetato: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acido (HEPES)-KOH (pH 7,8), acetato di potassio di 500 mM e 20 mM MgCl2. Conservare il reagente a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare il tampone di lavaggio tampone 1: 1 x acetato, glicerolo al 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) Triton x X-100 e 0.06 inibitore della proteasi cocktail, acido ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-gratuito. Preparare il tampone di lavaggio 1 giorno di utilizzo o il giorno prima dell'uso. Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare la soluzione AGC: 1x tampone acetato, 10% (vol/vol) glicerolo e 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS). Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Per generare la soluzione AGC contenente 2 mM CaCl2, aggiungere 100 µ l di 1 M CaCl2 per 50 mL di soluzione AGC. Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Per generare la soluzione AGC contenente 3 mM etilene glicole a (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA), µ l 375 di 0,4 M EGTA (pH 7,5) per 50 mL di soluzione AGC. Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare il tampone di lavaggio tampone 2: 1 x acetato e CHAPS 0,02% (wt/vol). Conservare il reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare soluzione HMD: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 e 2 mM dithiothreitol (DTT). Conservare il reagente a-20 ° C. Nota: La soluzione HMD dovrebbe essere rinnovato almeno in tre mesi.</li>
		<li>Preparare 2 x buffer di proteinasi K: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA e 1% (wt/vol) sodio dodecil solfato (SDS). Conservare il reagente a-20 ° C.</li>
		<li>Preparare 2 x buffer di caricamento: formammide 95% (vol/vol), 20 mM EDTA e 1% (wt/vol) arancio G. conservare il reagente a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione delle cellule HeLa
Nota: Preparare cellule HeLa sincronizzate in fase mitotica (manipolato) o dividendo in modo asincrono (unmanipulated). Cultura delle cellule in presenza di 5% CO2 a 37 ° C.
<ol><li>
Sincronizzazione delle cellule HeLa in mitosi
	<ol>
<li>Piastra di 1 x 106 delle cellule HeLa con 10 mL di DMEM supplementato con 10% FBS in una piastra di coltura di 10cm (vol/vol).</li>
		<li>Due giorni dopo il placcaggio, sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM contenente timidina 2,5 mM e 10% FBS (vol/vol). Coltura delle cellule per 24 h.</li>
		<li>Lavare le cellule tre volte con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) (-) e la cultura delle cellule con 10 mL di DMEM contenente 10% (vol/vol) FBS per 6 h.</li>
		<li>Sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM contenente 0,1 µ g/mL di nocodazole e 10% (vol/vol) FBS e cultura le cellule per 14 h.</li>
		<li>Agitare delicatamente la piastra di coltura e recuperare il surnatante contenente le cellule mitotiche indipendente. Contare il numero di cellulare per il dosaggio di IP-RdRP.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 490 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Nota: Il pellet cellulare possa essere conservato a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle cellule HeLa unmanipulated
	<ol>
<li>Piastra di 1 x 106 delle cellule HeLa con 10 mL di DMEM supplementato con 10% FBS in una piastra di coltura di 10cm (vol/vol).</li>
		<li>Due giorni dopo il placcaggio, sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM contenente 10% FBS (vol/vol). Coltura delle cellule per 30 h.</li>
		<li>Sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM contenente 0,002% (vol/vol) DMSO e 10% (vol/vol) FBS e cultura le cellule per 14 h.</li>
		<li>Raccogliere le cellule di trypsinization utilizzando 0,7 mL di tripsina (2,5 g/L) contenente EDTA da 1 millimetro. Contare il numero di cellulare per il dosaggio di IP-RdRP.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 490 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Nota: Il pellet cellulare possa essere conservato a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-RdRP Assay
<ol><li>Preparazione della proteina A-agarosio perlina
	<ol>
<li>Trasferire 1 mL (letto volume 500 µ l) di resina di affinità in una microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 800 µ l di tampone di lisi ai talloni e mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte. Centrifugare a 800 x g per 3 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte (totale tre lavaggi).</li>
