Name: Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Scopri il metodo split-BioID per analizzare i complessi proteici contesto-specifici in ambiente cellulare nativo. Questa tecnica consente di identificare interazioni proteiche dinamiche con elevata risoluzione.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca tedesco (DFG) attraverso l'iniziativa di eccellenza tedesco (CellNetworks DFG-EXC 81) e un finanziamento parziale dal centro di ricerca in collaborazione SFB638.

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<li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li>
<li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La procedura delineata descrive come clonare geni di interesse in Spalato-BioID plasmidi, come testare per biotinylation indotta da interazione e come isolare proteine biotinilate per analisi di spettrometria di massa. Descriviamo qui una procedura basata sulla trasfezione transiente. Mentre l'espressione delle proteine di fusione può essere regolato dalla quantità di dox aggiunto al medium, trasfezione transiente può portare all'espressione di proteine non omogenea con alcune cellule che iperesprimono grossolanamente le proteine di fusione rispetto all'endogena controparti. Questo può causare distorsioni dell'Interattomi corrispondente e al PPI che non rispecchiano fedelmente le interazioni che coinvolgono le proteine endogene. Così è in genere consigliabile costruire linee cellulari stabili una volta Spalato-BioID stabilita con il sistema transitorio. I plasmidi sono compatibili con il sistema di ricombinazione Flp-mediata e posizionare entrambi i geni di interesse ai sensi del regolamento dello stesso elemento tet-sensible a reagire. Se necessario e quando viene utilizzato con cellule di mammifero compatibili, consentono la facile creazione di linee cellulari stabilizzate inducibile. Ad esempio, usiamo la linea di HeLa-EM2-11 che esprime l'attivatore di trascrizione attivato da tetraciclina rtTA e un unico locus genomico indirizzabile da cui l'espressione genica di tetraciclina-mediata può essere strettamente regolato12. Utilizzare questa linea cellulare e ricombinazione Flp-mediata, linee cellulari stabili che contengono solo una copia del transgene possono essere ottenuti entro due-tre settimane. In alternativa, uno potrebbe anche utilizzare attuali tecniche di editing del genoma per introdurre i frammenti di BirA * nei nativi loci genomici dei geni di interesse.
Come in qualsiasi test che si basa sulla codifica una proteina, uno deve considerare se le proteine di fusione risultante sono funzionali. Dati disponibili nelle quali le proteine di interesse sono stata codificate (per esempio con GFP per gli studi di imaging) e funzionalmente testato sono utili per decidere se i frammenti di BirA dovrebbero essere clonato a Monte o a valle dei geni di interesse. Se tali dati non sono disponibili, uno dovrebbe testare N-terminalmente o C-terminali contrassegnati proteine in un'analisi funzionale. Ad esempio, l'attività delle proteine di fusione possa essere testato in una linea cellulare in cui la proteina endogena è stato eliminato e rispetto alla situazione di tipo selvaggio. Se le proteine di interesse tollerano entrambi i tag N - e C-terminale, entrambi devono essere testati. Infatti, in esperimenti di BioID, l'orientamento della proteina di fusione possa influenzare l'efficienza di etichettatura22. Inoltre, abbiamo osservato che quando l'applicazione di Spalato-BioID a una coppia di proteine, che delle due proteine viene aggiunto a entrambi i NBirA * o CBirA * frammento inoltre influenza l'efficienza di etichettatura9. Nei plasmidi di Spalato-BioID, l'16 amminoacido lungo glicina/serina ricco linker accoppiamento le proteine di interesse per i frammenti di BirA vennero presi da un altro PCA23 e ha lavorato per noi per tutte le proteine interagenti abbiamo testato finora. Tuttavia, si dovrebbe considerare che alcune coppie di proteine potrebbero funzionare meglio con linker più o meno lunghi. Della nota finale, un altro saggio è stato descritto dal gruppo Bollen24. In questo saggio, BirA * è diviso in un altro sito (E140/Q141) della nostra (E256/G257). Abbiamo testato entrambi sapori di Spalato-BioID side-by-side e trovato che E256/G257, descritti nel presente protocollo, porta alla riattivazione più forte quando accoppiati a due proteine interagenti9.
Generale uno svantaggio di questo metodo è la lenta velocità di etichettatura. In genere, il tempo di incubazione di 6-24 h con biotina è necessario ottenere apprezzabili biotinylation6, precludendo l'utilizzo di questa tecnica per lo studio della dinamica di rimodellamento dei complessi della proteina. Mentre questo test risolve parzialmente questo avvertimento come si attiva solo quando le due proteine interagiscono, la bassa velocità di etichettatura precludono l'uso per lo studio della risposta di processi molto dinamici o per analizzare le proteine di breve durata. La perossidasi derivati dal APEX2 è conosciuta per promuovere etichettatura efficiente delle proteine prossimale entro 1 min3. Un PCA basato su APEX2 così potrebbe affrontare le limitazioni della velocità d'etichettatura lenta di saggi BioID-derivato. Uno studio di prova-de-principio descritto un tale Spalato-APEX2 dosaggio25. Tuttavia, anche se una proteina di homodimerizing era con successo biotinilato, se l'analisi può anche essere usata per etichettare e identificare le proteine che assemblano intorno a una coppia di proteine interagenti resta da dimostrare. Molto recentemente, diretta evoluzione è stata utilizzata per creare TurboID e miniTurbo, due varianti di BirA * con attività migliorata che consentono a windows molto più breve di tempo a etichettatura, fino a 10 min26. Spalato-BioID per queste nuove varianti di adattamento estenderà ulteriormente l'uso di questa tecnica a un più ampio campo di applicazioni.

