Microscopia a contrasto di fase per la valutazione dei mutanti dello sviluppo negli streptomiceti

Inizia con piastre di agar contenenti colonie di ceppi selvatici e mutanti di Streptomyces coelicolor, un batterio filamentoso del suolo.

Posizionare un vetrino coprioggetti sterile su una regione di densa crescita di colonie dove i filamenti aerei, che sono filamenti che si estendono sopra la superficie della colonia, sono chiaramente visibili.

Premere delicatamente il vetrino coprioggetti per trasferire i filamenti aerei e le spore associate sulla superficie del vetrino.

Quindi, prendere un vetrino da microscopio con il supporto di montaggio e montare il vetrino coprioggetti con la cellula rivolta verso il basso per preservare le strutture batteriche.

Posizionare il vetrino su un tavolino da microscopio, aggiungere una goccia di olio da immersione sul vetrino coprioggetti e allineare l'obiettivo.

Utilizzando la microscopia a contrasto di fase, acquisisci immagini dei filamenti aerei sia da ceppi selvatici che mutanti.

I filamenti wild-type mostrano spore di dimensioni uniformi e regolarmente distanziate.

Al contrario, i ceppi mutanti mostrano difetti, come filamenti rigonfi, spore irregolari o spore lisate, rivelando differenze fenotipiche nello sviluppo tra il tipo selvatico e i mutanti.

Per preparare un vetrino coprioggetti per la crescita batterica, utilizzare una pinzetta sterile per raccogliere un vetrino coprioggetti sterile e posizionare il vetrino coprioggetti su una piastra di agar MS dove la crescita batterica è densa. Utilizzando una pinzetta, premere delicatamente sul retro del vetrino coprioggetti per garantire un trasferimento sufficiente delle spore batteriche e del micelio aereo. Raccogliere il vetrino coprioggetti dalla piastra e posizionarlo a un angolo di 45 gradi con il materiale cellulare rivolto verso la superficie di un vetrino da microscopio contenente una goccia da 15 microlitri di glicerolo al 50%.

Lascia che il vetrino coprioggetti cada sul glicerolo che ridurrà le bolle d'aria. Per eseguire la microscopia a contrasto di fase a vari intervalli di tempo, posizionare il vetrino preparato sul tavolino del microscopio e aggiungere una goccia di olio da immersione al centro del vetrino coprioggetti. Ruotare l'obiettivo di fase 100x in posizione e impostare la torretta del condensatore sull'impostazione di fase corrispondente corretta.

Una volta che la lente dell'obiettivo è a contatto con l'olio, utilizzare solo la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco l'immagine. Esamina diversi campi visivi per discernere differenze evidenti e coerenti tra i ceppi mutanti e il tipo selvatico. Come la capacità di formare spore, la dimensione e la forma delle spore e il numero complessivo di spore.