		<li>Aggiungere 800 µ l di tampone di lisi ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte. Ruotare il tubo durante la notte (o per almeno 4 ore) a 4 ° C in un agitatore rotativo.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 800 x g per 3 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi ai talloni e mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte. Memorizzare le perline a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del lysate delle cellule
	<ol>
<li>(Opzionale) Se le celle sono bloccate nel passaggio 2, posizionare e scongelare le cellule congelate su ghiaccio fino a quando le cellule si allentano.</li>
		<li>Lavare le cellule una volta con 10 mL di PBS (-). Centrifugare il campione a 1.450 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
		<li>Lisare le cellule con buffer di lisi ghiacciata (un 1 mL di tampone di lisi A 1 x 107 delle cellule) pipettando delicato.</li>
		<li>Sottoporre ad ultrasuoni il campione in una provetta da 1,5 mL con seguenti condizioni; impostare l'amplificazione del sonicatore al 25% e trattare con ultrasuoni per 10 s.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 20.400 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante. Trasferire 1 mL ciascuno del surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Attenzione: Eseguire tutte le procedure in condizioni di RNAsi-libera.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitazione
	<ol>
<li>Pre-deselezionare il lisato dal punto 3.2.6 aggiungendo 40 µ l (tallone volume 20 µ l) di perline A-agarosio proteina lavata per 1 mL di lisato. Mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte e ruotare il campione per 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 13.000 x g per 1 min a 4 ° C e recuperare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 40 µ l (letto 20 µ l) di proteina lavata A-agarosio perline e 10 µ g di anticorpo anti-umano TERT (clone: 10E9-2)8 in pre-sgomberati lisato. Mescolare bene capovolgendo la provetta diverse volte e ruotare il campione a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Lavare le perle con tampone di lavaggio 1: aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio 1 ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta e ruotare il campione per 5 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio altre tre volte.</li>
		<li>Lavare le perle di una volta con soluzione AGC contenente 2 mM CaCl2: aggiungere 1 mL di soluzione AGC contenente 2 mM CaCl2 ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta e ruotare il campione per 5 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Trattare le perline con nucleasi di Micrococcal (MNase): preparare la miscela di reazione MNase descritta nella tabella 1. Risospendere le sfere in 60 µ l della miscela di reazione MNase pipettando delicato. Agitare il campione delicatamente (20-25 giri/min) su una piattaforma girevole di un agitatore per impostare in un'incubatrice di Peltier-tipo per 15 min a 25 ° C. Nota: È molto importante utilizzare un agitatore ondulato e seguire rigorosamente il limite di velocità in questo passaggio. Altro tipo di Scuotipaglia, quali mixer rotante, non sono raccomandati.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Lavare le perle due volte con soluzione AGC contenente 3 mM EGTA: aggiungere 1 mL di soluzione AGC contenente 3 mM EGTA ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta e ruotare il campione per 5 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.</li>
		<li>Lavare le perle una volta con tampone di lavaggio 2: aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio 2ai talloni, mescolare bene capovolgendo la provetta e ruotare il campione per 5 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 3.300 x g per 0,5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Mantenere le perline sul ghiaccio durante l'impostazione RdRP reazione. Attenzione: Eseguire tutte le procedure in condizioni di RNAsi-libera.</li>
	</ol></li>
	<li>RdRP reazione
	<ol>
<li>Preparare una miscela di reazione RdRP in un nuovo tubo come descritto nella tabella 2.</li>