Funzioni più cellulari sono interpretato da proteine che assemblare dinamicamente complessi macromolecolari, l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (PPI) è uno sforzo maggiore nella ricerca biomedica. Infatti, PPI sono spesso liberalizzati nella malattia e rappresentare un potenziale bersaglio per terapie1. Metodo il più ampiamente usato per l'identificazione di PPI è l'approccio di purificazione (AP) di affinità in cui, a seguito di lisi delle cellule, una proteina di interesse viene purificata in particolare su una matrice e proteine associate vengono successivamente identificate mediante spettrometria di massa (MS). Mentre AP-MS è un approccio potente, in genere non esegue bene su complessi proteici scarsamente solubili, interazioni molto transitorie o PPI che richiedono una struttura subcellulare intatta. Inoltre, l'interpretazione dei dati può essere complicata dalla natura dinamica delle reti PPI, come una singola proteina è spesso parte di diversi complessi proteici distinti.
Tecniche di prossimità-etichettatura come BioID2 o APEX23,4 recentemente sono state sviluppate per risolvere alcune delle limitazioni degli approcci AP-MS. In BioID, l'enzima BirA * (corrispondente a una variante di G115R dell'enzima wild-type e. coli ) catalizza la formazione di biotynil-AMP labile (bio-AMP) che possono reagire con le ammine primarie. In contrasto con l'enzima di tipo selvaggio, che conserva bio-AMP nel suo centro attivo, BirA * rilascia bio-AMP permettendo la sua diffusione al suo ambiente limitrofo. Quindi, quando fusa ad una proteina di interesse ed espressa in cellule, proteine prossimale possono essere biotinilati entro un intervallo stimato di 10 nm5. Questi contrassegnati prossimali proteine sono quindi isolate da streptavidina pulldown e identificate da MS. Al contrario di AP-MS, BioID richiede l'espressione di una proteina di fusione. Solo così può essere applicato a proteine la cui funzione non è ostacolata da tagging. Inoltre, la velocità di etichettatura è lenta, in genere 6 – 24 h2,6, rendendo difficile il rilevamento delle proteine di breve durata. Eppure, rispetto ad AP-MS, BioID-MS offre parecchi vantaggi chiave: primo, la sua cattura le interazioni in ambiente nativo di cellulare; in secondo luogo, etichettate proteine piuttosto che complessi montati sono isolati dopo lisi cellulare; in terzo luogo, streptavidina pulldowns consentire l'utilizzo di buffer denaturante e condizioni di lavaggio difficili. Quindi, il metodo è più sensibile per rilevare transitori o interazioni deboli7 interazioni che si verificano su una specifica e difficile da isolare la struttura subcellulare8.
Tuttavia, la maggior parte delle proteine sono solitamente parte di più grandi complessi che possono rimodellare secondo stimoli cellulari o per la funzione che deve essere eseguita. Quindi, una singola proteina è in genere parte di diversi complessi, corrispondenti a distinte unità funzionali coinvolgendo distinte o sovrapposizione PPI. Entrambi gli approcci offrono una panoramica di tutte le associazioni che può avere una data proteina, ma non riescono ad affrontare il contesto di PPI individuali. Per aumentare la risoluzione di quest'ultimo, abbiamo progettato un test di complementazione di frammenti proteici (PCA) in cui due frammenti inattivi di BirA * (NBirA *, che contiene il dominio catalitico, e CBirA * che può essere visto come il dominio di riattivazione) può Rimontare in un enzima attivo quando portato in prossimità di due interagendo proteine9. Il dosaggio di Spalato-BioID risultante si concentra il biotinylation vicinanza-dipendente sulle proteine che assemblare intorno a una coppia di proteine interagenti e così permette l'identificazione del contesto gli assembly dipendenti della proteina. Recentemente abbiamo dimostrato la potenza di un'eccezionale risoluzione di Spalato-BioID risolvendo due distinte proteine complessi coinvolti nel miRNA-mediata silenziamento genico via9.
Complessivamente, in un'unica e semplice analisi, Spalato-BioID permette alla scoperta e in particolare assegnando PPI definiti unità funzionali in cui una data proteina è coinvolta, fornito che un ulteriore interazione della proteina della corrispondente proteina complessa è noto.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico (glaciale)</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td>Per fare il tampone TAE</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Prendere gel di TAE-agarosio per l'analisi e l'estrazione del DNA</td></tr><tr><td>Soluzione di ammoniaca 25% NH3</td><td>Bernd Kraft</td><td>6012</td><td>Per sciogliere la biotina</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td>Per selezionare i batteri trasformati</td></tr><tr><td>Bioruptor plus dispositivo di sonificazione</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Anche altri dispositivi di sonificazione sono ok</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>Da aggiungere al terreno di crescita per stimolare un'efficiente biotinilazione</td></tr><tr><td>Frazione di albumina sierica bovina V</td><td>Carl Roth</td><td>8076</td><td>Utilizzato nei tamponi Western blot e uno standard proteico nei saggi Bradford</td></tr><tr><td>Reagente Bradford Ultra</td><td>Expedeon</td><td>BFU05L</td><td>Qualsiasi altro metodo/kit per la determinazione delle proteine va bene, questo particolare reagente è più tollerante al detergente rispetto ad altri reagenti Bradford</td></tr><tr><td>Raschiatori cellulari</td><td>TPP</td><td>99002</td><td>Anche qualsiasi altro modello va bene</td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197</td><td>Enzima di restrizione per la clonazione nei plasmidi split-BioID (fusione NBirA*)</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td>Se si utilizza un'altra linea cellulare, utilizzare il corrispondente kit di miniprep