Flow-modello Fabrication guidata della alta densità di codici a barre anticorpo Microarray

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di fabbricare un array di anticorpi con applicazioni nell'analisi di singole cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'analisi di singole cellule, ad esempio come possiamo rilevare simultaneamente proteine segrete e proteine intracellulari dalla stessa singola cellula. E come possiamo fabbricare una piattaforma di micro-array per raggiungere questo obiettivo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è personalizzabile. Variando le strategie di modellazione del flusso, è possibile creare array di varie dimensioni. In anticipo, generare il master SU-8 per i modelli di flusso del codice a barre.

Le istruzioni sono fornite nel protocollo di testo. Ciò comporta la progettazione e la realizzazione di una fotomaschera cromata. Posizionando la maschera su un cappotto fotoresistente e applicando i raggi UV si ottiene il modello.

Per iniziare a preparare lo stampo per codici a barre PDMS, unire 40 grammi di base in elastomero siliconico con quattro grammi di agente indurente, quindi mescolare energicamente per 10 minuti. Quindi, degassare la soluzione prepolimerica per 20 minuti sotto vuoto. Quindi, caricare la soluzione in una capsula di Petri contenente un wafer di silicio con il master SU-8 del modello di codice a barre.

Versare la soluzione a una profondità di 7,45 millimetri. Quindi, degasare la miscela nella pirofila per rimuovere eventuali bolle rimanenti. Seguire il degasaggio cuocendo la miscela per un'ora a 75 gradi Celsius per polimerizzare il PDMS.

Successivamente, tagliando con un bisturi, rimuovere con cura lo stampo del codice a barre. Quindi, staccare con cura la lastra dal wafer. Quindi, rifila i bordi della lastra per creare la forma desiderata per lo stampo.

Rifinire lo stampo utilizzando un punzone per biopsia con stantuffo per praticare fori da mezzo millimetro in corrispondenza delle caratteristiche circolari sul modello che rappresentano ingressi e uscite. Dopo aver soffiato via la polvere da un vetrino rivestito in poli-L-lisina con una pistola ad azoto, collegare lo stampo PDMS al vetrino. Allineare con cura i bordi dello stampo al vetrino.

Ora, cuocere il gruppo per 90 minuti a 75 gradi Celsius per rafforzare il legame tra il PDMS e il vetrino. Nel frattempo, preparare 20 pezzi di tubo flessibile in polietilene per gli ingressi e le uscite. Su ogni pezzo di tubo, fissare un perno cavo in acciaio inossidabile con un diametro di un millimetro.

Quindi, tramite i perni, riempire le lunghezze con un centimetro o più di poli-L-lisina. Una volta incollati al vetro, fissare con cura i perni agli ingressi dello stampo. Questo è il passaggio più difficile della preparazione.

Non affrettare il processo. Collegare l'altra estremità dei tubi a un serbatoio di azoto regolato a pressione che consiste in una rete di 20 valvole a tre vie e può gestire due stampi contemporaneamente. Usando la configurazione, soffiare la soluzione attraverso lo stampo a 0,5 a un PSI per almeno sei ore.

Inizia aspirando le soluzioni di DNA a filamento singolo appena preparate in BS-3 attraverso i perni in acciaio inossidabile e nel tubo in polietilene. Quindi, accoppiare lo stampo PDMS alla fonte di azoto e far scorrere la soluzione attraverso lo stampo del codice a barre per circa 40 minuti o fino a quando tutti i canali non sono riempiti. Quindi, arrestare il flusso e lasciare incubare lo stampo a temperatura ambiente per due ore.

Dopo un paio d'ore, cuocete lo stampo per codici a barre a 75 gradi Celsius per un'ora. Una volta cotto, staccare lo stampo dalla diapositiva e lavare delicatamente la diapositiva con 01%SDS. Quindi, lavare lo scivolo tre volte con acqua ultrapura.

Seguire i lavaggi asciugando il vetrino con codice a barre utilizzando un filavetrino. Una volta asciutto, conservare il vetrino con codice a barre in una provetta pulita da 50 millilitri. Per procedere, seguire il protocollo di testo per convalidare il modello unidimensionale.

Per eseguire la procedura di convalida, bloccare il vetrino, ibridare la cianina con tre DNA complementari e misurare i risultati. Il master SU-8 per un array tre per tre ha un modello di flusso perpendicolare a quello del primo progetto. Utilizzare il metodo descritto in precedenza per creare un nuovo stampo PDMS di questo modello.

Per iniziare, fai nuove concentrazioni di lavoro dei nove oligonucleotidi. Ora, far fluire una soluzione di blocco BSA al tre percento in tutti i 20 canali del vetrino dell'array per un'ora a 0,5 a un PSI. Quindi, caricare le soluzioni di DNA nei rispettivi canali.

Dopo averli fatti scorrere per circa 40 minuti, incubare il vetrino a temperatura ambiente per due ore per consentire al DNA di ibridarsi. Quindi, far fluire il tre percento di soluzione bloccante BSA in tutti i 20 canali per un'ora. Questo rimuoverà il DNA non ibridato.

A questo punto, staccare il vetrino dell'array dal PDMS e immergerlo una volta nel tre percento di BSA. Quindi, immergi il vetrino in PBS due volte seguito da un calo in PBS del due percento. Quindi, come in precedenza, asciugare il vetrino utilizzando una centrifuga per vetrini da microscopio.

Per procedere, eseguire un passaggio di convalida simile alla convalida dei vetrini unidimensionali. Utilizzare oligonucleotidi da uno a nove primi, tutti coniugati a cianina tre. Conservare il vetrino dell'array tre per tre in una provetta da centrifuga da 50 millilitri per un uso successivo.

Il protocollo di testo spiega ulteriormente come convertire l'array di DNA in un array di anticorpi. Dopo aver preparato e purificato i coniugati anticorpo-oligo, preparare un altro stampo PDMS con microcamere. Vedere il testo per i dettagli.

Accoppiare questo stampo con la diapositiva dell'array. Ora, bloccare il vetrino con l'uno per cento di BSA e incubarlo per un'ora a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, preparare 200 micro-litri di coniugati anticorpo-oligonucleotidi.

Dopo il blocco, aggiungi il cocktail anticorpo-oligo al setup. Lasciare incubare gli anticorpi sull'array per un'ora a 37 gradi Celsius, quindi pulire e asciugare il vetrino prima di procedere con i tuffi del vetrino descritti nel protocollo di testo. Dopo aver seguito il protocollo descritto, utilizzando un array tre per tre, il pannello di anticorpi risultante è stato utilizzato nel rilevamento multi-plex, principalmente attraverso la piattaforma ELISA a sandwich.

Le proteine hanno mostrato una variazione inferiore al 10% da un'estremità all'altra del vetrino. Sull'array tre per tre, possono essere rilevate fino a sette proteine insieme a un riferimento marcato con cianina tre e un controllo negativo. In un esperimento su una singola cellula eseguito per uno studio sul tumore, le sei proteine sono state rilevate contemporaneamente.

Per la calibrazione, le proteine ricombinanti sono state applicate a un array a varie concentrazioni. La sensibilità di rilevamento era abbastanza simile a quella di un ELISA a sandwich convenzionale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere gli stampi PDMS privi di particolato.

La polvere nei canali può causare array con scarsa uniformità e bassa sensibilità. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro per esplorare la segnalazione cellula-cellula utilizzando modelli di microambienti tumorali.