Valutazione dell'impatto dell'aggregazione proteica su Stress ossidativo cellulare nel lievito

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la relazione tra la formazione di aggregati proteici intracellulari e il loro impatto sullo stress ossidativo cellulare utilizzando il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del misfolding delle proteine e delle malattie da aggregazione, come le malattie neurodegenerative e le amiloidosi non neuropatiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, veloce e consente di quantificare il danno da stress ossidativo cellulare in una vasta popolazione di lieviti.

Con questo metodo, possiamo fornire informazioni sulla correlazione tra lo stato solubile intracellulare o aggregato di una proteina amiloidogenica con i livelli di stress ossidativo nel lievito. Inoltre, può essere applicato anche ad altri organismi modello che esprimono proteine ricombinanti. A dimostrare l'analisi della citometria a flusso sarà Manuela Costa, un tecnico della Flow Cytometry Facility dell'UAB.

In questo studio, lo stato di aggregazione intracellulare di diverse varianti del peptide A-beta-42 viene monitorato utilizzando S. cerevisiae trasformato con un plasmide codificante per A-beta-42 fuso a GFP sotto il controllo di un promotore inducibile dal galattosio. Raccogli una colonia di cellule di lievito trasformate e inoculare in 20 millilitri di SC meno Ura contenente il 2% di glucosio. Coltiva la coltura a 30 gradi Celsius sotto agitazione durante la notte.

Il giorno seguente, inoculare 100 microlitri di coltura notturna in cinque millilitri di terreno SC fresco meno Ura e far crescere le cellule a 30 gradi Celsius per due o tre ore. Quando la coltura è a una densità ottica di 590 nanometri o OD 590 di 0,5, centrifugare la coltura a 3.000 volte g per quattro minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di terreno SC fresco meno Ura contenente il 2% di raffinosio. Incubare le cellule a 30 gradi Celsius sotto agitazione per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, centrifugare le cellule a 3.000 volte g per quattro minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno SC fresco meno Ura contenente il 2% di galattosio per indurre l'espressione proteica ricombinante. Rimettere le cellule nell'incubatore per 16 ore. Dopo 16 ore, raccogliere le cellule trasferendo aliquote da un millilitro di coltura in provette sterili per microcentrifuga e centrifugare a 3.000 volte g per quattro minuti.

Inizia questa procedura determinando l'OD 590 delle cellule di lievito indotte da 16 ore. Quindi diluire le cellule in PBS sterile a un OD 590 di 0,1. Trasferire le sospensioni cellulari esprimenti in provette di polistirene a fondo tondo opportunamente etichettate e proteggerle dalla luce.

Preparare le cellule non indotte come controllo negativo per l'analisi di citometria a flusso. Aggiungere la sonda per lo stress ossidativo a ciascun campione a una concentrazione finale di cinque micromolari. Coprire i campioni con un foglio di alluminio e incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, far girare le cellule, rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari nella PBS. Lavare le celle tre volte in questo modo con PBS. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule nello stesso volume di PBS.

Assicurarsi che le cellule non colorate siano incluse nell'analisi di citometria a flusso. Utilizzando i laser e i filtri appropriati, eseguire l'analisi di citometria a flusso per rilevare la GFP e il segnale fluorescente della sonda da stress ossidativo. Inizia facendo clic sul pannello Apri nuovo foglio di lavoro e assegna un nome all'esperimento.

Dalla barra degli strumenti, selezionare lo strumento Grafico a dispersione e creare un grafico con le variabili Area di dispersione laterale sull'asse y rispetto all'Area di dispersione in avanti in una scala lineare sull'asse x. Fare clic sullo strumento Grafico a dispersione e creare un grafico con le variabili Area FITC sull'asse x rispetto all'area APC in scala logaritmica sull'asse y. Fare clic sull'icona Impostazioni strumento e impostare tutti i livelli di compensazione su zero nella scheda Compensazione.

Quindi fare clic sulla scheda Acquisizione e selezionare un numero totale di 20.000 eventi da registrare con una bassa portata. Poiché il segnale di emissione fluorescente di un fluorocromo può essere rilevato da un altro rivelatore, è importante eseguire un processo di compensazione per equalizzare il segnale minimo di ciascun fluorocromo in tutti i rivelatori mediante un controllo a colore singolo. Rinominare il tubo 001 come controllo negativo e fare clic sulla scheda Acquisisci per avviare l'esecuzione delle celle non indotte e non colorate.