del DNA del mezzo di crescita ottimale</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>PLN350</td><td>Qualsiasi altro kit va bene anche</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Applichem</td><td>A2951</td><td>Dox è sensibile alla luce</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Applichem</td><td>A2948</td><td>Prepara 1M soluzione stock, conservare a -20 &deg; C e utilizzare sempre</td></tr> la <tr><td>streptavidina coniugata DyLight 680</td> fresca <td>Thermo scientific</td><td>21848</td><td>da utilizzare con un dispositivo di scansione LiCor Western blot</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>Le perle C1 non sono rivestite di BSA, il che è preferibile per le applicazioni MS a valle (nessuna perdita di BSA nell'eluizione finale)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A5097</td><td>Preparare un stock da 500 mM, regolare il pH a 8 mentre si scioglie la polvere di EDTA</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>32205</td><td>Preparare una soluzione madre al 70% in cui la doxiciclina può essere disciolta a 10 mg.mL-1Fastgene</td></tr> <tr><td>Gel/PCR Kit di estrazione del DNA</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91302</td><td>Anche qualsiasi altro kit va bene</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td>Per regolare il pH della soluzione madre di biotina</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763</td><td>Preparare una soluzione madre da 500 mM, regolare il pH a 7,4</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-FL PVDF, 0,45&nbsp; &micro; m</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>Questa membrana mostra un'autofluorescenza minima se utilizzata con un dispositivo di scansione LiCor Western blot</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>12083</td><td>Realizzare una soluzione stock 5M</td></tr><tr><td>Sistema di imaging Odyssey CLx</td><td>LI-COR</td><td>N/A</td><td>Per scansionare la membrana Western blot decorata con anticorpi marcati con fluoroforo</td></tr><tr><td>Polietilenimmina lineare (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td>Anche qualsiasi altro reagente di trasfezione va bene</td></tr><tr><td>Latte in polvere</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>Per bloccare le membrane Western blot</td></tr><tr><td>MluI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3198</td><td>Enzima di restrizione per la clonazione nei plasmidi split-BioID (fusione NBirA*)</td></tr><tr><td>Na-desossicolato</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Produrre una soluzione madre al 10% (p/v)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>Produrre una soluzione madre 5M</td></tr><tr><td>NP-40 (sostituto Nonidet P40)</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td>Realizzare una soluzione madre al 20% (v/v)</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td>Enzima di restrizione per la clonazione nei plasmidi split-BioID (fusione CBirA*)</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td>Per lavare le cellule prima di rottamare</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560</td><td>Enzima di restrizione per la clonazione nei plasmidi split-BioID (fusione CBirA*)</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Aggiunto al tampone di lisi per prevenire le proteine degradazione</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90003</td><td>Plasmide Split-BioID, media la co-espressione di NBirA*-FKBP e CBirA*-FRB, FKBP e FRB possono essere sostituiti da altri due ORF</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90004</td><td>Plasmide Split-BioID, media la co-espressione di FKBP-NBirA* e CBirA*-FRB, FKBP e FRB possono essere sostituiti da altri due ORF</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_ Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90008</td><td>Plasmide Split-BioID, media la co-espressione di NBirA*-FKBP e FRB-CBirA*, FKBP e FRB possono essere sostituiti da altri due ORF</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90009</td><td>Plasmide Split-BioID, media la co-espressione di FKBP-NBirA* e FRB-CBirA*, FKBP e FRB possono essere sostituiti da altri due ORF</td></tr><tr><td>Q5 Kit PCR ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>E0555S</td><td>Amplificare la codifica ORF per le proteine da testare. Qualsiasi altra DNA polimerasi termostabile va bene.</td></tr><tr><td>Kit di legatura rapida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Per legare frammenti di DNA nei plasmidi split-BioID, qualsiasi altro sistema di legatura del DNA va bene.</td></tr><tr><td>RunBlue 4-20% SDS gel prefabbricati</td><td>Expedeon</td><td>BCG42012</td><td>Da utilizzare durante l'esecuzione di campioni per l'analisi MS</td></tr><tr><td>RunBlue LDS Sample Buffer</td><td>Expedeon</td><td>NXB31010</td><td>Buffer di corsa per i gel prefabbricati RunBlue</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>Viene fornito come una soluzione madre al 20%</td></tr> di <tr><td>siero senza tet</td><td>Biowest</td><td>S181T</td><td>utilizziamo siero privo di tet per ridurre al minimo l'espressione basale delle proteine di fusione</td></tr><tr><td>Sistema di trasferimento Trans-Blot Turbo</td><td>Bio-Rad</td><td>1704150</td><td>Sistema di trasferimento Western blotting ad alta velocità, anche qualsiasi altro sistema di trasferimento va bene</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855</td><td>Realizzare soluzioni stock 1M con pH adeguato (7,4 e 8)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975</td><td>Realizzare una soluzione stock al 20% (v/v)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>Utilizzato nei tamponi Western blot, Tween 20 porta a un'elevata fluorescenza di fondo e deve essere omesso nella fase di blocco e nell'ultima fase di lavaggio</td></tr></tbody></table>

