Un'analisi semplice, rapida e quantitativa per riparazione di misura di legami incrociati della DNA-proteina su plasmidi Transfected nelle cellule di mammifero

L'obiettivo del presente protocollo è quello di quantificare la riparazione di definiti legami incrociati della DNA-proteina il DNA del plasmide. Lesi plasmidi sono transfected nelle linee cellulari di mammifero destinatario e basso peso molecolare raccolte a più punti di tempo post-transfezione. Cinetica di riparazione del DNA sono quantificati utilizzando primer specifici strand estensione seguita da qPCR.

L'obiettivo generale di questo saggio QPCR sull'estensione del primer trans-pacifico è valutare quantitativamente la riparazione di adddotti, reticolati al DNA plasmidico, dopo la trasfezione in cellule di mammifero. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione del DNA. Ad esempio, quali percorsi sono coinvolti nella riparazione dei legami incrociati delle proteine del DNA.

Questa tecnica ha il potenziale per fornire una migliore comprensione della risposta al danno al DNA. Perché permette di studiare selettivamente la riparazione dei legami incrociati delle proteine del DNA e l'assenza di altri tipi di danno al DNA. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla riparazione dei legami incrociati delle proteine del DNA, può essere applicato anche ad altri tipi di danno al DNA.

Come i siti di base e altri addotti che bloccano la polimerasi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può rilevare la riparazione di plasmidi contenenti addotto, in punti temporali già a due ore. Inizialmente intendevamo utilizzare la riattivazione delle cellule domestiche per studiare la riparazione, tuttavia tali test non misurano direttamente la riparazione o possono sovrastimare l'efficienza della riparazione.

In particolare se l'RNA polimerasi è in grado di leggere attraverso prodotti di riparazione incompleti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di purificazione e di estensione del primer specifiche per il filamento sono altrimenti difficili da visualizzare. Mescolare 20 microlitri di una soluzione contenente 80 picomoli di un oligonucleotide contenente otto oxoguanina con cinque microlitri di tampone ligasi 10x.

E aggiungere un microlitro di una soluzione contenente 10 unità di polinucleotide chinasi T4. Regolare il volume finale a 50 microlitri e incubare la provetta a bagnomaria per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente costituisce la reazione primer-estensione sul ghiaccio.

Impostare il programma sul termociclatore e avviare la corsa. Dopo l'incubazione, regolare il volume totale a 375 microlitri aggiungendo diversi reagenti, enzimi e tampone. Quindi incubare la reazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius durante la notte.

Per preparare una miscela fenil-cloroformio in un rapporto di 50:50, aggiungere volumi uguali di fenolo e cloroformio. Quindi mescolare entrambi i componenti e centrifugare in una centrifuga da tavolo a 21, 130 g per cinque minuti. Al termine della centrifuga, aggiungere 375 microlitri di strato organico alla reazione primer-estensione. Mescolare.

E di nuovo centrifugare a 21, 130 g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, pipettare accuratamente lo strato superiore. E mescolare con acetato di ammonio fino a una concentrazione finale di 0,3 molari.

E poi aggiungi due volumi di etanolo al 100%. Conservare la miscela a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per almeno 30 minuti o durante la notte. Una volta terminato il periodo di incubazione, centrifugare il campione a 15.000 giri/min a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi scartare il surnatante e lavare il pellet in etanolo al 70%. Far girare nuovamente il campione in una centrifuga da tavolo a 15.000 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e sciogliere il pellet in 100 microlitri di acqua.

Combina 50 microlitri di DNA con 34 microlitri di acqua e 16 microlitri di colorante 6x caricamento gel. Eseguire il campione su un gel di agarosio a basso punto di fusione da 10 centimetri, allo 0,8%, contenente 0,5 microgrammi per millilitro di bromuro di etidio a due volt per centimetro per sei ore in 1 tampone TAE. Quindi utilizzare una lama di rasoio per asportare il DNA superavvolto.

E pesare la fetta di gel. Successivamente, aggiungi un microlitro di tampone di reazione beta-agarasi per digerire ogni 10 milligrammi di fetta di gel. Quindi incubare la fetta a 65 gradi Celsius per 10 minuti seguita da raffreddamento a 42 gradi Celsius in un termociclatore.

