Name: Identificazione di complessi proteici in Escherichia coli Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Scopri l'identificazione di complessi proteici in Escherichia coli mediante purificazione per affinità sequenziale e spettrometria di massa tandem. Questo metodo consente di isolare interazioni proteiche anche da proteine a bassa abbondanza.

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Questo lavoro è stato finanziato con fondi della Fondazione canadese per l&#39;innovazione, Genome Canada, l&#39;Ontario Genomics Institute, il Ministero della Innovazione, e il Canadian Institutes of Health Research sovvenzione JG e AE The Red-esprime E. coli ceppo DY330 è stato un gentile dono da Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).

1. Costruzione di Gene-specifica SPA-tagging in E. coli DY330 Strain <ol><li> Il plasmide che comprende il pJL148 SPA-tag sequenza di DNA e l&#39;antibiotico kanamicina cassetta marcatore di resistenza (Kan R) sono usati come stampo nella reazione a catena della polimerasi (PCR) 7. A 45 nt gene-specifico primer forward, situata immediatamente a monte del codone di stop gene bersaglio in frame con un bp 27 (&#39;5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) innesco tag specifica avanti, e un 45 nt gene-specifico primer reverse, situata immediatamente a valle del codone di stop gene bersaglio in frame con un 27 bp (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) primer reverse tag specifica, sono utilizzati per amplificare la SPA-tag e Kan cassette R dalla pJL148 utilizzando le seguenti condizioni di ciclo di PCR: 94 ° C per 5 min, 30 cicli di 94 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 min, 68 ° C per 2 min 10 sec, seguito da 68 ° C per 10 min. Queste sequenze amplificate servire uns substrati per la ectopicamente introdotto λ-Red macchine ricombinazione omologa (vedi sotto). </li><li> Il prodotto PCR viene purificato usando un kit di purificazione Qiaquick PCR per rimuovere i sali che possono interferire con l&#39;elettroporazione. Il prodotto di PCR purificato viene successivamente destinato ad integrare alla estremità 3 &#39;(immediatamente a monte del codone di stop nativo) di un gene specifico in DY330 ceppo in cui viene espresso il Red-λ macchine ricombinazione 10. </li><li> Il DY330 λ-Red ceppo che esprime è cresciuto durante la notte in 2 ml di Luria-Bertani (LB) medio a 32 ° C agitando a 180 giri al minuto. 1 ml della coltura overnight viene successivamente inoculato in 70 ml di terreno LB fresco in beuta da 500 ml. L&#39;inoculo è cresciuto a 32 ° C agitando a 180 rpm fino OD 600 raggiunge ~ 0,8. </li><li> La coltura viene trasferito in una nuova beuta da 250 ml, in cui le cellule sono indotte incubando il pallone in un bagno di acqua a 42 ° C agitando delicatamente a180 rpm per 15 min. Immediatamente dopo l&#39;induzione, il pallone viene incubato in un bagno di ghiaccio slurry acqua per almeno 30 minuti con agitazione. </li><li> La gelida coltura viene immediatamente trasferito in pre-raffreddata tubo da 50 ml in polipropilene e sottoposta a centrifugazione a 3993 xg per 6 minuti a 4 ° C. Il pellet viene risospeso in 50 ml di acqua ghiacciata sterile e centrifugato di nuovo a 3993 xg per 6 minuti a 4 ° C. Il pellet viene risospeso in 1 ml di acqua fredda e trasferito in una provetta 1,5 ml Effendorf, e centrifugato a velocità massima per 20 sec a 4 ° C. Dopo due o tre fasi di lavaggio con acqua gelata, il pellet viene risospeso in 700 finalmente pl di acqua ghiacciata sterile, con conseguente elettro-cellule competenti. </li><li> Tramite elettroporazione, uno microlitri dell&#39;amplicone purificato viene introdotto in 40 ml di elettro-cellule competenti. Le cellule sono elettroporazione in un Bio-Rad GenePulser II con le seguenti impostazioni: 2,5 kV, 25 uF con polsocontrollore di 200 Ω. Dopo ricombinazione omologa e integrazione, i trasformanti che ricombinano con successo il tag / cassetta nel cromosoma sono selezionati in base alla resistenza a Kan (Figura 1A). Trasformanti più sono selezionati per Western blotting per verificare la corretta generazione (cioè segnale positivo) di SPA-tagged proteine ​​di fusione con anticorpo anti-FLAG M2 che è selettiva contro gli epitopi di bandiera della SPA-tag. </li><li> Confermato carbossi terminale SPA-tag ceppo di fusione viene coltivato su larga scala per isolare complessi proteici solubili da cellule raccolte utilizzando il protocollo di purificazione SPA. Lo schema delle fasi coinvolte nella procedura di purificazione di affinità tag