Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sondare la composizione di complessi proteici che si assemblano specificamente attorno a una coppia di proteine interagenti di interesse utilizzando split-BioID, un saggio di complementazione di frammenti proteici che induce la biotinilazione proteica dipendente dalla prossimità all'interno delle cellule viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare, come ad esempio il modo in cui i complessi proteici si rimodellano dinamicamente per regolare diverse funzioni cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la facile identificazione di complessi proteici specifici del contesto nei loro ambienti cellulari nativi e con una risoluzione molto elevata.

Per l'analisi finale della spettrometria di massa, i seguenti passaggi devono essere eseguiti in condizioni prive di cheratina e tutto il materiale e i reagenti devono essere il più possibile privi di cheratina. Dopo aver clonato gli ORF di due proteine di interesse nel plasmide split-BioID, aver effettuato la trasfezione transitoria e aver aggiunto un terreno integrato con biotina secondo il protocollo di testo, utilizzare PBS per lavare le cellule due volte. Aggiungere 1,5 millilitri di PBS a ciascuna piastra e utilizzare un raschietto per raccogliere le cellule, quindi trasferire le cellule per ogni condizione in una provetta separata da 15 millilitri e far girare le provette a 1, 200 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Rimuovere i surnatanti e congelare i pellet in azoto liquido. Quindi conservare i tubi a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione. Per preparare i lisati cellulari, utilizzare un millilitro di tampone di lisi RT per risospendere i pellet.

Quindi passare le cellule attraverso un ago calibro 25 da 10 a 20 volte. Quindi sonicare i campioni. Quindi aggiungere 100 microlitri di Triton X-100 al 20% per 900 microlitri di lisato sonicato recuperato per una concentrazione finale del 2%Aggiungere 2,3 millilitri di Tris da 50 millimolari, pH 7,4, per millilitro di lisato per regolare la concentrazione di NaCl a 150 millimolari per legarsi alle perle di streptavidina.

Quindi distribuire i lisati regolati in provette da 1,5 millilitri e centrifugarli a 16.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per dieci minuti. Trasferire i surnatanti in una provetta da 15 millilitri e conservare da 50 a 100 microlitri come materiale in ingresso. Per eseguire un pulldown con streptavidina, per ogni condizione trasferire 200 microlitri di sospensione di perle magnetiche accoppiate con streptavidina in un tubo da 1,5 millilitri.

Posizionare le provette su un rack magnetico e attendere circa un minuto prima di rimuovere il buffer di conservazione. Con un millilitro di tampone di equilibratura lavare le perle mescolando delicatamente. Quindi spedisci uniformemente le perle equilibrate nel numero necessario di provette e riposizionale sulla rastrelliera magnetica.

Dopo aver rimosso il tampone di equilibrio, risospendere ogni serie di perle con quantità uguali dei lisati cellulari corrispondenti. Quindi incubare i campioni a quattro gradi Celsius su una ruota rotante durante la notte. Il giorno successivo posizionare le provette su una rastrelliera magnetica.

Attendere che le perle si attacchino al lato dei tubi e trasferire i surnatanti in un tubo da 15 millilitri etichettato come flusso attraverso. Con 200 microlitri di tampone di lavaggio, risospendere le perle in ciascun tubo e combinare ogni set di perle risospese corrispondenti a una condizione in tubi da 1,5 millilitri. Utilizzare un millilitro di tampone di lavaggio uno per lavare le perline due volte su una ruota rotante per otto minuti.

Quindi eseguire due lavaggi ciascuno per i tamponi di lavaggio due, tre e quattro. Per assicurarsi che il tampone di lavaggio venga completamente eliminato dopo l'ultima fase di lavaggio, dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, centrifugare i campioni. Quindi rimettili sulla rastrelliera magnetica e rimuovi il tampone rimasto.

Aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione alle microsfere, quindi incubare i campioni a 98 gradi Celsius per quindici minuti e spostare immediatamente le provette sul rack magnetico. Trasferire il campione eluito in una provetta nuova e conservare le provette a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Per ogni campione in ingresso, preparare un campione PAGE mescolando quantità uguali di proteine con il volume appropriato di tampone di caricamento SDS 3X in un volume totale di 28 microlitri.

Quindi preparare i campioni PAGE mescolando cinque microlitri di ciascun campione di eluizione con 2,5 microlitri di tampone di caricamento SDS 3X. Caricare i campioni su un gel di poliacrilammide SDS. Quindi procedere all'elettroforesi e al western blotting secondo il protocollo di testo.

Per eseguire l'analisi SDS-PAGE per MS, aggiungere 6,25 microlitri di tampone campione 4X a 18,75 microlitri di ciascun campione di eluizione ed eseguire i campioni su un gel SDS prefabbricato dal quattro al 20% fino a quando non migrano di due o tre centimetri nel gel. In una capsula di Petri da 15 centimetri, colorare il gel con la colorazione colloidale Coomassie Brilliant Blue G250. Utilizzare un bisturi pulito per asportare tutte le corsie per ciascun campione, esclusa la banda della streptavidina, e trasferire le bande asportate in provette da 1,5 millilitri per l'analisi MS.

Oltre alle proteine biotinilate endogene identificate in un esperimento BioID, split-BioID, le ulteriori bande principali osservate dal western blot sono le proteine di fusione che si auto-biotinilano, il che indica che le due proteine testate, in questo esempio Ago2 e TNRC6C o Ago2 e Dicer hanno interagito nelle cellule. Inoltre, i risultati del western blot indicano che avere una proteina di fusione NBirA*Ago2 accoppiata con fusioni CBirA* con TNRC6C o Dicer è più efficiente delle combinazioni opposte in cui CBirA*Ago2 è accoppiato con fusioni NBirA*delle altre due proteine. Inoltre, l'attivazione era specifica, in quanto nessuna delle fusioni di CBirA* poteva attivare la proteina di fusione di controllo NBirA*GFP a livelli apprezzabili.

Quando si esegue l'isolamento per la prima volta, tutte le fasi della purificazione devono essere analizzate mediante western blotting. Come illustrato qui, il legame con le perle dovrebbe essere quasi quantitativo e praticamente non si dovrebbero osservare perdite nei lavaggi. Quando il materiale eluito viene eseguito su un gel colorato con Coomassie dopo l'espressione proteica e la biotinilazione indotta, la banda più forte osservata si aggira a circa 17 kilodalton e corrisponde alla streptavidina monomerica.

L'area della corsia del campione al di sopra della banda della streptavidina nel pozzetto di caricamento viene tipicamente asportata per l'analisi MS. Durante l'applicazione di questa procedura a due determinate proteine, è importante testare diverse combinazioni di proteine di fusione. Infatti, abbiamo spesso osservato che l'efficienza complessiva della biotinilazione può dipendere strettamente da quale proteina viene aggiunta ai frammenti di BirA N o C terminali.

È altrettanto importante aggiungere almeno un controllo negativo, esperimenti split-BioID. Ad esempio, su una coppia di proteine interagenti che non sono correlate alla coppia di proteine di interesse. Seguendo questa procedura e la spettrometria di massa, l'analisi computazionale dovrebbe essere applicata per valutare i peptidi identificati rispetto agli esperimenti di controllo negativo.

Utilizziamo, ad esempio, i software MaxQuant e Perseus, sviluppati dai laboratori Cox e Mann di Monaco di Baviera, in Germania.