Facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto

L'obiettivo generale di questa tecnica è realizzare, calibrare e utilizzare microelettrodi iono-selettivi monopolari di potassio. L'uso di tali elettrodi consente la valutazione quantitativa della dinamica della concentrazione di ioni potassio evocati in fette di cervello adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in fisiologia, come l'identificazione dei meccanismi cellulari e molecolari per l'omeostasi degli ioni potassio nel sistema nervoso centrale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che, oltre ad essere un metodo di fabbricazione semplice e diretto, i sensori a microelettrodi rappresentano il gold standard per la misurazione della concentrazione di ioni potassio. Per preparare i capillari in vetro borosilicato alla silanizzazione, metterli in una provetta conica da 50 millilitri. Riempire il tubo conico con acido cloridrico monomolare e incubare i capillari di vetro in acido cloridrico con una leggera agitazione per una notte per un minimo di sei ore.

Successivamente, sciacquare brevemente i capillari con etanolo al 70% e poi asciugarli completamente a 100-120 gradi Celsius per sei-otto ore. Conservare i capillari lavati in contenitori con essiccante anidro di solfato di calcio per un massimo di quattro settimane prima di un ulteriore utilizzo. Prima della silanizzazione, tirare i capillari fino a una punta fine utilizzando un estrattore per microelettrodi.

Quindi, posizionare i microelettrodi in un contenitore di vetro utilizzando del nastro autoclavabile, in modo che gli elettrodi siano sollevati dal basso per evitare la rottura della punta. Quindi, rimuovere circa 0,5 millilitri di soluzione di silanizzazione DDS al 5% dal suo contenitore utilizzando il metodo di sostituzione dell'azoto. Riempi un palloncino con azoto gassoso e collega una siringa o un tubo e un ago al palloncino.

Quindi, inserire l'ago nel contenitore DDS mentre si aspira DDS in una siringa separata tramite un ago più lungo. Successivamente, applicare la soluzione di silanizzazione goccia a goccia sulle punte delle pipette e coprire immediatamente il contenitore. Posizionare il contenitore contenente i microelettrodi con la soluzione di silanizzazione in un forno da laboratorio preriscaldato a 170-180 gradi Celsius per 10-12 ore o a 200-220 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra dal forno. Posizionare il piatto su un banco a temperatura ambiente per 10-15 minuti per consentire alla vetreria di raffreddarsi. Rimuovere i microelettrodi dalla piastra e metterli in un contenitore ermetico pieno di essiccante.

microelettrodi silanizzati mantenuti privi di umidità possono essere utilizzati fino a una settimana dopo la silanizzazione. Per adescare gli elettrodi, preparare una soluzione madre di cocktail di ionofori di potassio e conservarla in un contenitore ermetico e opaco a temperatura ambiente. Successivamente, preparare una soluzione madre di cloruro di sodio da 300 millimolari tamponato HEPES a 10 millimolari a pH 7,4.

Fissare l'elettrodo in un morsetto. Successivamente, utilizzando uno strumento smussato, rastrellare la punta dell'elettrodo a circa 10-20 micrometri di larghezza, quindi riempire nuovamente l'elettrodo con il cloruro di sodio tamponato HEPES utilizzando una punta MicroFil calibro 28 collegata a una siringa. Osservare che la soluzione salina abbia raggiunto l'estremità della punta del microelettrodo e assicurarsi che il microelettrodo sia privo di bolle di grandi dimensioni che potrebbero interferire con il flusso di corrente.

Utilizzando una micropipetta, applicare una piccola goccia di ionoforo di potassio vicino alla punta del microelettrodo. Se l'elettrodo è stato silanizzato correttamente, la gocciolina verrà assorbita nella punta rotta. Riempire l'elettrodo a circa 1 millimetro con lo ionoforo di potassio e rimuovere l'eccesso con carta velina.

Per calibrare i microelettrodi, bollare tutte le soluzioni tampone di calibrazione e affettare con il 95% di ossigeno/5% di anidride carbonica per almeno 20 minuti prima di iniziare l'esperimento. Iniziare a perfondere il bagno con ACSF contenente ioni potassio da 4,5 millimolari a una velocità di tre millilitri al minuto. Posizionare l'elettrodo iono-selettivo di potassio nel portaelettrodo collegato allo stadio dell'elettrodo sul manipolatore.

Quindi, inserire la punta dell'elettrodo nel bagno perfusato. Assicurarsi che l'elettrodo di terra argento/cloruro d'argento sia immerso nella stessa soluzione e che il flusso sia costante. Applicare le soluzioni di calibrazione in modo graduale e registrare le potenziali variazioni in millivolt attraverso la punta dell'elettrodo.

Attendere che il potenziale sulla punta dell'elettrodo raggiunga un valore stabile prima di passare alla soluzione successiva. Quindi, misurare la variazione di tensione allo stato stazionario in risposta all'applicazione delle soluzioni di calibrazione sulla punta dell'elettrodo. Verificare che la pendenza della risposta della tensione dell'elettrodo sia di almeno 52 e non superiore a 59 millivolt per variazione di dieci volte della concentrazione di potassio.