Una volta che la fetta di gel si è sciolta e raffreddata a 42 gradi Celsius, aggiungere 10 unità di beta-agarasi e lasciare a 42 gradi Celsius per un'ora nel termociclatore. Dopo un'ora, misurare il volume della fetta di gel disciolto e aggiungere acetato di ammonio a una concentrazione finale di 0,3 molari e incubare su ghiaccio per 15 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela a 15.000 G per 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi raccogliere il super natante e pipettare due volumi di isopropanolo e mescolare. Quindi conservare la miscela a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per una notte. Il giorno seguente, centrifugare il DNA superavvolto purificato in una centrifuga da tavolo a 15.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il super natante e risospendere il pellet in 40 microlitri di acqua. Quindi combinare 15 microlitri di una soluzione contenente 12 picomoli di DNA con un microlitro di una soluzione di 36 picomoli di oxoguanina glicosilasi in un tampone e regolare il volume finale a 30 microlitri. Quindi incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti a bagnomaria.

Un giorno prima della trasfezione, seminare le cellule in una piastra di coltura a sei pozzetti. Il giorno seguente mescolare 1,5 microgrammi di plasmide reticolato con 300 microlitri di terreno di coltura privo di siero in una provetta, assicurandosi di conservare un microlitro di DNA come punto di indicazione dell'ora zero. In un'altra provetta, mescolare 12 microlitri di reagente di trasfezione con 300 microlitri di terreno privo di siero.

Quindi combinare 300 microlitri di DNA reticolato con un volume uguale di reagente di trasfezione diluito. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare. Dopo l'incubazione, aggiungere 250 microlitri del complesso a ciascuno dei due pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius.

Dopo un minimo di un'ora, rimuovere il terreno e aggiungere un millilitro di soluzione di dodecil solfato di sodio allo 0,6% con EDTA 0,1 molare e incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Quindi staccare le cellule raschiando con un poliziotto di gomma e trasferirle in un tubo per microfuga da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di cloruro di sodio a 5 molari fino a una concentrazione finale di un molare e capovolgere la provetta cinque volte.

Quindi incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo centrifugare il campione a 21,130 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, raccogliere il super natante.

E aggiungi l'acetato di ammonio a una concentrazione finale di 0,3 molari, mescola e aggiungi due volumi di etanolo al 100% per precipitare il DNA. Conservare il composto a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per un minimo di 30 minuti. Dopo la precipitazione con etanolo e la risospensione dei campioni di DNA recuperati in 50 microlitri di acqua, diluire il campione a zero ore in 500 microlitri di acqua e costituire le reazioni PCR utilizzando i campioni non trasfettati e trasfettati.

Quindi impostare il programma sul termociclatore e avviare la corsa. Questa fase di estensione del primer trans-specifica è fondamentale perché ci permette di amplificare il filamento danneggiato. Se non utilizzati, i valori di TC delta sarebbero inferiori a uno, rendendo difficile rilevare bassi livelli di riparazione DPC.

Dopo aver completato otto cicli, aggiungere 100 picomoli del secondo primer. Quindi mescolare un microlitro di DNA non amplificato dai campioni non trasfettati e trasfettati con 2x master mix, acqua e 100 picomoli di entrambi i primer fino a un volume finale di 60 microlitri. Caricare i campioni in triplicato su una piastra PCR a 96 pozzetti.

Eseguire la PCR quantitativa per 30 cicli e calcolare la media della soglia del ciclo per ciascuno dei campioni triplicati. In questo studio, la QPCR viene eseguita con e senza estensione del primer specifico del filamento al fine di calcolare la percentuale di DNA plasmidico che è stata riparata. La differenza nei valori di soglia del ciclo tra i campioni primer-extended e quelli non primer-extended è indicata come delta CT.As visto qui, un campione riparato sottoposto a SSPE-QPCR ha un delta CT maggiore rispetto a un campione non riparato.

I dati rappresentativi della percentuale di riparazione calcolata dai valori TC delta mostrano che i campioni recuperati dopo tre ore di trasfezione sono riparati al 66%, mentre i campioni recuperati dopo otto ore sono riparati al 93%. Di seguito sono riportati i valori percentuali di fondo calcolati da due campioni di controllo con efficienza di reticolazione proteica rispettivamente alta e bassa. La bassa percentuale di fondo presente nel controllo indica perché per le trasfezioni vengono utilizzati solo substrati reticolati in modo efficiente.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prelevare campioni di tempo zero per sottrarre qualsiasi background da questo test. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi delle sequenze per rispondere a ulteriori domande come: è soggetto a errori di riparazione DPC?

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come preparare, trasfettare e quantificare la riparazione dei plasmidi contenenti addotti nelle cellule di mammifero. Non dimenticare che lavorare con fenolo, cloroformio e bromuro di etidio può essere pericoloso. E precauzioni come indossare guanti e lavorare in una cappa aspirante dovrebbero essere sempre prese.