Variazioni in negativo macchia metodi di microscopia elettronica: strumenti per affrontare impegnativi sistemi

L'obiettivo generale di questo video è quello di dimostrare diverse varianti delle tecniche per la preparazione di campioni di microscopia elettronica a trasmissione di macchie negative. La colorazione negativa è il modo migliore per valutare rapidamente la qualità di un campione EM. È importante riconoscere che diverse tecniche di preparazione della griglia funzionano meglio per alcuni campioni.

La tecnica che funziona meglio per un dato campione deve essere determinata per tentativi ed errori. Per iniziare, preparare le griglie EM utilizzando il metodo del foglio di carbone e preparare i reagenti di colorazione negativa come descritto nel protocollo di testo allegato. Posizionare una griglia EM rivestita con foglio di carbone rivolta verso l'alto su un vetrino da microscopio.

Posizionare il vetrino in un'unità di scarica a incandescenza e trattare la griglia per un minimo di 30 secondi a 10 milliampere per rendere la griglia idrofila. Al termine, rimuovere il campione dall'unità di scarico. Quindi, usa un paio di pinzette a pressione negativa per afferrare il bordo della griglia.

Per colorare con il metodo del side blot, applicare prima da tre a cinque microlitri di campione sulla superficie di supporto. Lasciare che il campione si adsorba sulla superficie della griglia per 10 secondi o un minuto, quindi toccare il bordo della griglia su un foglio di carta da filtro e lasciare che l'azione capillare estragga il liquido. Quindi, posizionare 50 microlitri di gocce di acqua ultrapura o un'appropriata soluzione tampone volatile su un foglio di pellicola da laboratorio.

Toccare delicatamente la superficie in carbonio della griglia fino alla goccia e sollevare una piccola goccia sulla superficie della griglia. Quindi, toccare il bordo della griglia su un foglio di carta da filtro e lasciare che l'azione capillare estragga il liquido. Quindi, posizionare due gocce da 50 microlitri di reagente colorante su un foglio di pellicola da laboratorio.

Tocca delicatamente la superficie in carbonio della griglia fino alla goccia e solleva una piccola goccia sulla superficie superiore della griglia. Se la macchia migra verso il retro della griglia, il film di carbonio si è rotto e deve essere scartato. Dopo 10-15 secondi, toccare il bordo della griglia su un foglio di carta da filtro e lasciare che l'azione capillare estragga il liquido.

Ripeti questo passaggio di colorazione ancora una volta e poi lascia asciugare la griglia all'aria. Per colorare il campione utilizzando il metodo dello sfarfallio, afferrare il bordo della griglia con un paio di pinzette a pressione negativa e applicare da tre a cinque microlitri di campione sulla superficie di supporto. Tenendo le pinzette in una mano, inclinare la griglia in modo che sia a circa 45 gradi rivolta verso l'esterno e muovere rapidamente il polso per rimuovere la maggior parte della gocciolina che si trova sopra la griglia.

Quindi, utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per applicare una goccia di soluzione di lavaggio sulla superficie di appoggio. Togliete la goccia e ripetete l'operazione alcune volte per lavare il campione. Quindi, applicare una goccia di reagente colorante sulla superficie di supporto e rimuovere nuovamente la gocciolina.

Ripetere questa fase di colorazione da una a tre volte, a seconda della profondità della colorazione richiesta per la visualizzazione del campione. Rimuovere la macchia in eccesso toccando il bordo strappato di un pezzo di carta da filtro con il bordo della griglia, quindi lasciare asciugare la griglia all'aria. Per colorare il campione utilizzando il metodo del lavaggio rapido, aspirare prima da 30 a 70 microlitri di colorante nella punta di una pipetta da 200 microlitri.

Ruotare la manopola del volume per aspirare cinque microlitri d'aria, quindi aspirare da cinque a 30 microlitri del reagente di lavaggio, seguito da un altro piccolo traferro, prima di altri cinque microlitri di campione. Afferrare il bordo di una griglia con un paio di pinzette a pressione negativa e inclinare la griglia di circa 45 gradi verso l'esterno. Con un movimento rapido, espellere l'intero contenuto del puntale della pipetta attraverso la superficie della griglia EM rivestita di carbonio.

Rimuovere la macchia in eccesso toccando il bordo strappato di un pezzo di carta da filtro con il bordo della griglia e lasciare asciugare la griglia all'aria. La scelta ideale per una colorazione negativa è altamente dipendente dal campione. La macchia più comunemente usata è l'acetato di uranile, ma possono essere utilizzate anche coloranti di lantanidi.

Per i campioni profondamente incorporati, i coloranti a base di lantanidi, l'acetato di tulio e l'acetato di erbio, hanno prodotto una colorazione negativa di qualità equivalente all'acetato di uranile, a giudicare dal contrasto apparente e dalla nitidezza delle particelle colorate, con l'acetato di tulio che produce immagini più chiare e nitide rispetto all'acetato di erbio. La grande granulometria dell'acetato di tulio diventa evidente ad alto ingrandimento, come mostrato qui quando un campione di particelle fibrose del mosaico di tabacco è stato colorato con acetato di tulio all'1%. Utilizzando l'acetato di tulio, la ripetizione di 23 angstrom della particella fibrosa del mosaico del tabacco è chiaramente visibile ad occhio.

Nessuna delle altre colorazioni di lantanidi testate è stata in grado di risolvere questa caratteristica. Un altro campione difficile da visualizzare è la proteina C di derivazione muscolare. Questo campione produce immagini significativamente diverse a seconda del metodo di colorazione.

Quando viene colorato con un metodo di macchia laterale, appare come una struttura globosa, collassata simile ad un'ala. Quando le griglie vengono preparate con il metodo dello sfarfallio, la proteina C viene osservata come una serie di domini che assomigliano a perline su una corda. Questo rappresenta meglio l'effettiva struttura della proteina C.

Una volta padroneggiato, ci vuole solo circa un minuto per preparare un campione colorato negativamente. È importante ricordare che ogni campione risponde in modo diverso a ciascuna tecnica di colorazione. Per i nuovi campioni, l'approccio migliore deve essere determinato sperimentalmente.

Non dimenticare che i reagenti per la colorazione dell'uranile sono tossici e leggermente radioattivi. Assicurati che vengano smaltiti in un flusso di rifiuti adeguato.