è mostrato in Figura 1B. </li></ol> 2. Coltura e sonicazione <ol><li> Inoculare 100 pl di una SPA-tag E. glicerolo magazzino coli in 50 ml di brodo di eccezionale (TB) liquido integrato con 50 microlitri di 25 mcg / ml of soluzione Kan in una beuta da 250 ml. Far crescere la coltura durante la notte a 32 ° C. Nota: Poiché la temperatura-inducibile cassette λ Red in ceppo DY330 è sotto il controllo di un sensibile alla temperatura 10 repressore, il SPA-etichettato ceppo di E. coli è cresciuto a 32 ° C. </li><li> Trasferire 10 ml della coltura durante la notte in 990 ml TB fresco supplementato con 25 ug / ml di Kan in un pallone 4 litro. La cultura è cresciuta a 32 ° C con agitazione costante a 250 rpm, da 5 a 6 ore, fino a quando la OD 600 raggiunge ~ 2 a 3. </li><li> Trasferire 1 litro E. coli SPA-tag cultura per pulire le bottiglie di centrifugazione e far girare le cellule a 4 ° C in Beckman J6-HC centrifuga @ 3993 xg per 15 min. </li><li> Il supernatante viene rimosso dalle bottiglie di centrifugazione. Risospendere la E. Pellet cellulari coli con 25 ml di tampone di sonicazione. Assicurarsi di mantenere le bottiglie centrifugazione su ghiaccio in ogni momento. </li><li> Il pellet risospeso ètrasferito a tubo da 50 ml in polipropilene Falcon e congelato in azoto liquido. Le cellule vengono congelate a -80 ° C per uso a lungo termine. </li><li> Prima di sonicazione, le cellule congelate scongelare completamente mantenendo i pellets in ghiaccio. I campioni scongelati vengono trasferiti a una tazza sterile acciaio inox posto sul ghiaccio per sonicazione. La sonda è immersa nel campione e sonicata per 3 min. Un ulteriore 2 min si lascia raffreddare il campione dal surriscaldamento. </li><li> Il lisato cellulare viene sonicato trasferita nel pre-raffreddata tubo di centrifugazione sterile, e sottoposta a centrifugazione a 4 ° C in una centrifuga Beckman con rotore JA-17 @ 35.267 xg (16.000 rpm) per 15 min per due volte. Nota: Nel caso della purificazione di proteine ​​di membrana, il lisato cellulare viene centrifugata sonicato solo una volta per 15 minuti perché non sapere in quale frazione delle proteine ​​di membrana sono, cioè, sia in pellet o nel surnatante. Quindi, per evitare la perdita di eccesso di memproteine ​​brane, ruotiamo le cellule per 15 min a centrifugazione ad alta velocità e il supernatante viene successivamente elaborato per la purificazione (vedere i passi sotto) dove 1% detersivo viene utilizzato per solubilizzare le proteine ​​di membrana. </li><li> Il supernatante dal tubo di centrifugazione viene accuratamente trasferita ad una provetta di polipropilene da 50 ml Falcon e congelati in azoto liquido. L&#39;estratto sonicato cella congelato viene immagazzinato per un periodo massimo di 6 mesi a -80 ° C per utilizzo futuro. </li></ol> 3. Affinity Purification <ol><li> Prima dell&#39;uso, 100 pl di perline M2 anti-FLAG sono lavati da 10 volumi di AFC tampone (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% di detergente, e 0,1-0,5 mM TCEP [tris (2-carbossietil) fosfina - acido cloridrico]) senza il detersivo e l&#39;agente riducente TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina). </li><li> Il congelato, estratto cellulare viene sonicato scongelato ponendo la provetta in acqua fredda. L&#39;estratto cellulare scongelato è incubato con 3 ml di benzonase nucleasi per 30 min a 4 ° C. A questa miscela, aggiungere detergente non ionico Triton X-100 (concentrazione finale del detersivo dovrebbe essere 0,1%) e 200 microlitri di sospensione anti-FLAG M2 perle agarosio. Nota: Per tutte le purificazioni di proteine ​​solubili, 0,1% Triton X-100 viene usato per minimizzare adsorbimento non specifico, dove, come per purificare una proteina di membrana, diversi lievi detergenti non ionici, come C12E8 (Octaethylene dodecil etere glicole), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltoside) e maltosio-neopentil glicole (MNG) può essere impiegato ad una concentrazione di detersivo 1% per migliorare solubilizzazione. Dal detersivi diversi hanno un diverso grado di efficienza solubilizzazione delle proteine ​​di membrana, si consiglia di eseguire purificazioni di proteine ​​indipendenti utilizzando più di un detersivo. </li><li> Il contenuto viene miscelato delicatamente ruotando il tubo per 3 ore a 4 ° C usando un agitatore LabQuake. Dopo 3 ore di rotazione, il tubo viene centrifugato a 1700 xg per 6 min. Il supernatante è quindi removed attenzione, per quanto possibile, senza disturbare il pellet sciolto tallone. </li><li> Il pellet viene risospeso