Identificazione di complessi proteici in Escherichia coli Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Lo scopo di questo esperimento è quello di identificare le proteine, le interazioni proteiche e la composizione delle subunità dei complessi MultiPro nativi da e coli. Ciò si ottiene amplificando i prodotti di PCR lineare specifici della sequenza, codificando il tag SPA e un marcatore selezionabile, che sono integrati ed espressi nel frame come fusioni terminali carbossiliche in uno sfondo ddy 3, 3 0 utilizzando il sistema di ricombinazione lambda Fage dei batteri come secondo passaggio La purificazione a doppia fase viene eseguita utilizzando modlin bovina e perline di affinità Anti-Flag per recuperare in modo efficiente complessi proteici a bassa abbondanza. Successivamente, le proteine legate a cui si allude con la modlina bovina, il tampone di eluizione o il CEB vengono digerite con tripsina e trattate con spettrometria di massa per l'identificazione delle proteine.

I risultati ottenuti mostrano che le diverse subunità dell'enzima RNA polimerasi centrale, inclusa la terminazione della trascrizione, i fattori anti determinazione sono co-purificati in modo efficiente con la proteina D della subunità della RNA polimerasi marcata, indicando che i nuovi componenti associati possono essere scoperti in modo efficiente utilizzando questo approccio. In generale, gli individui nuovi a questo metodo possono avere difficoltà con due purificazioni di affinità rotonde, in cui un'attenta elaborazione dei lisati cellulari con soluzioni tampone appropriate è assolutamente necessaria per garantire il successo nel recupero efficiente di complessi di carico a bassa e alta abbondanza da colture su larga scala A dimostrare le procedure di purificazione di affinità e spettrometria di massa saranno Olga Kagan e HBO guo due tecnici nel mio laboratorio. Questo protocollo inizia con il targeting di specifiche sequenze amplificate al ceppo DDY tre 30 in cui il meccanismo di ricombinazione del rosso Lambda è espresso come descritto nel protocollo scritto.

Successivamente, dove il sistema di ricombinazione Lambda dei batteri farge che esprime il ceppo durante la notte in due millilitri di Luria bati o terreno LB a 32 gradi Celsius, agitando a 180 giri/min il giorno successivo, inocula un millilitro della coltura notturna in 70 millilitri di terreno LB fresco in un pallone conico da 500 millilitri. Far crescere l'inoculo a 32 gradi Celsius agitando a 180 giri/min fino a quando l'OD 600 raggiunge circa 0,8. Indurre le cellule incubando il matraccio in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius agitando delicatamente a 180 giri/min per 15 minuti.

Subito dopo l'induzione, incubare il matraccio in un bagno di liquame di acqua ghiacciata per almeno 30 minuti agitandolo. Dopo la raccolta e il lavaggio delle cellule, come descritto nella procedura scritta, Reese sospende il pellet di cellule in 700 microlitri di ghiaccio, acqua fredda e sterile, ottenendo celle elettrocompetenti attraverso l'elettroporazione. Introdurre un microlitro di amplicone purificato in 40 microlitri di celle elettrocompetenti.

Le cellule vengono elettroporate dopo ricombinazione e integrazione omologa. I trasformanti che hanno ricombinato con successo la cassetta tag slash nel cromosoma vengono selezionati in base alla resistenza alla micina cana, selezionare più trasformatori per il western blotting per verificare la corretta generazione delle proteine di fusione marcate SPA con anticorpo Anti-Flag M 2 che è selettivo contro gli epitopi bandiera del tag SPA Trasferire 10 millilitri della coltura notturna in 990 millilitri di tb fresca. Integrato con 25 microgrammi per millilitro di micina in lattina in un pallone da quattro litri.

Coltiva la coltura a 32 gradi Celsius agitando costantemente a 250 giri/min per cinque o sei ore fino a quando l'OD 600 raggiunge tra due o tre. Trasferire la coltura di tag SPA da un litro di e coli per pulire i flaconi di centrifugazione e centrifugare le cellule a quattro gradi Celsius e 3,993 volte G per 15 minuti. Dopo la sospensione delle cellule come descritto nel protocollo scritto.