split-bioid — analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Per completare la purificazione di affinità esistente (AP) e approcci per l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (PPI), sono stati introdotti gli enzimi che permettono l'etichettatura di prossimità-dipendente delle proteine in cellule viventi. Una tale enzima, BirA * (utilizzato nell'approccio BioID), media la biotinilazione delle proteine all'interno di un intervallo di circa 10 nm. Quindi, quando fusa ad una proteina di interesse ed espressa in cellule, permette l'etichettatura delle proteine prossimale nel loro ambiente nativo. Al contrario di AP che si basa sulla purificazione dei complessi della proteina assemblato, BioID rileva proteine che sono state contrassegnate all'interno delle cellule non importa se ancora stanno interagendo con la proteina di interesse quando sono isolate. Dal momento che biotinylates prossimale proteine, uno può inoltre sfruttare l'eccezionale affinità di streptavidina per biotina per isolarli in modo molto efficiente. Mentre BioID si comporta meglio di AP per identificazione transitori o interazioni deboli, entrambi gli approcci spettrometria di massa di AP e BioID forniscono una panoramica di tutte le possibili interazioni che può avere una data proteina. Tuttavia, non forniscono informazioni sul contesto di ogni PPI identificati. Infatti, la maggior parte delle proteine in genere fanno parte di diversi complessi, corrispondenti a maturazione distinti passaggi o diverse unità funzionali. Per risolvere questa limitazione comune di entrambi i metodi, abbiamo progettato un saggio di complementazione di frammenti proteici basato sull'enzima di BirA. In questo test, due frammenti di BirA * inattivi possono Riassemblare in un enzima attivo quando portato in prossimità di due proteine interagenti a cui essi sono fuse. Il dosaggio di Spalato-BioID risultante permette così l'etichettatura delle proteine che assemblano intorno a una coppia di proteine interagenti. Purché questi due interagire solo in un determinato contesto, Spalato-BioID quindi permette l'analisi di specifiche unità funzionali di contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Qui, forniamo un protocollo passo-passo per testare e applicare Spalato-BioID a una coppia di proteine interagenti.

