Name: Facendo, test e lutilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Scopri la fabbricazione e la calibrazione di microelettrodi selettivi per ioni potassio per misurare la dinamica ionica in fettine di ippocampo adulto. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare l'omeostasi del potassio nel sistema nervoso centrale.

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Il laboratorio di Khakh è stato sostenuto da NIH MH104069. Il laboratorio Mody è stato sostenuto da NIH NS030549. J.C.O. grazie Grant(NS058280) formazione di NIH T32 neurale microcircuiti.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con l'Istituto nazionale di guida alla salute per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato di ricerca degli animali del cancelliere presso la University of California, Los Angeles. Tutti i topi sono stati alloggiati con cibo e acqua disponibile ad libitum in un ambiente di luce-buio di 12 h. Tutti gli animali erano sani senza evidenti modifiche comportamentali, non sono stati coinvolti in studi precedenti e sono stati sacrificati durante il ciclo di luce. Dati per gli esperimenti sono stati raccolti da topi adulti (6-8 settimane di vita per tutti gli esperimenti).
1. preparazione di microelettrodi selettivi K+
<ol><li>Silanizzazione in vetro borosilicato<ol>
<li>Rimuovere sufficiente tubi capillari in vetro da imballaggio e collocare in una provetta conica da 50 mL. Riempire la provetta conica verso l'alto con gli elettrodi di 1 M HCl. lavaggio con agitazione delicata in HCl durante la notte o per un minimo di 6 ore.</li>
		<li>Risciacquare brevemente capillari con etanolo al 70% e poi asciugare completamente a 100-120 ° C per 6-8 ore. Conservare i capillari lavati in contenitori con essiccante solfato di calcio anidro per fino a 4 settimane prima dell'ulteriore uso.</li>
		<li>Prima di silanizzazione, tirare capillari a punta sottile con l'estrattore microelettrodo. I microelettrodi che usiamo sono circa il 2-5 micron di diametro. Maneggiare sempre lavati capillari con i guanti, come oli da pelle possono interferire con la silanizzazione.</li>
		<li>Luogo microelettrodi in un contenitore di vetro in modo che gli elettrodi sono elevati dal basso per prevenire la rottura della punta. Difficoltà microelettrodi al contenitore mediante nastro autoclavabili o nastro adesivo simile.</li>
		<li>Rimuovere circa 0,5 mL di soluzione di silanizzazione 5% dichlorodimethylsilane (DDS) dal relativo contenitore utilizzando il metodo di sostituzione di azoto (Vedi Figura 2). Riempire un palloncino con gas azoto e fissare tubo o una siringa e un ago il palloncino. Inserire l'ago nel contenitore DDS durante l'elaborazione di DDS in una siringa separata tramite un ago più lungo.</li>
		<li>Applicare la soluzione di silanizzazione goccia a goccia per le punte delle pipette e coprire immediatamente. Posizionare il contenitore che tiene i microelettrodi con soluzione di silanizzazione in un forno pre-riscaldato del laboratorio (170-180 ° C) per 10-12 ore o a 200-220 ° C per 30 minuti</li>
		<li>Dopo l'incubazione, spegnere il forno e quindi rimuovere la piastra da forno. Prestare attenzione quando si rimuove la piastra dall'incubatrice, quanto è estremamente caldo. Posizionare la piastra su una panchina a temperatura ambiente per 10-15 minuti consentire la vetreria raffreddare.</li>
		<li>Rimuovere i microelettrodi dalla piastra (usando una lama di rasoio o bisturi per tagliare il nastro) e inserirli in un contenitore ermetico riempito disseccante. Silanizzata microelettrodi prive di umidità possono essere utilizzati per fino a 1 settimana che segue la silanizzazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gli elettrodi di adescamento<ol>
<li>Preparare una soluzione stock di K+ ionoforo cocktail: valinomicina w/v 5%, 93% v/v 1,2-dimetil-3-nitrobenzene, potassio 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borato11. Questa soluzione è un debole colore giallo. Tenere in un contenitore ermetico, opaco a temperatura ambiente. Questa soluzione può durare molti mesi se correttamente conservato.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock di 10 mM HEPES tamponata 300 mM NaCl a pH 7,4. Fissare l'elettrodo in un morsetto e recupero con il NaCl tamponato utilizzando una punta di microfil 28G collegata ad una siringa. Osservare che la soluzione salina ha raggiunto l'estremità della punta del microelettrodo. Confermare che il microelettrodo è privo di grandi bolle che potrebbero interferire con il flusso di corrente.</li>
		<li>Rompere la punta dell'elettrodo a circa 10-20 µm di larghezza, utilizzando il lato smussato di un bisturi o lametta.</li>