Trasferire i campioni in una tazza sterile di acciaio inossidabile posta sul ghiaccio per la sonicazione. Immergere la sonda nel campione e sonicare per tre minuti. Dopo la sonicazione, attendere altri due minuti per raffreddare il campione a causa del surriscaldamento dovuto alla centrifugazione del lisato sonicato.

Trasferire con cautela il surnatante S dalla provetta di centrifugazione a una provetta di falco in polipropilene da 50 millilitri. Congelare il campione utilizzando azoto liquido e conservare l'estratto di cellule congelate sonicato per un periodo massimo di sei mesi a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Per iniziare la purificazione di affinità per l'estratto di cellule sonicate congelate mettendo la provetta in acqua fredda, incubare l'estratto di cellule TH con tre microlitri di benzo, una nucleasi per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

A questa miscela, aggiungere il detergente non ionico Triton X 100 e 200 microlitri di sospensioni Anti-Flag M due agro beads. Mescolare delicatamente il contenuto ruotando la provetta per tre ore a quattro gradi Celsius dopo tre ore di rotazione, centrifugare la provetta a 1.700 volte G per sei minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura la maggior quantità possibile di sazio senza disturbare il pellet a velocità sciolta.

Risospendere il pellet nell'SNA rimanente e quindi trasferirlo in una colonna di preparazione in polipropilene. Rimuovere i tappi di uscita inferiori della colonna per consentire all'eluato di defluire per gravità. Fluire. Successivamente, lavare la colonna cinque volte con 200 microlitri di un tampone FC e procedere a Cleve con TEV come descritto nel protocollo scritto.

Seguendo la scollatura veloce sia sulla parte superiore che su quella inferiore della colonna strettamente. Mescolare delicatamente il contenuto nella colonna ruotando per una notte a quattro gradi Celsius dopo una rotazione notturna. Scaricare l'eluato rimuovendo il tappo superiore e il tappo inferiore nella nuova colonna.

Lavare la vecchia colonna con 400 microlitri di un tampone legante Modlin x cal e 150 microlitri di sospensione di perle leganti Cal Modlin. Eluire la proteina legata in quattro frazioni da 50 microlitri in una provetta di orph eend fresca. Utilizzo di un tampone di eluizione Modlin x cal.

Distribuire la frazione eluita in due provette orph pulite in volumi uguali. Quindi asciugare il contenuto di entrambe le provette utilizzando un aspirapolvere. L'eluato essiccato da un tubo viene utilizzato per eseguire un gel colorante all'argento come descritto nel testo, mentre l'altro viene conservato a meno 80 gradi Celsius.

Per un uso futuro in spettrometria di massa sul campione essiccato, aggiungere 50 microlitri di tampone di digestione e 0,9 microlitri di acido tris fosfina cloridrico da 100 millimolari, incubare la miscela per 45 minuti a temperatura ambiente per la fase di riduzione Successivamente, aggiungere un microlitro di acetammide IDO da 500 millimolari e incubare al buio per altri 40 minuti. Per consentire l'alchilazione del campione Dopo il secondo ciclo di incubazione, aggiungere un microgrammo di viaggi nella miscela. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per cinque ore o durante la notte a temperatura ambiente dopo l'incubazione.

Assicurati di fermare la reazione aggiungendo un microlitro di acido acetico. Quindi preparare la punta della cerniera Millipore, la punta della pipetta come descritto nel testo per un legame efficiente del peptide al pep del tubo della punta. Mescolare la miscela di peptidi 20 volte, lavare via la miscela di peptidi che ha fatto sulla punta aspirando ed erogando la soluzione di lavaggio.

Ripetere questa procedura due volte per legare in modo efficiente la miscela di peptidi alla punta con la punta contenente il peptide legato. Aspirare 10 microlitri della soluzione umettante ed equilibrante e versare in un tubo di orph eend pulito. Ripetere questo passaggio due volte.