Per illustrare il funzionamento di questo metodo, l'open reading frame (ORF) delle proteine Ago2, TNRC6C e Dicer (tutti i soggetti coinvolti nel gene miRNA-mediata del silenziamento via) sono stati clonati in plasmidi di Spalato-BioID. Ago2 è noto per interagire con TNRC6C all'interno di un indotto da miRNA silenziamento complesso (miRISC) che reprime la traduzione e stimolare il decadimento di destinazione mRNAs14. Prima di montare la miRISC, Ago2 interagire con Dicer, l'enzima che produce Mirna maturi, all'interno di un complesso in cui potrebbe ottenere caricato con un miRNA15. Spalato-BioID è stato quindi applicato alla coppia Ago2/Dicer o la coppia Ago2/TNRC6C. Per ogni coppia di proteine provate, Ago2 era sia fuso a NBirA * o CBirA * utilizzando nostro Spalato-BioID plasmidi (Figura 2) e il giocatore di dadi e TNRC6C a BirA cognate corrispondente * frammento. Inoltre, ogni proteina è stata fusa per CBirA * e accoppiato con un NBirA *-fusione di GFP come controllo negativo. In questo modo test quattro iterazioni per ogni coppia di testata della proteina (tabella 1).
Per verificare se Spalato-BioID è attivato sull'interazione della coppia di proteine provate, abbiamo seguito lo schema raffigurato in Figura 1. I plasmidi sono stati trasfettati in una linea di tet-sistema compatibile delle cellule HeLa. L'espressione delle proteine di fusione è stata indotta con doxiciclina (dox) e biotinylation è stata stimolata con l'aggiunta di biotina in eccesso al medium di crescita. A seguito di un periodo di incubazione di 20 h con dox e biotina, cellule erano lisate e analizzate mediante Western blotting con streptavidina coniugata per rilevare proteine biotinilate. In cellule di mammifero, due importanti bande musicali vengono in genere rilevati dalla streptavidina coniugata nel campione untransfected (Figura 3, stelle) e corrispondono alle proteine di biotinylated (molto probabilmente mitocondriali carbossilasi) in modo endogeno. Queste due bande sono presenti in tutti i campioni e possono essere comodamente utilizzate come carico interno controlli, quindi, la rilevazione di una proteina di pulizia per controllare il caricamento degli importi uguali di proteina è superflua. Tipico per un esperimento di BioID/Spalato-BioID, principali bande supplementari che possono essere osservate sono le proteine di fusione che ha auto-biotinilato. Anche se non sono visto senza altre proteine biotinilate, rilevazione biotinilazione delle proteine di fusione in questa fase già indica che le due proteine testate interagito nelle cellule. Nell'esperimento raffigurato in Figura 3, è chiaro che, avendo un NBirA *-proteina di fusione Ago2 accoppiata con CBirA * fusioni a TNRC6C o Dicer è più efficiente rispetto le combinazioni opposte in cui CBirA *-Ago2 è abbinato al NBirA * fusioni degli altri due proteine (Figura 3, pannello superiore, confrontare le intensità delle corsie 2-3 a corsie 6-7). Inoltre, l'attivazione era specifico come nessuno delle fusioni CBirA * potrebbe attivare il NBirA *-proteina di fusione GFP controllo a livelli apprezzabili (Figura 3, confronta i vicoli 1, 4-5 alla corsia 8 che corrisponde alle cellule untransfected). Poiché nel nostro plasmidi, NBirA * ha un tag di myc e CBirA * ha un tag di bandiera (Figura 2), i livelli di espressione di ogni proteina di fusione possono essere analizzati con gli anticorpi contro questi due tag (Figura 3, pannello inferiore).
Quando indotta da interazione biotinylation è osservato, l'esperimento può essere scalato, e le proteine biotinilate isolato su perle di streptavidina-accoppiato come indicato al paragrafo 4 del protocollo (Figura 4). Quando si esegue l'isolamento la prima volta, tutti i passaggi della purificazione possono essere analizzati da Western blotting (Figura 5). In genere, associazione ai talloni deve essere quasi quantitativa e praticamente nessuna perdita attraverso dovrebbe essere osservata nei lavaggi. Previo trattamento dei campioni per la spettrometria di massa, si consiglia di eseguire un Western blot per garantire indotto-biotinylation ha funzionato come previsto e che le proteine di fusione sono stati espressi. La mancanza di espressione di proteine di fusione è dovuto efficienza di trasfezione scadente o difettoso dox induzione. Se le proteine di fusione sono stati espressi ma nessun biotinylation è osservato, controllare se la biotina in eccesso (50 μM) è stata effettivamente aggiunta al medium e che la biotina stock è ancora attiva. Quando il materiale viene analizzato su un gel di proteina Coomassie-macchiato (Figura 6), in genere, la band più forte deve essere osservato viene eseguito al kDa circa 17 e corrisponde alla streptavidina monomerico. Bande corrispondenti alle proteine biotinilate endogeno e le proteine di fusione possono anche essere osservati. Asportiamo in genere l'area della corsia campione sopra la banda di streptavidina fino al caricamento ben (Figura 6). La band asportata può essere memorizzata in una provetta da 1,5 mL e inviata a un centro di spettrometria di massa. In alternativa, proteine rilegate possono anche essere tripsina-digerito le perline streptavidina-accoppiato e digeriti peptidi eluiti formano la colonna. Utilizziamo abitualmente i MaxQuant software16 (utilizzando principalmente i parametri predefiniti e aggiunta di lisina biotinylation come una possibile modificazione post-traduzionale, vedere riferimento 9 per ulteriori dettagli e per i risultati tipici di MS) per analizzare i dati grezzi di MS e il Perseo suite17 per la successiva analisi statistica, entrambi sono software libero. I campioni vengono in genere eseguiti in tre replicati biologici. Utilizzando quantificazione privo di etichetta, in particolare arricchito di proteine possono essere identificati in condizioni di controllo. Per filtrare in modo endogeno biotinilati proteine e proteine che non specificamente indicate per l'enzima di BirA, consideriamo solo proteine che sono significativamente sopra Risultati da sei set di dati generato con sei proteine