		<li>Utilizzando una micropipetta, applicare una piccola goccia (~0.1 µ l) dello ionoforo K+ vicino alla punta del microelettrodo. Se l'elettrodo è stato correttamente silanizzata che la goccia sarà assorbita nel punta rotta. Riempimento dell'elettrodo a 1-2 mm con l'ionoforo K+ e rimuovere l'eccesso con carta velina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. taratura del microelettrodo selettiva K+
<ol><li>Preparazione delle soluzioni di taratura<ol>
<li>Preparare soluzioni di varie concentrazioni di KCl in uguale osmolarità del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) sostituendo NaCl con KCl. Abbiamo usato 0.1, 1, 4.5, 10 e 100 mM K+ ACSF, per la calibrazione degli elettrodi. Le ricette per queste soluzioni di calibrazione sono elencate nella tabella 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Prodotto chimico</td>
			<td>MW</td>
			<td rowspan="2">finale mM</td>
			<td rowspan="2">0,1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">4,5 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K +]</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g / mol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58,44</td>
			<td>varia</td>
			<td>1,51 g</td>
			<td>1,50 g</td>
			<td>1,44 g</td>
			<td>1,4 g</td>
			<td>0,345 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>Stock di 1 M</td>
			<td>varia</td>
			<td>20 µ l</td>
			<td>200 µ l</td>
			<td>900 µ l</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>Stock di 1 M</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>Stock di 1 M</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>119.98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0,29 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">0,437 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glucosio</td>
			<td>180,16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0,360 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua</td>
			<td colspan="7">q.s. 200 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Soluzioni di calibrazione di potassio
<ol start="2"><li>Calibrazione del microelettrodo<ol>
<li>Bubble tutte le soluzioni con 95% O25% CO2 per almeno 20 minuti prima di iniziare l'esperimento. Iniziare che irrora il bagno con 4,5 mM [K+] ACSF ad un tasso di 3 mL al minuto. Inserire l'elettrodo selettivo K+ portaelettrodo attaccato all'headstage elettrodo sul manipolatore. Questo headstage è collegato ad un amplificatore appropriato. Inserire la punta dell'elettrodo nel bagno perfusato.</li>
		<li>Garantire l'elettrodo di terra di Ag/AgCl è bagnata nella stessa soluzione e che il flusso è costante. Applicare soluzioni di calibrazione in un modo graduale e registrare i cambiamenti di potenziali in mV attraverso la punta dell'elettrodo. Attendere che il potenziale presso la punta dell'elettrodo per raggiungere un valore stabile prima di passare alla soluzione successiva</li>
		<li>Misurare la variazione di tensione allo stato stazionario in risposta all'applicazione delle soluzioni di taratura per la punta dell'elettrodo. Confermare che la pendenza della risposta dell'elettrodo è almeno 52 e non superiore a 58 mV a cambio di registro in [K+].</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione di fettine di cervello Hippocampal acuta
<ol><li>Preparazione delle soluzioni di fetta<ol>
<li>Preparare il saccarosio 500ml taglio soluzione composta da: saccarosio 194 mM, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-glucosio, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4e 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, saturo di 95% O2 e 5% CO2.</li>
		<li>Preparare 1-2 litri di soluzione di registrazione (ACSF) composti da: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucosio, 2mm CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4e 26 mM NaHCO3; pH 7.3-7.4 (dopo il bubbling), 290-300 mOsm, saturo di 95% O2 e 5% CO2. Riempire un becher contenente una camera di titolare fetta di cervello con soluzione di registrazione e la tiene a 32-34 ° C. Riempire la camera vibratome con granita di acqua e ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di fetta acuta<ol>
<li>Profondamente anestetizzare un mouse collocandolo in una campana di vetro pre-caricato con 2-3 mL isoflurano. Verifica per reflex di punta pizzico e se non rispondono, rapidamente decapitare utilizzando un paio di forbici taglienti o ghigliottina come richiede il protocollo animale.</li>
		<li>Fare un'incisione di 2-3 cm usando le cesoie dalla porzione caudale del cranio per tagliare il cuoio capelluto lungo la linea mediana. Durante il riavvolgimento manualmente il cuoio capelluto, fare due incisioni orizzontali 1cm dal magnum di orifizio lungo i lati del cranio. Poi, usando le cesoie bene, tagliare un'incisione la lunghezza del cranio, lungo la linea mediana dalla parte posteriore del cranio al naso.</li>