nel supernatante residuo e quindi trasferita in un 0,8 x 4 centimetri Bio-Rad colonna polipropilene prep. Assicurarsi di rimuovere i tappi scarico di fondo della colonna, per consentire gli eluati di drenare dal flusso di gravità. Lavare la colonna con la fase 5 volte scissione TEV. </li><li> Dopo lo scarico eluati lavate, scarico di fondo della colonna viene chiusa. Alla stessa colonna, clivaggio viene eseguito aggiungendo ~ 5 per 10 microlitri (50 unità) di proteasi TEV e 400 pl di tampone 1X AFC sulla colonna. Garantire per chiudere la parte superiore della colonna con un tappo. La colonna contenente le microsfere vengono ruotate delicatamente la notte a 4 ° C per una notte con un agitatore LabQuake. </li><li> Rimuovere il tappo sulla parte superiore e il tappo di scarico nella parte inferiore della colonna, e drenare gli eluati recuperati dopo clivaggio TEV in una colonna di fresco contenente 200 ml di sospensioni calmodulina-sefarosio perline, che viene lavato con 10volumi di tampone calmodulin vincolante. </li><li> Sia la parte superiore e la parte inferiore della colonna sono fissate saldamente, e il contenuto della colonna sono mescolati delicatamente ruotando per 3 ore a 4 ° C usando un agitatore LabQuake. </li><li> Dopo 3 ore di rotazione, l&#39;eluato viene drenato rimuovendo il tappo superiore e il tappo di fondo della colonna. La colonna viene lavata quattro volte con 200 pl di tampone 1X calmodulina vincolante seguito da un lavaggio stringente con 400 microlitri di tampone di lavaggio calmodulina. </li><li> La proteine ​​viene eluita in quattro frazioni di 50 pl in una nuova provetta Eppendorf con 1X tampone di eluizione calmodulina. La frazione eluita è distribuito in due provette Eppendorf puliti in volumi uguali. Entrambi i tubi vengono successivamente essiccate utilizzando un vuoto velocità. </li><li> L&#39;eluato essiccato da una provetta viene utilizzato per l&#39;esecuzione di un gel colorazione con argento, mentre l&#39;altro è memorizzato in -80 ° C, prima di utilizzare la spettrometria di massa. </li></ol> 4. Argento colorazione <ol><li> Per argento staining, metà del volume 3X SDS (sodio dodecil solfato) tampone campione viene aggiunto a 50 ml di eluato essiccato. Dopo l&#39;ebollizione della miscela per 5 minuti, i campioni vengono caricati su un gel di poliacrilammide SDS. </li><li> Dopo che il gel ha terminato l&#39;esecuzione, viene accuratamente messi in soluzione di fissaggio (50% metanolo e 10% di acido acetico) e agitata delicatamente su un agitatore rotante per 20 min. Il gel viene lavato in etanolo al 20% per 10 min. </li><li> Il gel viene lavato due volte fissa accuratamente con 500 ml di acqua bidistillata per 10 min per garantire un basso background uniforme. </li><li> Il gel viene poi agitate leggermente in 500 ml di sodio-tiosolfato per 1 min, seguito da due lavaggi con acqua distillata per 20 sec. </li><li> L&#39;acqua viene scartato, e il gel viene incubato in 200 ml di nitrato d&#39;argento 0,1% per 30 min. Dopo questo periodo, il nitrato d&#39;argento viene rimosso e il gel viene lavato con acqua distillata per 20 secondi per rimuovere l&#39;eccesso di nitrato d&#39;argento. </li><li> Il gel viene infine mano agitato in 75 mldella soluzione di sviluppo. Quando l&#39;intensità desiderato è raggiunto, la soluzione di sviluppo è scartato e 80 ml di acido acetico viene aggiunto per arrestare la reazione. Garantire incubare il gel in acido acetico per un minimo di 20 minuti per la visualizzazione corretta di bande di gel. </li></ol> 5. Proteolisi e preparazione del campione per Spettrometria di Massa <ol><li> Al campione essiccato, aggiungere 50 microlitri di tampone di digestione e 0,9 ml di 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carbossietil) fosfina - acido cloridrico) e incubare la miscela per 45 min a temperatura ambiente per la fase di riduzione. Successivamente, 1 ml di 500 mM iodoacetamide viene aggiunta e incubata in un altro buio per 40 min per permettere alchilazione campione. </li><li> Dopo la seconda fase di incubazione, aggiungere 1 ug di tripsina immobilizzata alla miscela e incubare sia a 37 ° C per 5 ore o per una notte a temperatura ambiente. Garantire per arrestare la reazione aggiungendo 1 ml di acido acetico. </li><li> Pre-bagnare la Millipore Zip-Tip puntale aspirando 10 ml della soluzione di bagnatura e di equilibrio. Dispensare la soluzione ai rifiuti. Successivamente aspirare 10 pl della soluzione di lavaggio e di erogare la soluzione ai rifiuti. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Per il legame efficace della miscela peptide alla punta, pipetta mescolare la miscela peptidica 20 volte. La miscela peptide che aderisce alla punta viene lavato via da aspirare e dispensare la soluzione di lavaggio. Ripetere questa procedura due volte per il legame efficiente della miscela peptide alla punta. </li><li> Con la punta contenente il peptide legato, aspirare 10 pl della soluzione di bagnatura e di equilibrazione, e distribuire in una provetta eppendorf pulita. Ripetere questa operazione due volte. Dopo essiccazione i campioni eluiti a vuoto velocità, i campioni possono essere analizzati immediatamente mediante spettrometria di massa o conservati a -80 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol> 6. L&#39;identificazione delle proteine ​​da LTQ Orbitrap Velos spettrometro di massa Thcomponenti elettronici polipeptidiche dei complessi isolati sono identificati utilizzando un LTQ Orbitrap Velos ibrido spettrometro di massa tandem. Il Orbitrap ha eccezionale potere di risoluzione (&gt; 60.000 completa Mezza Larghezza massima, o FWHM) e accuratezza di massa (&lt;2 ppm), che riduce al minimo MS / MS di campionamento di irrilevanti non specifici contaminanti sfondo rilevati in purificazioni di controllo, mentre l&#39;elevata velocità Velos trappola di ioni componente in grado di rilevare e peptidi abbondanza frammento bassi utilizzando sia il trasferimento di elettroni e dissociazione indotta da collisione modalità di dissociazione. Incontri di alta fiducia tra conseguente MS / MS sono mappati di riferimento E. sequenze proteiche coli con algoritmo di ricerca di database come SEQUEST e ogni sequenza di corrispondenza valutato nel corso di un algoritmo di probabilità come STATQUEST 11. Il numero totale di spettri, unicità sequenza peptidica e contaminanti sfondo comuni rilevati nel controllo negativo (vale a dire. Finto) purificazioni sono considerati per ottenere una bassa empirico falso-discupero tasso. Le seguenti operazioni vengono eseguite per l&#39;identificazione delle proteine: <ol><li> Le micro-colonne sono confezionati con ~ 10 cm di 3 micron Luna-C 18 e resina sono interfacciati ad una fonte di ioni Proxeon nanoelectrospray che è posto in linea con lo strumento Orbitrap. </li><li> Un flusso Proxeon nano pompa binaria HPLC vengono usati per fornire uno stabile flusso di punta ~ 300 nl min -1 durante le separazioni peptidici. </li><li> Per raggiungere eluizione peptide, un gradiente di tampone organico è impostato in funzione della complessità del campione. Ad esempio, il seguente gradiente è tipicamente configurato per E. campioni SPA coli: solvente B è aumentato dal 2% al 6% in 1 minuto, al 24% in 38 minuti, al 100% nel prossimo 4 min, detenuta al 100% per 1 minuto, per poi scendere al 2% nel 1 min, e finale premuto al 2% per 15 min. La fase mobile solvente A ha il 95% di acqua gradiente HPLC e il 5% ACN con 0,1% di acido formico, mentre il solvente B ha il 5% di acqua gradiente HPLC e il 95% ACN con 0,1% formico acid. La portata alla punta dell&#39;ago è impostata a 300 nl min -1 per 60 min. </li><li> Come i cicli di spettrometro di massa eseguito attraverso una scansione completa di massa a 60.000 risoluzioni, 10 concomitanti tandem scansioni di massa di frammentazione sono raccolti per le ioni precursori più intense. Esclusione dinamica, selezione massale monoisotopico, e in tempo reale i dati che dipendono dalla caratteristiche dello strumento di acquisizione sono abilitate. </li><li> Gli spettri sono cercati utilizzando un algoritmo di ricerca del database come SEQUEST contro un database di E. sequenze proteiche coli, e il risultato è statisticamente filtrati utilizzando un algoritmo di probabilità come STAQUEST 11 per garantire un basso tasso di scoperta false. Solo la fiducia elevato (99% di probabilità) i candidati sono selezionati, mentre l&#39;incontro che mostra più di 10 ppm di errore di massa rispetto alla massa peptide teorica vengono eliminati da ulteriori considerazioni. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un aspetto fondamentale della ZPS approccio APMS descritto qui è che la codifica viene effettuata all&#39;interno del contesto naturale cromosomica, in modo da garantire la normale regolazione genica è mantenuto (ad esempio. Promotore esca nativo conservati, quindi i livelli di espressione non è perturbato) e nativo stabilmente associata a complessi proteici sono recuperati a quasi livelli endogeni. Questioni polarità operone inoltre sono evitati includendo un promotore rivolto all&#39;esterno nel marcatore sel...