non correlate. Inoltre, consideriamo solo i successi che si sono arricchite nel corso di un dataset di Spalato-BioID in cui le proteine di fusione NBirA * sono state sostituite da NBirA *-GFP. Altre strategie di analisi dei dati sono state proposte in particolare mediante etichettatura isotopo stabile con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (SILAC) per proteomica quantitativa18. Inoltre, sono state descritte diverse strategie per l'isolamento diretto di biotinylated peptidi usando una variante di streptavidina con affinità indebolito a biotina18, condizioni di eluizione speciale utilizzando solventi organici19 o biotina-specifiche gli anticorpi20,21. Mentre non necessariamente conduce alla scoperta di altre proteine, l'identificazione dei siti di biotinilazione aggiungere più fiducia per quanto riguarda la specificità dei successi e utile quando si sta occupando la topologia di un'interazione.
<img alt="Flusso di lavoro dell'analisi proteomica: Split-BioID, clonaggio, trasfezione, biotinilazione, MS, Western blot." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Panoramica della procedura Spalato-BioID. Proteina 1 interagisce con la proteina 2 come parte del complesso A o con proteina 3 come parte del complesso B. Per sondare in particolare la composizione del complesso A, Spalato-BioID può essere applicato alle proteine 1 e 2. La fotografia di uno spettrometro di massa è sotto una licenza Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported ed è stata scaricata da https://commons.wikimedia.org con il nome del file di ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Mappe plasmidiche di editing genico con siti di restrizione BamHI, MluI, ClaI; Diagramma per le configurazioni di clonazione." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: cassette di espressione dei plasmidi Spalato-BioID. Mettiamo a disposizione quattro plasmidi per consentire la verifica di tutte le combinazioni di NBirA * e CBirA * proteine di fusione. I plasmidi e mappe complete sono disponibili presso addgene.org sotto i numeri indicati. I plasmidi hanno un elemento tet-sensible a reagire (7 x tetO) e devono essere utilizzati in una linea cellulare che è compatibile con il sistema di espressione di tet. Si noti inoltre che in tutti i plasmidi del ORFs di FKBP e FRB sono fuse alla NBirA * e CBirA * frammenti rispettivamente. Queste due proteine interagiscono solo in presenza di rapamicina e quindi i plasmidi possono essere utilizzati per testare rapidamente il sistema in presenza o in assenza di questa chimica9. I siti di restrizione indicata sono unici. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Risultati dell'elettroforesi delle proteine; analisi western blot di Dicer, TNRC6C, Ago2 con anticorpi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: tipico Western blot per un esperimento di Spalato-BioID. Pannello superiore: la rilevazione delle proteine biotinilate con streptavidina fluorescente contrassegnato. Pannello inferiore: rilevamento delle proteine di fusione con gli anticorpi anti--Myc e anti-FLAG. Due coppie di proteine sono state testate: Ago2/TNRC6C e Ago2/Dicer. Nelle corsie 2 &amp; 3, Ago2 è stato aggiunto il frammento di CBirA. Nelle corsie 6 &amp; 7, Ago2 è stato aggiunto il frammento di NBirA. Nessun segnale significativo è stato osservato quando uno qualsiasi dei tre proteine sono stato combinato con NBirA *-GFP (corsie 1, 4-5). Le stelle indicano le bande corrispondenti in modo endogeno proteine biotinilate che possono fungere da controlli di carico interno. Questa figura è adattata da figura 5B di Schopp et al. 9 sotto una licenza Creative Commons Attribuzione 4.0 internazionale. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Flusso di lavoro di purificazione cellulare mediante biglie magnetiche; Risultati SDS-PAGE; Metodo di analisi delle proteine." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Panoramica della procedura di pulldown streptavidina. Passaggi principali per l'isolamento delle proteine biotinilate per analisi di spettrometria di massa sono raffigurati. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Risultato della purificazione delle proteine SDS-PAGE, interazione streptavidina coniugata, gel per elettroforesi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: tipico Western blot per un esperimento di pulldown streptavidina. Volumi di ogni campione indicato uguali sono stati caricati su un gel di SDS-poliacrilammide. A seguito di Western blotting, proteine biotinilate sono state rilevate con streptavidina HRP-accoppiato. Bande corrispondenti a NBirA *-TNRC6C e CBirA *-Ago2 sono indicati. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="SDS-PAGE gel, separazione delle bande proteiche, Split-BioID, streptavidina, marcatori di peso molecolare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: gel macchiato di Coomassie tipico proteina per l'analisi di spettrometria di massa. Campione eluito dalla streptavidina-accoppiato perline era caricato su un gel di proteina prefabbricati ed eseguire fino a quando il campione migrare 2-3 cm. La band principale vista al kDa circa 17 è streptavidina. L'area direttamente sopra quella banda è asportato e inviato a un centro di spettrometria di massa. Bande corrispondenti a NBirA *-TNRC6C e CBirA *-Ago2 sono indicati. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Campione di transfezione</td>
			<td colspan="3">Stato testato</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">Nessun transfezione</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Testato in genere condizioni applicando Spalato-BioID di due proteine.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer di sequenziamento</td>
			<td>sequenza</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer reverse cassetta 1 (CBirA * fusione)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer reverse cassetta 2 (NBirA * fusione)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Sequencing primers per i plasmidi di Spalato-BioID.