		<li>Utilizzando una pinzetta inserita vicino al midline, ritrarre il cranio inciso in due porzioni. Estrarre il cervello di topo dal cranio e utilizzare una lama per rimuovere il cervelletto e bulbi olfattivi, che si trovano rispettivamente le porzioni rostrale e caudale del cervello. Questi possono essere identificati da grandi fenditure, che li separano dalla corteccia.</li>
		<li>Montare il blocco di cervello sul vassoio vibratome utilizzando colla super. Riempire il vassoio del vibratome con soluzione di taglio di ghiaccio freddo.</li>
		<li>Tagliare le sezioni di tessuto sul piano corona a 300 µm spessore. Di solito possono essere raccolti 6 fette hippocampal coronale.</li>
		<li>Dopo ogni sezione viene tagliato, trasferire immediatamente le fette per la fetta che tiene Becher riscaldato a 32-34° C. Mantenere le sezioni a questa temperatura per 20 minuti prima di rimuovere il becher contenente le sezioni e questo posto a temperatura ambiente per almeno 20-30 minuti prima della registrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. misurazione delle dinamiche elettricamente evocate K+ 
<ol><li>Impostazione per la preparazione di fetta<ol>
<li>Posizionare delicatamente la fetta di cervello nella vasca utilizzando una pipetta di Pasteur e tenerlo delicatamente in posizione con un platino arpa con corde in nylon.</li>
		<li>Garantire le punte dell'elettrodo stimolante bipolare sono parallele tra loro e sono livello con il piano della sezione. Lentamente, nel corso di 6-7 secondi, inserire gli elettrodi in CA3 strato radiato circa 40-50 µm profondità per stimolare collaterali di Schaffer. In sezioni coronali, CA3 può essere identificato circa come la porzione di laterali ippocampo adeguato per lo strato delle cellule del granello al genu hippocampal, con la strato radiato cadendo mediale e ventrale per lo strato delle cellule piramidali.</li>
		<li>Inserire con cautela il K+-elettrodo selettivo in CA1 strato radiato circa 50 µm profonda, abbassando lentamente l'elettrodo sopra circa 3-4 secondi. Consentire il potenziale stabilizzare attraverso l'elettrodo prima di applicare stimoli la fetta: questo di solito richiede 5-10 minuti. Se la fetta esibisce spontanea modifiche in extracellulare K+ scartare e ripetere questo processo con una fetta di nuovo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare il rilascio evocato K+<ol>
<li>Applicare i treni di stimolazione elettrica (8 impulsi) premendo manualmente il trigger sullo stimolatore durante la registrazione digitale di risposte. Applicare la stimolazione a 10 Hz e 1 larghezza di impulso di ms, a partire da ampiezza di stimolo 10 µA.</li>
		<li>Applicare le ampiezze di stimolazione crescente di un fattore di 2 fino a quando viene rilevata un'ampiezza massima di risposta K+ . Se non vedete alcuna risposta, è possibile spostare la posizione dell'elettrodo K+ più vicino al sito di stimolazione in 100 µm in passi da</li>
		<li>Determinare l'ampiezza di stimolo che produce la risposta massima mezza. Nella nostra esperienza, questo è tra 40-160 µA, dipendendo la qualità di preparazione, l'età dell'animale e la distanza tra gli elettrodi di stimolazione ed elettrodo selettivo K+ .</li>
		<li>Nella stessa sezione, utilizzando un'ampiezza di stimolo ad un passo inferiore l'ampiezza che produce la risposta massima mezza (ad es. se 80 µA produce una risposta mezzo massima, utilizzare 40 µA) applicare i treni di stimolo di aumento del numero di impulsi. Inizialmente, abbiamo usato i treni di impulsi di 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128.</li>
		<li>Per confermare che K+ segnali sono mediati da infornamento del potenziale d'azione del bagno collaterals Schaffer stimolato elettricamente, applicare 0,5 µM TTX in ACSF per 10 minuti e ripetere il protocollo di stimolazione. Nessun risposte evocate dovrebbero essere osservate.</li>
		<li>Dopo aver terminato l'esperimento di fetta, confermare l'elettrodo ha mantenuto la sua responsività ri-calibrare l'elettrodo nelle soluzioni di calibrazione e garantire la risposta non si è discostato di oltre il 10% dalla taratura iniziale</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo che descriviamo qui ci ha permesso di valutare K+ dinamiche in risposta alla stimolazione elettrica dei collaterals Schaffer in fettine ippocampali acute da topi adulti. Il nostro metodo di preparazione K+ microelettrodi selettiva dello ione è simile a precedenti procedure descritte12,13,14,15. Tuttavia, questo metodo presenta vantaggi rispetto alle configurazion...