		<li>6 µ l di [α -32P] UTP (3.000 IC/mmol) per la miscela e mescolare bene di pipettaggio. Nota: ATP [α -32P], [α -32P] CTP o GTP [α -32P] può essere utilizzato per la reazione anziché [α -32P] UTP.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l di modello RNA (1 µ g / µ l) per la miscela e mescolare bene di pipettaggio. Nota: Per stabilire il dosaggio RdRP, è consigliato il seguente modello di RNA: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Risospendere le perline con 20 µ l di miscela di reazione RdRP dal punto 3.4.3 pipettando.</li>
		<li>Agitare il campione delicatamente (20-25 giri/min) su una piattaforma girevole di un agitatore per impostare in un'incubatrice di peltier-tipo per 2 h a 32 ° C.</li>
		<li>Aggiungere la miscela di reazione 5,4 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) e 45,4 µ l di tampone di proteinasi K x 2. Mescolare pipettando e agitare (20-25 giri) il campione su un giradischi impostato in un'incubatrice di Peltier-tipo per 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 109,2 µ l di acqua RNAsi-libera al campione.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di acido fenolo-cloroformio nell'esempio. Mescolare bene dal vortice e poi Centrifugare il campione a 21.100 x g per 5 min a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo. Ripetere questo passaggio una volta.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di acetato di sodio 3 M (pH = 5.2), 4 µ l di vettore di precipitazione e 250 µ l di etanolo alla fase acquosa. Agitare il tubo bene per miscelazione, poi Centrifugare il campione a 21.100 x g per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Lavare la pallina con 300 µ l di etanolo freddo (vol/vol) di 70% conservato a-20 ° C. Centrifugare il campione a 21.100 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e asciugare il pellet. Attenzione: Eseguire tutte le procedure in condizioni di RNAsi-libera. Nota: Il pellet dal passaggio 3.4.11 può essere memorizzato a-20 ° C per almeno 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento di RNAsi
	<ol>
<li>Risospendere il pellet da passo 3.4.11 in 20 µ l di acqua RNAsi-libera.</li>
		<li>Preparare una miscela di reazione di RNAsi in un nuovo tubo come descritto nella tabella 3.</li>
		<li>Aggiungere 180 µ l della miscela di reazione RNasi al campione e incubare la provetta per 2 ore a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 2,3 µ l di 10% (vol/vol) SDS al campione e incubare per 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) al campione e incubare per 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 205 µ l di acido fenolo-cloroformio nell'esempio. Mix ben Vortex, poi Centrifugare il campione a 21.100 x g per 5 min a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di acetato di sodio 3 M (pH 5.2), 4 µ l di vettore di precipitazione e 250 µ l di etanolo alla fase acquosa. Agitare il tubo bene per miscelazione, poi Centrifugare il campione a 21.100 x g per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Lavare la pallina con 300 µ l di etanolo freddo (vol/vol) di 70% conservato a-20 ° C. Centrifugare il campione a 21.100 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e asciugare il pellet. Nota: Il pellet dal punto 3.5.9 può essere memorizzato a-20 ° C per almeno 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Autoradiografia e l'elettroforesi del gel
	<ol>
<li>Risospendere il campione con 20 µ l di acqua RNAsi-libera.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di 2x buffer di caricamento.</li>
		<li>Bollire il campione per 10 min a 95 ° C. Schiacciare il campione sul ghiaccio.</li>
		<li>Esegua il gel. Nel caso in cui la dimensione del modello è 34 nts (Vedi anche punto 3.4.3), gel di poliacrilammide 7 M Urea - 10% viene utilizzato per denaturare elettroforesi del gel.</li>
		<li>Asciugare il gel con un gel asciuga.</li>
		<li>Esporre la pellicola direttamente sul gel di secchi all'interno di una cassetta radiografica con uno schermo d'intensificazione a-80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
<li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li>
<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li>
<li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).</li>
<li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+the+nucleus%3A+roles+for+small+RNAs+in+transcription%2C+epigenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li>
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<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li>