Per preparare le fette dell'ippocampo, praticare un'incisione di due o tre centimetri dalla parte caudale del cranio per tagliare il cuoio capelluto lungo la linea mediana. Mentre si ritrae manualmente il cuoio capelluto, praticare due incisioni orizzontali di un centimetro dal forame magno lungo i lati del cranio. Quindi, usando delle cesoie sottili, praticare un'incisione lungo la linea mediana dalla parte posteriore del cranio al naso.

Quindi, inserire una pinza sottile vicino alla linea mediana e ritrarre il cranio inciso in due parti. Estrai il cervello del topo dal cranio e usa una lama per rimuovere il cervelletto, la corteccia prefrontale e i bulbi olfattivi, che si trovano rispettivamente nella parte caudale e rostrale del cervello. Quindi, monta il blocco cerebrale sul vassoio del vibratomo usando Super Glue.

Riempire la vaschetta del vibratomo con una soluzione di taglio ghiacciata. Successivamente, tagliare sezioni di tessuto sul piano coronale a uno spessore di 300 micrometri. Di solito si possono raccogliere da quattro a sei fette di ippocampo coronale.

Dopo che ogni sezione è stata tagliata, trasferire immediatamente la fetta nel bicchiere porta fette riscaldato a 32-34 gradi Celsius. Mantenere le sezioni a questa temperatura per 20 minuti prima di trasferire il becher con le sezioni a temperatura ambiente per almeno 20-30 minuti prima della registrazione. Per misurare la dinamica degli ioni potassio, posizionare delicatamente la fetta di cervello nella vasca da bagno utilizzando una pipetta Pasteur e tenerla delicatamente in posizione con un'arpa di platino con corde di nylon.

Assicurarsi che le punte dell'elettrodo stimolante bipolare siano approssimativamente parallele l'una all'altra e siano a livello del piano della fetta. Nel corso di cinque-sette secondi, inserire lentamente gli elettrodi nello strato CA3 radiato a circa 40-50 micrometri di profondità per stimolare i collaterali di Schaffer. Quindi, inserire con cautela l'elettrodo iono-selettivo di potassio nello strato radiante CA1 a una profondità di circa 50 micrometri, abbassando lentamente l'elettrodo per circa tre o quattro secondi.

Lasciare che il potenziale si stabilizzi attraverso l'elettrodo prima di applicare le stimolazioni alla fetta, che di solito richiede dai cinque ai 10 minuti. Se la fetta mostra eccessive variazioni spontanee delle concentrazioni di ioni potassio extracellulari, scartare e ripetere il processo con una nuova fetta. Per misurare il rilascio di ioni potassio evocato, applicare treni di stimolazione elettrica tramite l'isolatore dello stimolo mentre si registrano digitalmente le risposte.

Applicare la stimolazione a 10 hertz e un millisecondo per impulso a partire da un'ampiezza dello stimolo di 10 microampere. Applicare ampiezze di stimolazione crescenti di un fattore due fino a quando non viene rilevata un'ampiezza massima di risposta al potassio. Se non si osserva alcuna risposta, spostare la posizione dell'elettrodo iono-selettivo di potassio più vicino al sito di stimolazione con incrementi di 100 micrometri.

Per confermare che le variazioni della concentrazione di ioni potassio sono mediate dall'attivazione del potenziale d'azione dei collaterali di Shaffer attivati elettricamente, applicare 0,5 micromolari TTX in ACSF per 10 minuti e ripetere il protocollo di stimolazione. Non si devono osservare risposte evocate. Dopo aver adescato gli elettrodi con la soluzione salina tamponata HEPES e lo ionoforo di potassio, gli elettrodi possono essere testati per la loro rapida risposta alle variazioni graduali delle concentrazioni di ioni potassio del bagno e per la risposta lineare alle variazioni degli ioni potassio del bagno nell'intervallo di calibrazione da 0,1 a 100 millimolari in un modo previsto dall'equazione di Nernst.

Il potenziale di stato stazionario può essere tracciato rispetto alla concentrazione di ioni potassio del bagno per determinare la pendenza della linea, che dovrebbe essere di circa V 58,2 millivolt e non inferiore a 52 millivolt per variazione di dieci volte della concentrazione di ioni potassio. La reattività degli elettrodi selettivi per il potassio è stata ulteriormente testata ed è stata osservata la risposta a un aumento di 5,5 millimolari del potassio con costanti di tempo di salita e decadimento di circa 85 millisecondi. Una volta che gli elettrodi stimolanti e ionoselettivi di potassio sono stati inseriti nel tessuto e la registrazione ha raggiunto una linea di base stabile, è possibile applicare impulsi di ampiezza di corrente crescente.

La forma d'onda di questa attività appare come un rapido aumento del potassio con un tasso di decadimento esponenziale, che viene abolito con l'applicazione di TTX. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre o quattro ore se eseguita con cura e precisione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la punta dell'elettrodo il più piccola possibile per consentire registrazioni accurate, ma abbastanza grande da consentire un basso rumore.