<table><tbody><tr><td colspan="4">I. Antibiotici</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Bioshop</td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Bioshop</td><td>#AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Brodo formidabile medio</forte></td></tr><tr><td>Bio-Triptone</td><td>Bioshop</td><td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Bioshop</td><td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Bioshop</td><td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 303</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Ceppo batterico e plasmide</td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu et al. (2000)10</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>Zeghouf et al. (2004)7</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Reagenti per PCR ed elettroforesi</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 tampone PCR</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Caricamento colorante</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>bromuro di etidio</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X tampone TBE</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>acido borico</td><td>Bioshop</td><td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>scala</td><td>DNA NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5. Kit di isolamento e pulizia dei plasmidi</td></tr><tr><td>Kit midi plasmidici</td><td>Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>#28104<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">6. Apparecchiature per PCR e trasformazione</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>BioRad</td><td>iCycler</td><td></td></tr><tr><td>Elettroforesi su gel di agarosio</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulser II</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione da 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg; C agitatore a bagnomaria</td><td>Innova 3100</td><td></td>Beckman Coulter TJ-25 centrifuga Beckman Coulter TS-5.1-500 32 gradi <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> C Agitatore</td><td>New Brunswick Scientific, Stati Uniti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 C grande agitatore</td><td>New Brunswick Scientific, Stati Uniti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 Incubatore a piastre C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">7. Elettroforesi e Western blotting</forte></td></tr><tr><td>Acrilammide monomero, N,N'- metilenebis-acrilammide</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0125</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Bioshop</td><td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>n-butanolo</td><td>Sigma</td><td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td><td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman No. 1 carta da filtro</td><td>Fischer Scientific</td><td>#09-806A</td><td></td></tr><tr><td>Mini proteiforme a 3 cellule</td><td>Bio-Rad</td><td>#165-3301</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di trasferimento del gel iBlot</td><td>Invitrogen</td><td>#IB1001</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosiche</td><td>Bio-Rad</td><td>#162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Anti-Flag M2</td><td>Sigma</td><td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>Perossidasi di rafano</td><td>Amersham</td><td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td>Pre-colorato standard di peso molecolare delle proteine</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di chemiluminescenza</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>Film per autoradiografia</td><td>Clonex Corp</td><td>#CLEC810</td><td></td></tr><tr><td>Quick Draw carta assorbente</td><td>Sigma</td><td>#P7796</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore a dondolo con piattaforma C2</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"><forte>8. Apparecchiature e reagenti per la sonicazione</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">9. Reagenti e apparecchiature per la purificazione di affinità</td></tr><tr><td>0,8 x 4 cm Colonna in polipropilene Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>#732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasi nucleasi</td><td>Novagen</td><td>#70746</td><td></td></tr><tr><td>Perle di agarosio Anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>Perle di calmodulina-sefarosio</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>TEV proteasi</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake Shaker</td><td>Thermolyne</td><td>#59558</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10. Reagenti per la colorazione dell'argento</forte></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Bioshop</td><td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Bioshop</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>Sodio-tiosolfato</td><td>Sigma</td><td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato d'argento</td><td>Fischer Scientific</td><td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Bioshop</td><td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato</td> <td>di sodioBioshop</td><td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">11. Reagenti e apparecchiature per l'identificazione delle proteine </forte></td></tr><tr><td>tripsina oro, grado di spettrometria di massa</td><td>Promega</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH4HCO3</td><td>Bioshop</td><td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Formico acido</td><td>Sigma</td><td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>acqua di grado HPLC</td><td>Sigma</td><td>#95304</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>#16125</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Zip-Tip</td><td>Millipore</td><td># ZTC18M960</td><td></td></tr><tr><td>~10 cm di 3 &mu; m Luna-C18 resina</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon nano pompa HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos spettrometro</td><td></td> di massa <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">12. Flaconi</td></tr> <tr>conici da 4 litri VWR#><89000-372 <td>Flaconi conici</td> da 50 ml <td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td> Any <td>Vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flak conici da 250 ml</td><td>VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>Provette sterili per coltura da 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>VWR</td><td>#479-3221-80</td><td></td></tr><tr><td> C congelatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di vuoto a velocità</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tamponi e soluzioni 1. 1 litro di brodo terrificante (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g di estratto di lievito 2% di glicerolo 50 ml di brodo di sale di potassio soluzione 2. Soluzione madre di sale di potassio 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Tampone di sonicazione 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% glicerolo Prima dell'uso aggiungere l'inibitore della proteasi (PI) e 0.1-0.5 mM TCEP 4. Tampone AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergente Prima dell'uso aggiungere PI e 0.1-0.5 mM TCEP 5. Tampone di scissione TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergente Prima dell'uso aggiungere PI e 0.1-0.5 mM TCEP 6. Tampone legante la calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergente Prima dell'uso aggiungere PI e 0.1-0.5 mM TCEP 7. Tampone di lavaggio Calmodulina 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Tampone di eluizione della calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Soluzione di sviluppo (1L) 37% Formaldeide 30 g di carbonato di sodio 1000 ml di acqua distillata 10. Tampone di digestione 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Soluzione di bagnatura ed equilibratura 70% acetonitrile (ACN) in acido formico allo 0,1% 12. Soluzione di lavaggio 100% H2O in acido formico 0,1%</td></tr></tbody></table>