Regolare la tensione nelle impostazioni dello strumento della dispersione diretta e laterale fino a quando la popolazione non è distribuita nel quadrante centrale sinistro. Fare clic sull'icona Poligono per impostare una regione R1 attorno alla popolazione cellulare escludendo i detriti cellulari e utilizzare questa popolazione gated P1 uguale a R1 per tutti i grafici a punti fluorescenti e le rappresentazioni dell'istogramma. Per regolare la tensione PMT del segnale di fluorescenza, eseguire le celle non colorate nel diagramma a punti da FL1 a FL3, regolando il guadagno nella scheda Impostazioni strumento, fino a quando le celle non sono distribuite nel quadrante inferiore sinistro.

Utilizzando lo strumento Grafico a dispersione, creare un grafico a punti con le variabili FITC-A sull'asse x rispetto a FSC-A e un secondo grafico a punti con le variabili APC-A sull'asse x rispetto a FSC-A. Quindi, cambiare il campione con le cellule indotte per misurare la fluorescenza GFP. Nella scheda Impostazione strumento, impostare il guadagno in FSC-A rispetto a FITC quando la popolazione è distribuita nel quadrante in basso a destra.

Definire la popolazione cellulare GFP-positiva con un gate. Sostituire il campione con le cellule colorate non indotte. Visualizzazione dello stress ossidativo dovuto alla fluorescenza su un grafico a punti FSC-A rispetto a APC-A.

Regolare il guadagno fino a quando la popolazione cellulare non è distribuita nel quadrante superiore sinistro. Gate della popolazione cellulare positiva in P3. Con l'icona Istogramma, crea due grafici dell'istogramma per rappresentare la fluorescenza cellulare, uno per FITC e un altro per la fluorescenza APC. Crea una tabella che mostri l'intensità media della fluorescenza e la fluorescenza mediana con il corrispondente errore standard e/o il coefficiente di varianza per la fluorescenza GFP e i livelli di stress ossidativo.

Fare clic sulla scheda Retribuzione e impostare tutti i livelli di retribuzione su zero. Fare clic sulla scheda Acquisizione e selezionare un numero totale di 20.000 eventi da registrare. Preparare tre nuove provette di campioni e denominarle non indotte, solubili indotte e aggregate indotte.

Acquisisci i dati dai campioni con le impostazioni preimpostate. Analizza i dati aprendo un nuovo foglio e creando un grafico a punti per le variabili FITC-A e APC-A, controllando le celle positive per la colorazione CellROX. Per ogni campione, creare una tabella statistica con la fluorescenza media e l'errore standard per i canali FITC e APC.

È anche possibile smistare le cellule con un selezionatore FACS dopo il conteggio delle proteine aggregate. Le cellule di lievito che esprimono varianti A-beta-42 dopo un periodo di induzione di 16 ore vengono visualizzate al microscopio a fluorescenza per determinare la distribuzione delle proteine ricombinanti all'interno delle cellule. Queste immagini sono rappresentative di varianti selezionate di A-beta-42 GFP.

La formazione di inclusioni proteiche, o PI, è stata confermata in 10 delle 20 varianti della collezione analizzata. Questo grafico a barre indica la percentuale di cellule contenenti un numero diverso di PI calcolata da un totale di 500 cellule fluorescenti per ciascuna variante in repliche biologiche. È stato osservato un eccellente accordo tra le proprietà di aggregazione previste e quelle in vivo.

I livelli di espressione proteica negli estratti cellulari sono stati quantificati utilizzando un anticorpo A-beta-specifico. Come tendenza generale, le varianti A-beta-42 che formano PI, colorate in verde, sono presenti a livelli inferiori rispetto a quelle diffusamente distribuite nel citosol, colorate in rosso. Importanti differenze tra le varianti di A-beta-42 sono state osservate quando le loro proprietà di fluorescenza della sonda di stress ossidativo, i livelli proteici e la fluorescenza GFP sono stati rappresentati rispetto alla loro capacità di formare PI e alle loro propensioni intrinseche all'aggregazione previste dall'algoritmo bioinformatico AGGRESCAN o TAGO.

Le varianti che formano PI sono in verde e le varianti che non formano PI sono in rosso. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti anche altri metodi come la colorazione con ioduro di propidio o annessina V per rispondere a ulteriori domande come la determinazione dell'impatto di una variante proteica espressa intracellulare sull'apoptosi cellulare o sulla citotossicità.