La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di visualizzare le procedure graduali coinvolte nel saggio di mutazione Lambda Select cII in cellule coltivate di roditori transgenici o nei corrispondenti animali trattati con agenti chimici e fisici di interesse. Questo metodo di test può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle mutazioni, come ad esempio: un composto di prova è mutageno? E se è così, quanto è potente un mutageno?

Induce mutazioni sequenza-specifiche? Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un composto di prova minimo rispetto a qualsiasi altro composto di prova. Il metodo può essere utilizzato per i test di mutagenicità nelle cellule di mammifero utilizzando un gene reporter cromosomicamente integrato.

Per costituire una singola reazione di impacchettamento, aggiungere cinque microgrammi di DNA genomico in una provetta da microcentrifuga contenente la prima miscela di reazione. Quindi incubare la provetta a 30 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 12 microlitri della seconda miscela di reazione alla provetta e lasciare agire per altri 90 minuti a 30 gradi Celsius.

Dopo 90 minuti, aggiungere 1,1 millilitri di tampone SM alla provetta. Quindi agitare energicamente la provetta con il DNA confezionato a temperatura ambiente per circa 10 secondi. Dare rapidamente un giro di impulsi nella microcentrifuga.

Quindi lasciare il tubo sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Successivamente, aggiungi 50 microlitri di cloroformio per ogni millilitro di DNA confezionato. Se il campione non verrà elaborato lo stesso giorno, agitare delicatamente il campione e conservarlo a quattro gradi Celsius fino a due settimane.

Preparare 16 provette sterili a fondo tondo e 16 piastre per agar TB1 per un singolo campione di DNA confezionato. Utilizzare dieci provette per la vagliatura e sei per la titolazione. Quindi aliquotare 300 microlitri di coltura galvanica G1250 in ogni tubo a fondo tondo.

Successivamente, per titolare, aggiungere 10 microlitri di DNA confezionato a 990 microlitri di tampone SM e diluizione 1:100. Quindi agitare il campione. Aggiungere 20 o 100 microlitri della soluzione di DNA 1:100 a ciascuna delle tre provette rispettivamente titolo 20 o titolo 100.

A scopo di screening, aggiungere 100 microlitri del campione di DNA confezionato non diluito a ciascuna delle 10 provette di screening. Processare tutte le 16 provette di titolazione e vagliatura. Agitare i tubi per 10 secondi per mescolare i componenti.

Quindi incubare le provette a temperatura ambiente per 30 minuti affinché l'E.coli ospite assorba i fagi. Quindi, aggiungi 2,5 millilitri di agar TB1 fuso. Mantenere i 55 gradi Celsius fino ai tubi di titolazione e screening appropriati.

Dopo l'aggiunta, agitare immediatamente delicatamente i tubi. Ora, versare l'agar TB1 sul titolo appropriato o sulla piastra di screening dell'agar TB1. Lasciare riposare i piatti per 15-30 minuti a temperatura ambiente.

Una volta che l'agar si è solidificato, capovolgere e lasciare tutte le 10 piastre di screening nell'incubatore fisso a 24 gradi Celsius per 46-48 ore. Lasciare le restanti sei piastre del titolo in un'incubatrice fissa a 37 gradi Celsius per una notte o un giorno. Dopo l'incubazione a 37 gradi Celsius, contare il numero di placche formate in tutte le 3 piastre titolo 20 e titolo 100.

Dopo l'incubazione a 24 gradi Celsius, contare il numero di placche formate nelle 10 piastre di screening. Per verificare le placche mutanti putitive, carotare la placca con una punta sterile per pipetta a foro largo. Quindi trasferire la placca in una provetta sterile per microcentrifuga riempita con 500 microlitri di tampone SM sterile.

Quindi incubare la provetta per microcentrifuga a temperatura ambiente per almeno due ore a temperatura ambiente. Quindi, mescolare un microlitro della soluzione di fago con nucleo con 200 microlitri della coltura di placcatura G1250 in una provetta sterile a fondo tondo. Quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, impiattare la soluzione di fago con nucleo in 2,5 millilitri di top agar TB1 fuso e incubare a 24 gradi Celsius per 46-48 ore. Una volta che le placche secondarie sono visibili, utilizzare la punta di una pipetta per scegliere una singola placca mutante Lambda cII ben isolata. Trasferire la placca in una provetta da microcentrifuga riempita con 25 microlitri di acqua distillata doppia in pipetta più volte.

Lasciare il tubo sull'acqua bollente per cinque minuti. Quindi centrifugare la provetta a 18.000 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Subito dopo la centrifugazione, trasferire 10 microlitri di surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga contenente 40 microlitri della master mix PCR.

Dopo l'amplificazione PCR, purificare il prodotto para-amplificato di base 432 con il gene cII e le sue regioni fiancheggianti incorporate utilizzando il kit di purificazione PCR. Quindi sequenziare il transgene cII utilizzando un analizzatore di DNA per rilevare le mutazioni. Le targhe ottenute sia nella targa del titolo 20 che in quella del titolo 100 sono chiaramente visibili tenendole accanto a una scatola luminosa bianca e su uno sfondo scuro.

Qui, il grafico a barre rappresenta la potenza mutagena di varie sostanze chimiche nei composti fisici testati. Questo viene fatto analizzando l'entità dell'aumento della frequenza relativa del mutante cII isolata dai blasti delle fibre embrionali di topo. Il grafico a barre mostra tutti questi reagenti di prova che mostrano un aumento statisticamente significativo della frequenza dei mutanti cII.

Successivamente, viene dimostrati gli spettri di mutazione del transgene cII nei blasti di fibre embrionali di topo irradiati con UVB. Il grafico a torta mostra un aumento significativo della frequenza relativa della transizione da citidina a timidina singola o tandem ai dinucleotidi pirimidinici rispetto al controllo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto-dieci ore se eseguita correttamente, esclusi i tempi di preparazione per la piastra di striature batteriche nella coltura.

Nel sequenziamento del DNA, successivamente al punteggio dei mutanti cII. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi delle mutazioni di un composto in esame in un sistema modello in vitro.