<li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li>
<li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li>
<li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il dosaggio di IP-RdRP è un metodo sensibile per rilevare attività RdRP di TERT umano. Proteina TERT è altamente espressa in cellule HeLa mitotiche, in cui TERT forma il RdRP complesso8,9,10. Ciò suggerisce che mitotiche cellule HeLa sono un materiale ottimo per rilevare attività RdRP. Nel protocollo descritto in precedenza, mitotiche e non sincronizzate le cellule HeLa sono incluse come un positivo e un esempio negativo, rispettivamente. Come mostrato in Figura 1A, RdRP dosaggio prodotti dal modello consigliato RNA in cellule HeLa mitotic Visualizza ampi segnali radioattivi tra 20 a 30 nt. Oltre alle cellule HeLa, abbiamo effettuato il test con diversi tipi di linee cellulari e trovato che il pattern di segnale può essere cambiato in cellulari diversi tipi9: alcuni mostrano un forte segnale solo circa 30 nt, alcuni mostrano un modello simile con cellule HeLa. Abbiamo anche avere eseguito l'analisi con modelli di RNA diversi da 34 nt modello8, breve e lungo (~ 300 nt) RNA con varie sequenze e con successo RdRP prodotti ottenuti da tali modelli anche se ci può essere qualche preferenza. Per la prima prova, tuttavia, si consiglia di utilizzare cellule HeLa in fase mitotica e il modello nt RNA 34. RdRPs può generare RNA double-stranded in un primer-dipendente e in un modo primer-independent11. Abbiamo segnalato che TERT conserva questa proprietà come umano RdRP7,9; TERT sintetizza dsRNA da un modello di RNA con 3'-foldback struttura attraverso un meccanismo di back-adescamento7. Per il modello nt RNA 34, TERT sintetizza fili complementari senza l'utilizzo di primer9. Per rilevare in modo specifico RdRP prodotti sintetizzati in modo indipendente dal primer, cioè de novo sintetizzato RNA prodotti, [α -32P] NTP può essere sostituito con [γ -32P] NTP nel RdRP reazione9.
MNase trattamento di immunocomplessi TERT su perline è un passaggio fondamentale per ottenere i risultati desiderati. Se il trattamento di MNase viene eseguito troppo a lungo o con intensa agitazione, si ridurrebbero notevolmente i prodotti RdRP. Per evitare tali problemi, si consiglia di seguire rigorosamente il protocollo attentamente. Soluzione HMD è un altro fattore critico per il successo. Se trovate che i segnali sono molto deboli, sostituire la soluzione HMD a uno appena preparato.
In tutto il protocollo, uno dovrebbe prendere molta cura per evitare la contaminazione RNasi. Ribonucleasi trattamento dovrebbero essere realizzate con apparecchiature dedicate. Dopo la manipolazione la ribonucleasi, uno dovrebbe eliminare i puntali e tubi con RNAsi immediatamente, eliminano RNasi con soluzioni specializzate (ad es. RNasi tranquilla) e cambiare groves.
TERT interagisce con non solo TERC ma anche molti tipi di RNA endogeni, e abbiamo segnalato parte di loro7. Modifica nell'analisi della IP-RdRP, ad esempio, il saggio di IP-RdRP senza trattamento MNase, fornirà la lista completa di modelli di RNA endogeni per RdRP TERT-collegata attività e bioinformatica guida sulle loro caratteristiche di sequenza. Abbiamo applicato con successo questo protocollo al tessuto lisato. Perché TERT è espresso in una varietà di tessuti normali e tumorali, questo test potrebbe essere utile per studiare la funzione enzimatica non canonico di TERT in essere umano.

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) è ben nota come la subunità catalitica della telomerasi e allunga del telomero utilizzando il componente di RNA telomerasi (TERC), il RNA specifico modello1. Anche se TERT polimerizza DNA telomerico come componente della telomerasi, le analisi strutturali e filogenetiche indicano che TERT è strettamente correlata con virale polimerasi RNA-dipendente del RNA (RdRPs), nonché della trascrittasi inversa virale e condivide i domini con queste polimerasi2,3,4. RdRP è l'enzima che genera il filamento di RNA complementare a un modello di RNA. L'enzima è codificato non solo virus, ma anche in organismi di modello, come pianta, lievito e vite senza fine, e la sintesi del RNA double-stranded da RdRP contribuisce al silenziamento genico post-trascrizionale e post-trascrizionali in questi organismi5,6 . Anche se RdRP umano era scomparso da molto tempo, abbiamo trovato RdRP attività in TERT umano nel 20097.
