Microscopia confocale rivela l'aggregazione di recettore di superficie delle cellule tramite spettroscopia di correlazione di immagine
2 agosto 2018
Gli anticorpi che si legano ai recettori bersaglio sulla superficie delle cellule possono conferire conformazione e alterazioni clustering. Questi cambiamenti dinamici hanno implicazioni per caratterizzare lo sviluppo di farmaci nelle cellule bersaglio. Questo protocollo utilizza la microscopia confocale e spettroscopia di correlazione di immagine attraverso ImageJ/FIJI per quantificare l'entità del recettore sulla superficie cellulare di clustering.
L'obiettivo generale di questo protocollo di spettroscopia di correlazione di immagini è quello di fornire una metodologia accessibile per la quantificazione degli eventi di clustering che si verificano sulla superficie cellulare. Gli anticorpi che si legano ai recettori sulla superficie cellulare possono conferire alterazioni di conferma e clustering. L'analisi di questi processi dinamici è importante per la caratterizzazione dei bersagli farmacologici.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una metodologia accessibile per la quantificazione degli eventi di clustering sulla superficie cellulare utilizzando apparati di imaging facilmente accessibili. Per iniziare, seminare 10.000 cellule di carcinoma epidermoide A431 in ciascun pozzetto di un vetrino di imaging a otto camere. Il giorno successivo, aggiungere immediatamente alle cellule 100 nanogrammi per millilitro di ligando EGF per stimolare l'aggregazione del recettore EGF.
Incubare le cellule con il ligando a temperatura ambiente per 10 minuti prima di fissarle. Successivamente, seguire il protocollo di immunocitochimica e immagini confocali nel protocollo di testo allegato, prestando molta attenzione alle impostazioni utilizzate durante la raccolta, e caricare i set di dati acquisiti in Fiji. La saturazione eccessiva deve essere evitata.
Le immagini finali devono contenere pixel di dimensioni inferiori a 1 micron quadrato. Inoltre, è possibile acquisire una superficie piana sulla superficie apicale o basale e una regione priva di cellule per la successiva normalizzazione del campione. Inizia identificando la regione della membrana della superficie cellulare apicale o basale di interesse nella prima immagine.
Selezionare una dimensione in pixel compresa tra 2 e n nell'intervallo 256 x 256, 128 x 128 o 64 x 64. Quindi, vai al menu immagine e seleziona duplica. Quindi, vai all'analisi e passa alle misurazioni.
Calcola l'intensità media dell'area di interesse ritagliata. Ora, identifica una regione di sfondo della stessa dimensione dall'immagine originale. Duplicalo come prima.
E calcola l'intensità media dell'area di interesse ritagliata sullo sfondo. Dopo aver misurato sia l'area di interesse che lo sfondo, vai su Elabora e seleziona Calcolatore di immagini. Posizionare l'area di interesse come Immagine 1 e l'immagine di sfondo come Immagine 2, quindi selezionare Sottrai come operazione.
Quindi, vai al menu del processo. Scendi su FFT e seleziona FD Math. Nella finestra di dialogo Matematica FFT, selezionare immettere le immagini come mostrato di seguito e impostare l'operazione per la correlazione.
Assicurarsi che la trasformazione inversa sia attiva. Normalizza l'immagine risultante selezionando il processo, scorrendo verso il basso fino alla matematica, selezionando la divisione e inserendo il numero totale di pixel nella finestra di dialogo. Quindi, normalizzare nuovamente dividendo per l'intensità media dell'area ritagliata normalizzata al quadrato.
Quindi, traccia una linea attraverso la funzione di diffusione dei punti. Traccia il profilo di questa linea per calcolare il valore di picco andando su analizza e selezionando il profilo del grafico. Calcola i cluster per area del fascio trasferendo il valore di picco su un foglio di calcolo.
Quindi impostare i cluster per area del raggio su un valore pari a uno sopra il valore di picco meno uno. Per elaborare in batch le immagini, si consiglia di stabilire una macro Fiji. Ciò consente un'analisi coerente e rapida di più immagini confocali per l'analisi della spettroscopia di correlazione delle immagini.
Per stabilire una macro per il flusso di lavoro della spettroscopia di correlazione delle immagini, impostare il programma per registrare ogni comando di menu nel protocollo. Per questo, vai su plug-in, giù a marcos, e seleziona registra. Quindi, torna alla finestra principale ed esegui il protocollo descritto nella sezione precedente di questo video.
Al termine, tornare alla finestra della macro e selezionare Crea per generare una macro. Successivamente, nella finestra di modifica della macro, assicurarsi di selezionare la lingua come macro LJ1. Se non è selezionato, il programma non sarà in grado di essere eseguito.
Infine, salva la macro. La funzione di trasferimento ottico di un microscopio assicura che anche gli oggetti di dimensioni molecolari appaiano come immagini tra 200 e 300 nanometri nel piano XY. Eseguendo l'imaging di perle di fresin a risoluzione inferiore allo stesso modo delle cellule, come descritto in questo protocollo, è possibile calcolare l'area della funzione di diffusione del punto del microscopio.
Queste immagini rappresentano cellule di carcinoma epidermoide A431 aderenti stimolate da EGF e non simulate marcate con un anticorpo primario cetuximab mirato al recettore EGF della superficie cellulare. Le caselle gialle rappresentano la membrana cellulare contenente regioni di ritaglio con dimensioni in pixel di 64 per 64. Queste immagini sono state utilizzate per eseguire analisi di spettroscopia di correlazione delle immagini.