Concentrazioni di ioni di potassio sono strettamente regolati nel cervello, e le loro fluttuazioni esercitano una potente influenza sul potenziale di membrana di riposo di tutte le cellule. Alla luce di questi contributi critici, un obiettivo importante di biologia è determinare i meccanismi biofisici e cellulari che vengono utilizzati per regolare strettamente la concentrazione di K+ nello spazio extracellulare in vari organi del corpo1 , 2. un requisito importante in questi studi è la capacità di misurare le concentrazioni di K+ con precisione. Anche se molti componenti che contribuiscono all'omeostasi del potassio nel cervello negli stati sani e malati sono stati identificati3,4,5, ulteriori progressi sono stato rallentato a causa della natura specialistica preparazione di microelettrodi selettiva dello ione per la misura di potassio. Microelettrodo sensori rappresentano il gold standard per la misurazione di K+ le concentrazioni in vitro, in fettine di tessuto e in vivo.
Approcci più recenti per K+ monitoraggio sono in fase di sviluppo mediante sensori ottici, tuttavia questi non rilevano un concentrazioni biologicamente rilevanti gamma di K+ o non siano stati completamente controllati nei sistemi biologici, anche se i risultati iniziali appaiono promettenti6,7,8. Rispetto ai sensori ottici, microelettrodi sono fondamentalmente limitati ad un punto sorgente di ioni, anche se l'array di elettrodi potrebbe migliorare la risoluzione spaziale di9. Questo articolo si concentra sui sensori del microelettrodo singolo-canna per monitoraggio K+ dynamics.
In questo lavoro, segnaliamo procedure dettagliate graduale di rendere K+ microelettrodi selettivi, utilizzando un ionoforo potassio valinomicina-basato che permette altamente selettivo (104 piega alla selettività Na+ K+ ) K+ movimento su membrane10. Un polipeptide natura, valinomicina agisce come un poro permeabile K+ e facilita il flusso di K+ giù di gradiente elettrochimico. Inoltre descriviamo come calibrare gli elettrodi, come memorizzare e utilizzarli e, infine, come distribuirle per misurare K+ concentrazione dinamica in fettine di cervello hippocampal acuta da topi adulti. L'uso di tali elettrodi insieme ai topi geneticamente modificati che non dispongono di canali ionici specifico proposti per regolare extracellulare K+ dinamica dovrebbe rivelare i meccanismi cellulari utilizzati dal sistema nervoso per controllare la concentrazione ambientale di K + nell'ambiente extracellulare.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Topi consanguinei C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore di elettrodi</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl pellet macinato</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Puntale personalizzata microfil 28G</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>Asta di tungsteno</td><td>A-M Systems</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi stimolanti bipolari</td><td>FHC</td><td>MX21XEW(T01)</td><td></td></tr><tr><td>Isolatore di stimolo</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>Grass S88 Stimulator</td><td>Grass Instruments Company</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro borosilicato World</td><td>precision instruments</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Scheda da A a D</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore di segnale</td><td>Multiclamp 700A o 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Patch computer</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>valinomicina</td><td>Sigma</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimetil-3-nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>Potassio tetrakis (4-clorofenil)borato</td><td>Sigma</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>5% dimetildiclorosilano in eptano</td><td>Sigma</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Cayman Azienda chimica</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore per pipette</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Gli ioni potassio contribuiscono in modo significativo per il potenziale di membrana di riposo delle cellule e, di conseguenza, la concentrazione extracellulare di K+ è un regolatore cruciale dell'eccitabilità delle cellule. Alterato le concentrazioni extracellulari di K+ effetto l'eccitabilità cellulare e potenziali di membrana riposo spostando gli equilibri tra stati chiusi, aperti e inattivati per canali ionici voltaggio-dipendenti che sono alla base di potenziale di azione Iniziazione e conduzione. Quindi, è prezioso per misurare direttamente extracellulare K+ dinamiche in salute e stati malati. Qui, descriviamo come fare, calibrare e utilizzare monopolare K+-selettivi microelettrodi. Li abbiamo distribuito in fette di cervello hippocampal adulto per misurare elettricamente evocate K+ concentrazione dinamica. L'uso giudizioso di tali elettrodi è una parte importante di tool-kit necessari per valutare i meccanismi biofisici e cellulari che controllano le concentrazioni extracellulari di K+ nel sistema nervoso.