Abbiamo in primo luogo confermato RdRP attività di TERT con proteina ricombinante7, poi stabilito un dosaggio sensibile in vitro per rilevare attività RdRP di endogeno TERT8. Qui, dimostriamo in vitro RdRP test (IP-RdRP assay) per TERT endogeno. Questo metodo inizia con immunoprecipitazione (IP) di TERT endogeno e viene seguito da in vitro RdRP reazione, in cui ribonucleotidi radioattivi sono incorporati nei filamenti di RNA nascente.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina soluzione mista</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido tripsina-etilendiamenetetraacetico (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Timidina</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amnometano</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Acido</td> <td>cloridriconacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Idrossietil)-1-piperazinil]acido etansolfonico (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potassio acetato</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2&bull; 6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene(10) ottilfenil etere (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2&bull; 2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nucleasi (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico bis (b-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM ciascuno</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-32P]UTP (3.000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Utilizzare RI fresco per il test</td></tr><tr><td>inibitore della RNasi</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Acido-Fenolo:Cloroformio, pH 4,5 ( con IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato di sodio</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (99,5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonucleasi</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamide,</td><td>nacalai</td> deionizzata tesque <td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico Sale disodico diidrato (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a CO2</td><td>ad es., ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>ad es., TOMY</td><td>EX-135</td><td>Per la fase B)</td></tr> <tr><td>Micro centrifuga refrigerata</td><td>, ad es. KUBOTA</td><td>3740</td><td>Per la fase 6.2</td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Impostare una micropunta (#4422) sul sonicatore, per la fase 6.4</td></tr><tr><td>Micro centrifuga refrigerata</td><td>, ad es. TOMY</td><td>MX-305</td><td>Per la fase 6.5</td></tr><tr><td>Incubatore raffreddato</td><td>, ad es. Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Impostare un agitatore rotante all'interno</td></tr><tr><td>Agitatore rotante</td><td>, ad es. TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore raffreddato&nbsp;</td><td>ad esempio, TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Imposta uno shaker " MINI ONDA" interno, per il passaggio 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>Un agitatore per i passaggi 7.7, 8.5 e 8.6</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>, ad es. TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Impostare un agitatore " MINI ONDA" all'interno, per incubatrice a blocchi Step 8.5 e 8.6</td></tr>, <tr><td></td><td>ad es. ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento semi-quantitativa dell'attività della rna polimerasi rna-dipendente della proteina di human telomerase reverse transcriptase

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) è la subunità catalitica della telomerasi e allunga telomeri attraverso attività DNA polimerasi RNA-dipendente. Anche se TERT viene definita come una trascrittasi inversa, analisi strutturale e filogenetiche del TERT dimostrano che TERT è un membro della polimerasi di mano destra e riguarda virale polimerasi RNA-dipendente del RNA (RdRPs) come pure della trascrittasi inversa virale. In primo luogo abbiamo identificato RdRP attività di TERT umana che genera RNA complementare stand a un modello di RNA non codificanti e contribuisce al RNA silencing in cellule tumorali. Per analizzare questa attività enzimatica non canonico, abbiamo sviluppato RdRP test con TERT ricombinante nel 2009, da allora in poi stabilito in vitro RdRP dosaggio per TERT endogeno. In questo manoscritto, descriviamo il metodo quest'ultimo. Brevemente, TERT complessi immuni sono isolati dalle cellule e incubati con modello RNA e rNTPs compresi rNTP radioattivo per RdRP reazione. Per eliminare singoli filamenti di RNA, prodotti di reazione sono trattati con RNAsi ho e i prodotti finali sono analizzati con elettroforesi su gel di poliacrilammide. Radiomarcato RdRP prodotti possono essere rilevati mediante autoradiografia dopo l'esposizione durante la notte.