identificazione di complessi proteici in<em&gt; escherichia coli</em&gt; con sequenziale purificazione per affinità peptide in combinazione con tandem mass spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Dal momento che la maggior parte dei processi cellulari sono mediate da assemblee macromolecolari, l&#39;identificazione sistematica delle interazioni proteina-proteina (PPI) e l&#39;identificazione della composizione subunità di multi-proteina complessi può fornire indicazioni in funzione del gene e migliorare la comprensione dei sistemi biologici 1, 2. Interazioni fisiche possono essere mappati con alta fiducia vialarge scala isolamento e caratterizzazione di complessi proteici endogeni in quasi fisiologiche condizioni basate su affinità purificazione di proteine ​​cromosomicamente-tag in combinazione con la spettrometria di massa (APMS). Questo approccio è stato applicato con successo in organismi evolutivamente diverse, tra cui il lievito, mosche, vermi, cellule di mammifero, e batteri 1-6. In particolare, abbiamo generato un carbossi-terminale di affinità sequenziale Peptide (SPA) a doppio sistema di etichettatura per l&#39;affinità per la purificazione complessi proteici autoctoni coltivati ​​gram-negativi Escherichia coli, con genetically-trattabili ospitanti ceppi di laboratorio che sono particolarmente adatti per genoma indagini della biologia fondamentale e processi di conservazione di procarioti 1, 2, 7. Nostro SPA-tagging sistema è analogo al metodo di purificazione per affinità tandem originariamente sviluppato per il lievito 8, 9, e consiste di un legame peptidico calmodulina (CBP) seguito dal sito di clivaggio per la proteasi altamente specifico tabacco virus etch (TEV) e tre copie del FLAG epitopo (FLAG 3X), che consente per due turni consecutivi di arricchimento affinità. Dopo l&#39;amplificazione cassetta, prodotti lineari sequenza-specifici della PCR che codifica per la SPA-tag e marcatore di selezione sono integrati ed espressi in cornice come carbossi-terminali fusioni in uno sfondo DY330 che è indotto ad esprimere transitoriamente un efficientissimo sistema di ricombinazione eterologa batteriofago lambda 10. Successiva dual-fase di purificazione utilizzando calmodulina e anti-FLAG perline affinità consente altamente selettivoe il recupero efficiente anche di complessi proteici a basso abbondanza di grandi culture. Spettrometria di massa tandem viene quindi utilizzato per identificare i stabilmente co-purificare proteine ​​con elevata sensibilità (bassi limiti di rilevazione nanogrammi). Qui, descriviamo dettagliate passo-passo le procedure usiamo comunemente per la codifica sistematica delle proteine, purificazione e di spettrometria di massa basata su analisi dei complessi proteici solubili da E. coli, che possono essere messe in scala e potenzialmente su misura per altre specie batteriche, tra cui alcuni patogeni opportunisti che sono suscettibili di recombineering. Le interazioni risultanti fisiche possono spesso rivelare interessanti elementi inaspettati e le connessioni che suggeriscono nuovi collegamenti meccanicistici. L&#39;integrazione dei dati PPI con alternate dati di associazione molecolare come genetiche (gene-gene) interazioni e genomico-contesto (GC) previsioni può facilitare spiegazione della organizzazione globale molecolare di multi-proteina complessi all&#39;interno di bipercorsi gici. Le reti generate per E. coli può essere utilizzato al fine di conoscere l&#39;architettura funzionale di prodotti genici ortologhi in altri microbi per le quali le annotazioni funzionali attualmente mancano.