Per la determinazione selettiva di extracellulare K+, abbiamo preparato microelettrodi iono-selettivi, rivestiti con uno strato idrofobico attraverso silanizzazione delle pipette di vetro borosilicato pulito (Figura 1A). Questo rivestimento permette lo ionoforo K+ contenente valinomicina per riposare sulla punta dell'elettrodo e consentire solo K+ di flusso attraverso una stretta apertura presso la punta dell'elettrodo (<stron...

Gli ioni del potassio contribuiscono per il potenziale di membrana di riposo delle cellule e concentrazione extracellulare di K+ è un regolatore fondamentale dell'eccitabilità cellulare. Descriviamo come fare, calibrare e utilizzare monopolare K+-selettivi microelettrodi. Utilizzando tali elettrodi consente la misurazione delle dinamiche di concentrazione K+ elettricamente evocate nelle fette hippocampal adulti.

Facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è realizzare, calibrare e utilizzare microelettrodi iono-selettivi monopolari di potassio. L'uso di tali elettrodi consente la valutazione quantitativa della dinamica della concentrazione di ioni potassio evocati in fette di cervello adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in fisiologia, come l'identificazione dei meccanismi cellulari e molecolari per l'omeostasi degli ioni potassio nel sistema nervoso centrale.Il vantaggio principale di questa tecnica è che, oltre ad essere un metodo di fabbricazione semplice e diretto, i sensori a microelettrodi rappresentano il gold standard per la misurazione della concentrazione di ioni potassio. Per preparare i capillari in vetro borosilicato alla silanizzazione, metterli in una provetta conica da 50 millilitri. Riempire il tubo conico con acido cloridrico monomolare e incubare i capillari di vetro in acido cloridrico con una leggera agitazione per una notte per un minimo di sei ore.Successivamente, sciacquare brevemente i capillari con etanolo al 70% e poi asciugarli completamente a 100-120 gradi Celsius per sei-otto ore. Conservare i capillari lavati in contenitori con essiccant