Con il modello consigliato di RNA radioattivo RdRP prodotti sono osservati tra 20-30 nucleotidi (nt) specificamente in cellule HeLa in fase mitotica dopo l'esposizione durante la notte (Figura 1A). In genere, l'intensità del segnale dei prodotti RdRP dimostra due picchi che sono posizionati circa 25 nt e 30 nt in consonanza con la distribuzione delle dimensioni dei prodotti confermata dalla prossima generazione sequenziamento9. Contrariamente alle cellule mitotiche, cellule HeLa senza sincronizzazione dimostrano quasi assenza dei prodotti radioattivi 20 – 30 nt. Segnali ovali, che vengono posizionati sotto 20 nt in tutti i campioni, sono derive non specifici.
Nel caso che c'è solo un prodotto di nt ~ 30 con segnale debole in cellule HeLa mitotiche, indica che la reazione di RdRP non è andata bene. Ad esempio, se MNase trattamento avviene all'incirca e a sproposito, l'intensità del segnale in HeLa mitotica celle diminuisce significativamente (Figura 1B). RdRP reazione con vecchio HMD soluzione riduce inoltre i prodotti (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Figura 1 : Rappresentante RdRP prodotti di TERT endogeno in cellule HeLa mitotic. (A) tre risultati rappresentativi del dosaggio IP-RdRP in cellule HeLa trattati con nocodazole (manipolato) o DMSO (unmanipulated). Il 34 chimicamente sintetizzato nt RNA è stato utilizzato come modello. (B) analisi IP-RdRP in cellule HeLa mitotiche eseguita con il trattamento inadeguato di MNase. (C) test IP-RdRP in cellule HeLa mitotiche eseguita con soluzione HMD fresca o vecchia. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenti</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nucleasi di micrococcal, 20 U / µ l</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nucleasi di micrococcal Buffer, 10x</td>
			<td>8 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua RNAsi-libera</td>
			<td>Μ L 51</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Componente MNase reazione mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenti</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCREPOLATURE, 0,07% (wt/vol)</td>
			<td>6 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione HMD</td>
			<td>2 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibitore di RNasi, 40 U / µ l</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua RNAsi-libera</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Componente RdRP reazione mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenti</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNasi una ribonucleasi, 10 U / µ l</td>
			<td>0.2 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone di reazione, 10x</td>
			<td>20 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua RNAsi-libera</td>
			<td>159,8 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Componente ribonucleasi reazione mix.

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) sintetizza non solo DNA telomerico, ma anche RNA double-stranded attraverso attività RNA polimerasi RNA-dipendente. Qui, descriviamo un neocostituita dosaggio per rilevare attività RNA polimerasi RNA-dipendente di TERT endogeno.

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'RNA, ad esempio qual è il significato biologico di RdRP o TERT nelle cellule umane? Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo test si è affermato come il primo metodo sensibile per rilevare l'attività umana di RdRP espressa nelle cellule. Iniziare questa procedura con la preparazione delle cellule HeLa come descritto nel protocollo di testo.Lavare le celle una volta con 10 millilitri di PBS. Quindi, centrifugare il campione a 1.450 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Utilizzare un millilitro di tampone di lisi A ghiacciato per 10 milioni di cellule per lisare le cellule mediante pipettaggio delicato.Sonicare il campione in un tubo da 1,5 millilitri con un'amplificazione del sonicatore del 25% per 10 secondi. Dopo la sonicazione, centrifugare il campione a 20, 400 volte la gravità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante e trasferire un millilitro ciascuno di surnatante in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Pre-cleared il lisato aggiungendo 40 microlitri di perle di proteina A-agarosio prelavate per un millilitro di lisato. Mescolate bene capovolgendo più volte il tubo. Quindi, ruotare il campione per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Centrifugare il campione a 13.000 volte la gravità per un minuto a quattro gradi Celsius e recuperare il surnatante. Successivamente, aggiungi 40 microlitri di perle di proteina