Saggio di aggregazione cellulare per rilevare le interazioni trans tra le molecole di adesione cellulare

Nel sistema nervoso, le interazioni transcellulari - interazioni tra specifiche molecole di adesione delle cellule sinaptiche, proteine transmembrana, su neuroni presinaptici e postsinaptici - formano un complesso nelle sinapsi, mediando la segnalazione transsinaptica.

Per rilevare le interazioni transcellulari tra le molecole di adesione delle cellule sinaptiche espresse sulle cellule renali embrionali umane attraverso un saggio di aggregazione cellulare, iniziare con sospensioni cellulari trasfettate.

Una popolazione cellulare trasfettata esprime la molecola di adesione cellulare presinaptica desiderata e la proteina fluorescente verde; l'altra esprime la molecola di adesione cellulare postsinaptica specifica e la proteina fluorescente rossa. Si ottengono anche due popolazioni cellulari che esprimono proteine fluorescenti verdi e rosse.

Centrifugare le cellule. Risospendere le cellule in un terreno adatto integrato con ioni calcio. Mescolare equamente le cellule trasfettate di entrambe le popolazioni in una provetta. Ripetere per le altre popolazioni cellulari.

Durante l'incubazione, gli ioni calcio si legano a un sito specifico sulla proteina presinaptica espressa in una popolazione cellulare. Ciò aumenta l'interazione della proteina presinaptica con il ligando postsinaptico dell'altra popolazione cellulare, facilitando il legame, mediando l'adesione cellulare eterofila tra queste cellule e portando all'aggregazione cellulare.

Sotto un microscopio a fluorescenza, visualizzare le cellule utilizzando canali adatti, visualizzando la fluorescenza verde e rossa delle cellule. Elabora le immagini.

Non si osserva alcuna aggregazione nelle popolazioni cellulari che esprimono solo le proteine fluorescenti. L'aggregazione cellulare è visualizzata come gialla a causa della sovrapposizione tra le cellule fluorescenti verdi e rosse che esprimono le molecole di adesione cellulare sinaptica, suggerendo interazioni transcellulari tra le molecole.

48 ore dopo la trasfezione delle cellule HEK293T, prelevare le cellule dalla piastra a 6 pozzetti per l'aggregazione. Per prima cosa, lava ogni pozzetto due volte con PBS. Successivamente, per dissociare delicatamente le cellule, aggiungere 1 millilitro di EDTA da 10 millimolari a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius.

Dopo cinque minuti di incubazione, picchiettare delicatamente la piastra per staccare le cellule e raccoglierle in una provetta conica separata da 15 millilitri. Centrifugare le provette a 500 x g a temperatura ambiente per 5 minuti.

Mentre le cellule vengono pellettate, preparare sei provette di incubazione etichettando la parte superiore delle provette per microcentrifuga con le condizioni sperimentali. Deve essere utilizzata ogni permutazione di GFP e mCherry.

Rimuovere i surnatanti dalle provette coniche da 15 millilitri e risospendere le cellule in 500 microlitri di terreno. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule in ciascuna provetta conica. Quindi, aliquotare 200.000 cellule di ciascuna condizione nella provetta di incubazione appropriata per una miscela uno a uno in un volume totale di 500 microlitri. Posizionare le provette di incubazione in un rotatore lento di provette a temperatura ambiente.

Per valutare l'aggregazione, al basale e di nuovo dopo 60 minuti, pipettare 40 microlitri dalla provetta di incubazione su un vetrino da microscopio carico. L'acquisizione di base deve essere effettuata il più rapidamente possibile dopo l'aggiunta delle cellule alla provetta per microcentrifuga.

Visualizzare il vetrino sotto fluorescenza in entrambi i canali verde e rosso. Per ogni diapositiva, acquisisci immagini di tre diversi campi visivi su un piano focale.