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Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Usiamo il patch-clamp per misurare GABA-activated monocanale correnti (GABAA canali, recettori GABA) e le correnti sinaptiche e tonico che generano nei neuroni. L'attivazione dei canali diminuisce l'eccitabilità neuronale nella salute e nella...

Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati ​​in fettine di cervello di ratto

I neuroni vengono prima caratterizzata elettrofisiologico. Poi il citoplasma dal neurone registrato è aspirato e sottoposto a trascrizione inversa-PCR per rilevare l'espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, canali ionici e recettori.

Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche

Il video mostra la dinamica della concentrazione di ioni potassio evocata sulla stimolazione elettrica di fette di cervello ippocampale coronale di topo. Un elettrodo stimolante bipolare viene inserito nello strato radio della regione CA3 nell'ippocampo e un elettrodo selettivo per ioni potassio viene posizionato nello strato CA1 radio. La stimolazione elettrica provoca un potenziale d'azione, con conseguente rilascio di ioni potassio. Infine, la mancanza di risposta evocata dello ione potassio...

Misurazione della dinamica della concentrazione di ioni potassio evocati nelle fette di ippocampo coronale

Questo video dimostra come caratterizzare lo spazio extracellulare in una fetta di cervello utilizzando microelettrodi iono-selettivi e ionoforesi per misurare e confrontare i segnali elettrici. Questo processo aiuta a determinare la frazione di volume dello spazio e il grado di torsione.

Caratterizzazione dello spazio extracellulare in una fetta di cervello utilizzando microelettrodi iono-selettivi e ionoforesi

Abbiamo sviluppato un modello fetta cervello che può essere usato per esaminare meccanismi molecolari coinvolti nel trauma cranico eccitotossicità mediata. Questa tecnica genera tessuto cerebrale maturo vitale e riduce il numero di animali necessari per la sperimentazione, pur mantenendo la circuiteria neuronale, interazioni cellulari e compartimenti post-sinaptici in parte intatto.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

In questo articolo mostriamo un metodo per preparare fette acute di cervello a temperatura fisiologica, utilizzando una soluzione fisiologica convenzionale senza particolari modifiche per il taglio (come l'aggiunta di saccarosio) e senza perfusione intracardica dell'animale prima della preparazione della fetta.

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Le registrazioni di patch-clamp e il riempimento simultaneo di biocitina intracellulare di neuroni accoppiati sinapticamente in fette cerebrali acute consentono un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere le fasi tecniche essenziali della registrazione elettrofisiologica da microcircuiti neuronali e la loro successiva analisi morfologica.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

Dimostriamo la fabbricazione, la calibrazione e le proprietà di due tipi di microelettrodi iono-selettivi (a doppio cilindro e concentrici) per la misurazione delle concentrazioni di ioni nel tessuto cerebrale. Questi vengono poi utilizzati nella preparazione della fetta di ippocampo di topo per dimostrare che l'attività eccitatoria cambia sia le concentrazioni extracellulari di potassio che di sodio.

Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale

Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

Microglia, le cellule immunitarie residente del cervello, di rispondere rapidamente con i cambiamenti morfologici a modificazioni del loro ambiente. Questo protocollo viene descritto come utilizzare microscopia del due-fotone per studiare l'attrazione dei processi microglial verso la serotonina o ATP nelle fette acuta del cervello dei topi.

Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

Scopri la fabbricazione e la calibrazione di microelettrodi selettivi per ioni potassio per misurare la dinamica ionica in fettine di ippocampo adulto. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare l'omeostasi del potassio nel sistema nervoso centrale.

Facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto

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