A-agarosio prelavate e 10 microgrammi di anticorpi TERT anti-umani nel lisato pre-eliminato. Mescolare bene capovolgendo più volte la provetta e ruotare il campione a quattro gradi Celsius durante la notte.Dopo la centrifugazione a 3, 300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante. Quindi, lavare le perline con Wash Buffer One. Aggiungere un millilitro di Wash Buffer One alle perline e mescolare bene capovolgendo il tubo.Quindi, ruotare il campione per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare il campione a 3.300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e ripetere questo passaggio altre tre volte.Dopo il lavaggio della soluzione AGC come descritto nel protocollo di testo, trattare le perle con nucleasi micrococcica risospendendole in 60 microlitri della miscela di reazione nucleasi micrococcica mediante pipettaggio delicato. Quindi, agitare delicatamente il campione su una piattaforma girevole di un agitatore posizionato in un'incubatrice di tipo Peltier per 15 minuti a 25 gradi Celsius. Dopo aver centrifugato il campione a 3.300 volte la gravità per 30 secondi a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante.Infine, lavare le perle due volte con una soluzione AGC contenente tre millimolari di EGTA e lavare le perle una volta con il Wash Buffer Two come descritto nel protocollo di testo. Preparare la miscela di reazione RdRP in una nuova provetta come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere sei microlitri di uridina trifosfato marcato sul gruppo alfa fosfato con P dash 32 alla miscela di reazione e mescolare bene mediante pipettaggio.Quindi, aggiungi un microlitro di RNA stampo alla miscela e mescola bene. Risospendere le perle con 20 microlitri della miscela di reazione RdRP risultante. Quindi, agitare delicatamente il campione su una piattaforma girevole di un agitatore posizionato in un'incubatrice di tipo Peltier per due ore a 32 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, aggiungere 5,4 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K e 45,4 microlitri di tampone 2X Proteinasi K alla miscela di reazione. Miscelare pipettando e agitare il campione in un'incubatrice di tipo Peltier per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver aggiunto 109,2 microlitri di acqua priva di RNasi al campione, aggiungere 200 microlitri di fenolo-cloroformio acido.Mescolare bene a vortice prima di centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Ripetere questo passaggio una volta.Quindi, aggiungere 20 microlitri di acetato di sodio a tre molari, pH 5,2, quattro microlitri di vettore di precipitazione e 250 microlitri di etanolo alla fase acquosa. Agitare bene il tubo per mescolare. Centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.Successivamente, lavare il pellet con 300 microlitri di etanolo freddo al 70% in volume conservato a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare il campione a 21, 100 volte la gravità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e asciugare il pellet all'aria.Risospendere il pellet in 20 microlitri di acqua priva di RNasi. Preparare la miscela di reazione RNasi in una nuova provetta come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 180 microlitri della miscela di reazione RNasi al campione.Quindi, incubare la provetta per due ore a 37 gradi Celsius. Aggiungere 2,3 microlitri di SDS al 10% di volume per volume al campione e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere due microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K al campione e incubare per altri 15 minuti a 37 gradi Celsius.Ora, aggiungere 205 microlitri di fenolo-cloroformio acido al campione. Dopo la miscelazione e la centrifugazione come prima, trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Aggiungere tre molari di acetato di sodio, vettore di precipitazione ed etanolo alla fase acquosa, quindi miscelare, centrifugare e lavare il pellet come eseguito in precedenza.Di seguito sono riportati tre risultati rappresentativi del test IP-RdRP in cellule HeLa trattate con nocodazolo o DMSO per cellule non manipolate. Come modello è stato utilizzato un RNA a 34 nucleotidi sintetizzato chimicamente. Dopo l'esposizione notturna, i prodotti RdRP possono essere visti tra i 20 e i 30 nucleotidi, in particolare nelle cellule HeLa all'interno della fase mitotica.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare l'attività RdRP del TERT umano.

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Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

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