Dopo la normalizzazione della funzione di autocorrelazione, la funzione di diffusione dei punti può essere misurata utilizzando lo strumento linea. Il profilo di questa funzione linea viene tracciato per rilevare il valore di picco. Utilizzando questi metodi, è stato osservato che la stimolazione dell'EGF induce una diminuzione di 2,56 volte dei cluster di EGFR rilevati per area del fascio rispetto alle cellule non stimolate.
Una volta padroneggiate, l'analisi delle immagini confocali richiederà solo pochi minuti per immagine. Durante il tentativo di questa procedura, è importante raccogliere più repliche di ogni condizione sperimentale utilizzando le impostazioni descritte in questo protocollo. Seguendo questa procedura, la spettroscopia di correlazione delle immagini può essere ampliata per esplorare i cambiamenti temporali degli eventi di clustering nelle cellule viventi utilizzando la microscopia time lapse.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare gli stati di aggregazione di ordine superiore utilizzando ICS di fotosbiancamento mentre la co-localizzazione di due proteine basate su membrana utilizzando metodologie di spettroscopia di correlazione incrociata di immagini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come calcolare lo stato di raggruppamento della molecola di superficie cellulare di interesse.
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Panoramica
Questo protocollo delinea una metodologia per quantificare il clustering dei recettori sulla superficie cellulare utilizzando la spettroscopia di correlazione delle immagini. La tecnica è cruciale per comprendere la caratterizzazione del bersaglio farmacologico.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Farmacologia
Sfondo
- Gli anticorpi possono indurre cambiamenti conformazionali nei recettori della superficie cellulare.
- Il clustering dei recettori è significativo per lo sviluppo di farmaci.
- La spettroscopia di correlazione delle immagini permette un'analisi dettagliata di questi processi.
- Le tecniche di imaging accessibili facilitano applicazioni di ricerca più ampie.
Obiettivo dello studio
- Quantificare gli eventi di clustering sulla superficie cellulare.
- Fornire un protocollo affidabile per i ricercatori.
- Migliorare la comprensione della dinamica dei recettori nel targeting farmacologico.
Metodi utilizzati
- Microscopia confocale
- Spettroscopia di correlazione delle immagini
- Uso del software ImageJ/FIJI
- Semina cellulare e stimolazione con ligando EGF
Risultati principali
- Quantificazione del clustering dei recettori ottenuta.
- Dimostrazione degli effetti dell'EGF sull'aggregazione dei recettori.
- Fornitura di una metodologia chiara per studi futuri.
- Evidenziazione dell'importanza della dinamica dei recettori nello sviluppo di farmaci.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per studiare il clustering dei recettori.
- I metodi di imaging accessibili possono far progredire la ricerca sui bersagli farmacologici.
- Comprendere la dinamica dei recettori è cruciale per le applicazioni farmacologiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying receptor aggregation on the cell surface provides critical insights into target engagement and mechanism of action for antibody-based therapeutics. This methodology enables preclinical assessment of receptor dynamics, supporting target validation and lead optimization by linking ligand-induced clustering to functional outcomes. Accessible confocal-based image correlation spectroscopy offers a scalable approach to de-risk therapeutic candidates through quantitative, reproducible measurements of membrane protein organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis by quantifying ligand-induced receptor clustering as a functional readout of target engagement.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, reproducible assessment of receptor aggregation states using widely available confocal microscopy.
- Predictive Value: Provides quantitative data on receptor clustering that informs target confidence and portfolio triage decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline receptor clustering metrics under controlled conditions.
- Reproducibility: Delivers quantitative, normalized outputs suitable for assay standardization and cross-laboratory comparability in target validation workflows.
- Scalability: Enables high-throughput analysis via Fiji macro automation, supporting consistent evaluation of compound effects on receptor dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses EGFR in A431 cells as a disease-relevant system to model receptor aggregation mechanisms applicable to oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by quantifying receptor dynamics that correlate with internalization and signaling outcomes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from receptor aggregation, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead identification, providing quantitative receptor clustering data that informs hit-to-lead progression and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring ligand-induced changes in receptor organization as a direct functional output of target modulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts on receptor clustering that enable reliable comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Analytics: Generates normalized cluster density measurements per beam area, enabling statistical comparison of aggregation states under stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Connects in vitro receptor dynamics to preclinical relevance by modeling EGFR aggregation mechanisms observed in tumorigenic cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline via Fiji macros, allowing consistent application across multiple targets and experimental settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct quantification of receptor clustering events.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined imaging parameters, normalization protocols, and automated macro-based analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target engagement metrics to functional receptor aggregation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on receptor dynamics that inform advancement decisions in preclinical pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, fluorescent immunocytochemistry, and image analysis using Fiji/ImageJ.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate laser lines and detectors for fluorophore excitation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, ligand stimulation timing, and imaging settings across experimental replicates.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different receptor systems, cell types, or fluorescent labels beyond EGFR and cetuximab.
- Limited to fixed-cell analysis in this protocol; temporal dynamics in live cells would require additional validation and optimization for time-lapse applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Calculation of Image Correlation Spectroscopy
3:43
Batch Processing of ICS Datasets and Calculation of the Microscope s Beam Area
4:59
Results: Image Correlation Spectroscopy Detects Clusters on the Cell Surface of Adherent Cancer Cells
5:55
Conclusion