Una volta purificati per affinità, da colture in fase esponenziale, i proteine esca marcate espresse a livelli endogeni, i campioni sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel colorato con argento per visualizzare i singoli componenti polipeptidici dei complessi stabili isolati. Abbiamo inoltre sottoposto una seconda aliquota dei campioni proteici purificati per affinità a spettrometria di massa tandem senza gel (LCMS) per identificare le corrispondenti sequenze polipeptidiche. L'efficacia di questa procedura APM...

Purificazione di affinità di proteine ​​marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine ​​e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il batterio<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Che possono essere utilizzati per isolare e caratterizzare stabili multi-complessi proteici alla quasi omogeneità anche partendo da bassi numeri di copie per cellula.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

L'obiettivo di questo esperimento è identificare proteine, interazioni proteiche e la composizione delle subunità di complessi MultiPro nativi provenienti da *E. coli*. Questo viene ottenuto amplificando prodotti PCR lineari specifici per sequenza, che codificano il marcatore SPA e un marcatore selezionabile, i quali vengono integrati ed espressi in quadro di lettura come fusioni a livello del carbossiterminale in un ceppo *ddy 3,3 0*, utilizzando il sistema di ricombinazione batterica Fage lambda. Successivamente, viene effettuata una purificazione in due passaggi mediante perle di affinità a base di cow modlin e Anti-Flag per recuperare in modo efficiente complessi proteici presenti a bassa abbondanza. In seguito, le proteine legate, eluite con buffer di eluizione cow modlin o CEB, vengono digerite con tripsina e analizzate mediante spettrometria di massa per l'identificazione proteica.I risultati ottenuti mostrano che le diverse subunità dell'enzima RNA polimerasi core, inclusi i fattori di terminazione della trascrizione e i fattori anti-determinazione, sono state co-purificate in modo efficiente con la subunità D dell'RNA polimerasi marcata, indicando che i nuovi componenti as