Forniamo un protocollo dettagliato per Spalato-BioID, un'analisi di frammenti-complementazione della proteina basata sulla tecnica di prossimità-etichettatura BioID. Attivato sull'interazione di due proteine specificate, permette l'analisi proteomica dei complessi della proteina contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Il metodo è semplice, economica e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio.

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sondare la composizione di complessi proteici che si assemblano specificamente attorno a una coppia di proteine interagenti di interesse utilizzando split-BioID, un saggio di complementazione di frammenti proteici che induce la biotinilazione proteica dipendente dalla prossimità all'interno delle cellule viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare, come ad esempio il modo in cui i complessi proteici si rimodellano dinamicamente per regolare diverse funzioni cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la facile identificazione di complessi proteici specifici del contesto nei loro ambienti cellulari nativi e con una risoluzione molto elevata.Per l'analisi finale della spettrometria di massa, i seguenti passaggi devono essere eseguiti in condizioni prive di cheratina e tutto il materiale e i reagenti devono essere il più possibile privi di cheratina. Dopo aver clonato gli ORF di due proteine di interesse nel plasmide split-BioID, aver effettuato la trasfezione transitoria e aver aggiunto un terreno integrato con biotina secondo il protocollo di testo, utilizzare PBS per lavare le cellule due volte. Aggiungere 1,5 millilitri di PBS a ciascuna piastra e utilizzare un raschietto per raccogliere le cellule, quindi trasferire le cellule per ogni condizione in una provetta separata da 15 millilitri e far girare le provette a 1, 200 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti.Rimuovere i surnatanti e congelare i pellet in azoto liquido. Quindi conservare i tubi a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione. Per preparare i lisati cellulari, utilizzare un millilitro di tampone di lisi RT per risospendere i pellet.Quindi passare le cellule attraverso un ago calibro 25 da 10 a 20 volte. Quindi sonicare i campioni. Quindi aggiungere 100 microlitri di Triton X-100 al 20% per 900 microlitri di lisato sonicato recuperato per una concentrazione finale del 2%Aggiungere 2,3 millilitri di Tris da 50 millimolari, pH 7,4, per millilitro di lisato per regolare la concentrazione di NaCl a 150 millimolari per legarsi alle perle di streptavidina.Quindi distribuire i lisati regolati in provette da 1,5 millilitri e centrifugarli a 16.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per dieci minuti. Trasferire i surnatanti in una provetta da 15 millilitri e conservare da 50 a 100 microlitri come materiale in ingresso. Per eseguire un pulldown con streptavidina, per ogni condizione trasferire 200 microlitri di sospensione di perle magnetiche accoppiate con streptavidina in un tubo da 1,5 millilitri.Posizionare le provette su un rack magnetico e attendere circa un minuto prima di rimuovere il buffer di conservazione. Con un millilitro di tampone di equilibratura lavare le perle mescolando delicatamente. Quindi spedisci uniformemente le perle equilibrate nel numero necessario di provette e riposizionale sulla rastrelliera magnetica.Dopo aver rimosso il tampone di equilibrio, risospendere ogni serie di perle con quantità uguali dei lisati cellulari corrispondenti. Quindi incubare i campioni a quattro gradi Celsius su una ruota rotante durante la notte. Il giorno successivo posizionare le provette su una rastrelliera magnetica.Attendere che le perle si attacchino al lato dei tubi e trasferire i surnatanti in un tubo da 15 millilitri etichettato come flusso attraverso. Con 200 microlitri di tampone di lavaggio, risospendere le perle in ciascun tubo e combinare ogni set di perle risospese corrispondenti a una condizione in tubi da 1,5 millilitri. Utilizzare un millilitro di tampone di lavaggio uno per lavare le perline due volte su una ruota rotante per otto minuti.Quindi eseguire due lavaggi ciascuno per i tamponi di lavaggio due, tre e quattro. Per assicurarsi che il tampone di lavaggio venga completamente eliminato dopo l'ultima fase di lavaggio, dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, centrifugare i campioni. Quindi rimettili sulla rastrelliera magnetica e rimuovi il tampone rimasto.Aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione alle microsfere, quindi incubare i campioni a 98 gradi Celsius per quindici minuti e spostare immediatamente le provette sul rack magnetico. Trasferire il campione eluito in una provetta nuova e conservare le provette a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Per ogni campione in ingresso, preparare un campione PAGE mescolando quantità uguali di proteine con il volume appropriato di tampone di caricamento SDS 3X in un volume totale di 28 microlitri.Quindi preparare i campioni PAGE mescolando cinque microlitri di ciascun campione di eluizione con 2,5 microlitri di tampone di caricamento SDS 3X. Caricare i campioni su un gel di poliacrilammide SDS. Quindi procedere all'elettroforesi e al western blotting secondo il protocollo di testo.Per eseguire l'analisi SDS-PAGE per MS, aggiungere 6,25 microlitri di tampone campione 4X a 18,75 microlitri di ciascun campione di eluizione ed eseguire i campioni su un gel SDS prefabbricato dal quattro al 20% fino a quando non migrano di due o tre centimetri nel gel. In una capsula di Petri da 15 centimetri, colorare il gel con la colorazione colloidale Coomassie Brilliant Blue G250. Utilizzare un bisturi pulito per asportare tutte le corsie per ciascun campione, esclusa la banda della streptavidina, e trasferire le bande asportate in provette da 1,5 millilitri per l'analisi MS.Oltre alle proteine biotinilate endogene identificate in un esperimento BioID, split-BioID, le ulteriori bande principali osservate dal western blot sono le proteine di fusione che si auto-biotinilano, il che indica che le due proteine testate, in questo esempio Ago2 e TNRC6C o Ago2 e Dicer hanno interagito nelle cellule. Inoltre, i risultati del western blot indicano che avere una proteina di fusione NBirA*Ago2 accoppiata con fusioni CBirA* con TNRC6C o Dicer è più efficiente delle combinazioni opposte in cui CBirA*Ago2 è accoppiato con fusioni NBirA*delle altre due proteine. Inoltre, l'attivazione era specifica, in quanto nessuna delle fusioni di CBirA* poteva attivare la proteina di fusione di controllo NBirA*GFP a livelli apprezzabili.Quando si esegue l'isolamento per la prima volta, tutte le fasi della purificazione devono essere analizzate mediante western blotting. Come illustrato qui, il legame con le perle dovrebbe essere quasi quantitativo e praticamente non si dovrebbero osservare perdite nei lavaggi. Quando il materiale eluito viene eseguito su un gel colorato con Coomassie dopo l'espressione proteica e la biotinilazione indotta, la banda più forte osservata si aggira a circa 17 kilodalton e corrisponde alla streptavidina monomerica.L'area della corsia del campione al di sopra della banda della streptavidina nel pozzetto di caricamento viene tipicamente asportata per l'analisi MS. Durante l'applicazione di questa procedura a due determinate proteine, è importante testare diverse combinazioni di proteine di fusione. Infatti, abbiamo spesso osservato che l'efficienza complessiva della biotinilazione può dipendere strettamente da quale proteina viene aggiunta ai frammenti di BirA N o C terminali.È altrettanto importante aggiungere almeno un controllo negativo, esperimenti split-BioID. Ad esempio, su una coppia di proteine interagenti che non sono correlate alla coppia di proteine di interesse. Seguendo questa procedura e la spettrometria di massa, l'analisi computazionale dovrebbe essere applicata per valutare i peptidi identificati rispetto agli esperimenti di controllo negativo.Utilizziamo, ad esempio, i software MaxQuant e Perseus, sviluppati dai laboratori Cox e Mann di Monaco di Baviera, in Germania.