Dopo aver essiccato i campioni eluiti in un vuoto veloce, i campioni possono essere analizzati immediatamente mediante spettrometria di massa o conservati a meno 80 gradi Celsius prima dell'uso. Le micro colonne utilizzate in questa procedura sono impaccate con circa 10 centimetri di resina lunare C 18 da tre micron e sono interfacciate a una sorgente di ioni nano elettrospray pro Zion posizionata in linea con lo strumento orbitrap. Una pompa HPLC binaria a nano flusso pro Zion viene utilizzata per fornire una portata stabile della punta di circa 300 nanolitri al minuto durante le separazioni dei peptidi per ottenere la diluizione dei peptidi, impostare un gradiente di tampone organico in base alla complessità del campione.

Per questo campione di SPA di e coli, il solvente in fase mobile A contiene il 95% di acqua a gradiente HPLC e il 5% di nitrile di aceto con lo 0,1% di acido formico, mentre il solvente B ha il 5% di acqua a gradiente HPLC e il 95% di nitrile di aceto con lo 0,1% di acido formico a seguito di spettrometria di massa. Filtrare statisticamente il risultato utilizzando un algoritmo di probabilità come Star Quest per garantire un basso tasso di false scoperte, sia il fattore sigma dell'RNA polimerasi marcato SPA che la proteina LA yak di funzione sconosciuta copurificata specificamente con l'enzima RNA polimerasi del core, comprese le subunità alfa beta e beta prime, nonché il fattore di riciclaggio dell'RNA polimerasi. A differenza dell'RNA polimerasi marcata, il fattore sigma yak L si legava inoltre a un fattore essenziale di antideterminazione della terminazione della trascrizione, suggerendo una funzione specializzata nella trascrizione.

Diverse altre proteine copurificanti più piccole sono state rilevate da LCMS che non erano evidenti sul gel, tra cui la subunità Omega della RNA polimerasi e i fattori di trascrizione, terminazione e determinazione e USA e NUSD. Al contrario, in un esperimento indipendente etichettato la mobilizzazione del macchinario dello zolfo, S-U-F-B-S-U-F-C e SUFD co si sono purificati l'uno con l'altro, indicando la partecipazione congiunta alla biosintesi del cluster di ferro-zolfo come un singolo complesso di impalcatura. Questo esempio rappresentativo evidenzia il fatto che i complessi MultiPro batterici altamente annotati precedentemente ben studiati che partecipano a processi biologici essenziali hanno spesso nuovi componenti associati che possono essere identificati in modo efficiente.

Utilizzando questo approccio, il basso numero di copie della proteina SUFB potrebbe aver provocato una debole intensità del segnale rispetto alla forte intensità osservata dagli esperimenti di pull down SUFC e SUFD per definire la composizione di complessi proteici multi-unità stabili, i punteggi di co-purificazione sono stati assegnati alle interazioni ad alta confidenza tenendo conto dell'unicità della preda esca, esche esca e preda relazioni preda. Quindi utilizzando procedure di clustering di grafi come l'algoritmo di clustering markoff. I cluster proteici discreti sono identificati dalla rete PPI probabilistica partizionata.

Le reti di interazione putative possono essere visualizzate utilizzando cyto scape. La combinazione di dati proteomici con ulteriori prove di associazione funzionale dedotte da metodi genomici può essere utilizzata per studiare nuovi ruoli meccanicistici di proteine di e coli precedentemente annotate. Qui, sono state definite sottoreti di complessi proteici e moduli funzionali che partecipano come quartieri funzionali più ampi in e coli.

Il principale cluster gerarchico Graham mostra i modelli di previsioni funzionali e le annotazioni esistenti per i geni funzionalmente orfani e caratterizzati di e coli, i colori giallo e blu rappresentano rispettivamente le funzioni esistenti e dedotte, mentre le intensità cromatiche riflettono i punteggi di confidenza. I processi biologici associati ai vari quartieri sono indicati nei riquadri di destra che mostrano i singoli componenti di un quartiere rappresentativo in base ai punteggi di somiglianza della rete di interazione fisica e funzionale integrata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come i complessi proteici stabili di estia Coli possono essere isolati utilizzando l'approccio della purificazione per affinità accoppiato con la spettrometria di massa.

In linea di principio, questa tecnica può essere applicata per caratterizzare complessi proteici di membrana o complessi proteici di qualsiasi altra specie per ricombinarsi il più possibile.