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Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

Questo video dimostra la purificazione di affinità tandem, una tecnica per purificare complessi proteici da cellule eucariotiche per studiare l'interazione proteina-proteina. Il complesso contiene due proteine marcate con diversi tag epitopici. Dopo la purificazione del complesso utilizzando due resine con un'affinità per i due diversi tag in modo sequenziale, la presenza di entrambe le proteine nell'eluito conferma l'interazione tra le due.

Saggio di purificazione di affinità tandem per studiare le interazioni proteina-proteina

Qui si descrivono i protocolli di perturbare le cellule di mammifero mediante fresatura a stato solido ad una temperatura criogenica, la produzione di un estratto cellulare dalla polvere di cellule risultante, e isolare complessi proteici di interesse per cattura affinità su perline paramagnetici micron scala anticorpi accoppiati.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Descriviamo qui un nuovo, robusto ed efficiente metodo di purificazione di affinità tandem (TAP) per l'espressione, l'isolamento e la caratterizzazione di complessi proteici da cellule eucariotiche. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di complessi discreti e per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che ne regolano la funzione.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Qui presentiamo un protocollo per la rapida identificazione di proteine prodotte da batteri patogeni sequenziati genomicamente utilizzando la spettrometria di massa tandem MALDI-TOF-TOF e l'analisi proteomica top-down con software sviluppato internamente. Gli ioni proteici metastabili si frammentano a causa dell'effetto dell'acido aspartico e questa specificità viene sfruttata per l'identificazione delle proteine.

Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

Scopri l'identificazione di complessi proteici in Escherichia coli mediante purificazione per affinità sequenziale e spettrometria di massa tandem. Questo metodo consente di isolare interazioni proteiche anche da proteine a bassa abbondanza.

Identificazione di complessi proteici in Escherichia coli Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry (Video) | JoVE Journal

Identificazione di complessi proteici in

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