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Purificazione di affinità di proteine ​​marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine ​​e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il...

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Abbiamo stabilito un metodo per la purificazione di proteine ​​di interazione coregolamentazione utilizzando il sistema LC-MS / MS.

Una proteina metodo di preparazione per l&#39;high-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Questo manoscritto descrive il protocollo per purificazione di affinità complementazione bimolecolare (BiCAP). Questo metodo novello facilita l'isolamento specifico e caratterizzazione proteomica a valle di qualsiasi due proteine interagenti, mentre escluse ONU-complessato singole proteine, nonché complessi formati con concorrenti partner di legame.

Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Per la profilazione complesso ad alta risoluzione viene presentato un versatile protocollo BN-MS crioscillante utilizzando un microtoma.

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Descritto qui è un metodo di etichettatura di prossimità per l'identificazione dei partner di interazione del dominio TIR del recettore immunitario NLR nel tessuto fogliare di Nicotiana benthamiana. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'identificazione delle interazioni tra altre proteine di interesse utilizzando questa tecnica nella Nicotiana e in altre specie vegetali.

Etichettatura di prossimità basata su turboid per in Planta identificazione di reti di interazione proteina-proteina

La Biotinilazione potenziata per illuminazione limitata a posizione specifica AviTag (ALIBi) è un nuovo metodo optogeneticamente attivato sviluppato per il marcatore e la purificazione di affinità delle popolazioni subcellulari di ribosomi per sequenziamento a valle e analisi proteomiche.

Isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

Il protocollo presenta un metodo per l'attaccamento covalente in vivo della biotina alle proteine in base alla loro vicinanza a una biotina ligasi fusa a una proteina di interesse. Questa modifica consente un arricchimento selettivo delle proteine utilizzando perle di streptavidina come necessario negli studi di interazione proteica.

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Scopri il metodo split-BioID per analizzare i complessi proteici contesto-specifici in ambiente cellulare nativo. Questa tecnica consente di identificare interazioni proteiche dinamiche con elevata risoluzione.

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

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