Due metodi per decellularizzazione di tessuti vegetali per applicazioni di ingegneria del tessuto
31 maggio 2018
Qui vi presentiamo, e contrasto due protocolli utilizzati per decellularize tessuti vegetali: un approccio basato su detergente e un approccio privo di detersivo. Entrambi i metodi si lasciano alle spalle la matrice extracellulare dei tessuti vegetali utilizzati, che quindi può essere utilizzata come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.
Questi metodi possono aiutare ad affrontare questioni chiave nel campo dei biomateriali, come lo sviluppo di un'impalcatura con eccellenti capacità di trasferimento dei fluidi con sofisticate ultra-strutture e una produzione scalabile. Il vantaggio principale di queste tecniche è che possono essere applicate alla maggior parte delle piante per i tessuti staminali senza la necessità di attrezzature specializzate. Per prima cosa, raccogli campioni freschi o congelati di foglie di F. hispida.
Conservare il campione fresco rimanente a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro. Lascia che la foglia rimanga immersa in acqua deionizzata a 20-25 gradi Celsius. Utilizzare un punzone per biopsia pulito per tagliare la foglia in dischi di otto millimetri di diametro.
Successivamente, per lavare i campioni di foglie, incubarli su una piastra di agitazione a bassa velocità per cinque-10 minuti, immersi in acqua deionizzata. Quindi preparare il 10% in peso in volume di SDS in acqua deionizzata. Dopo aver preparato la soluzione SDS, posizionare i campioni di foglie su un piatto di plastica.
Quindi aggiungere la soluzione SDS per coprire completamente i campioni. Posizionare i campioni di foglie emerse SDS, coperti, su una piastra di agitazione per evitare l'evaporazione. Quindi incubare il campione di foglie a temperatura ambiente per cinque giorni.
Dopo cinque giorni di incubazione, sostituire la soluzione SDS con acqua deionizzata. Incubare i campioni imbevuti di acqua deionizzata per 10-15 minuti su una piastra di agitazione. Quindi, mescola cinque millilitri di tensioattivo non ionico con 50 millilitri di candeggina.
Aggiungere questa miscela a 445 millilitri di acqua deionizzata. Quindi immergere i campioni nella soluzione di candeggina tensioattiva non ionica appena preparata. Continuare a cambiare la soluzione di candeggina di tensioattivo non ionico ogni 24 ore fino a quando i campioni non sono stati eliminati.
Quindi lasciare i campioni chiarificati immersi in acqua deionizzata per due minuti su una piastra di agitazione. Per una decellularizzazione senza detergente, preparare il cinque percento di candeggina in volume in una soluzione di bicarbonato di sodio al 3% in peso in volume. Quindi, scaldare la soluzione a 60-70 gradi Celsius su una piastra calda all'interno di una cappa aspirante.
Non appena la soluzione raggiunge la temperatura desiderata, immergere i campioni di foglie. Quindi ridurre la velocità della piastra di agitazione per evitare di danneggiare i campioni e cercare i campioni visibilmente eliminati e trasferirli con cura dal bagno. Infine, incubare i campioni in acqua deionizzata per uno o due minuti.
Poiché tutti i campioni sono intrinsecamente diversi, si consiglia di controllare l'andamento della decellularizzazione circa ogni 15 minuti per assicurarsi che i campioni non vengano danneggiati. I parametri MTM, SAF e UTS vengono prima studiati per studiare le proprietà uniche dell'impalcatura decellularizzata di entrambe le specie di P.aquatica e F.hispida. Infatti, tutti e tre i parametri mostrano proprietà meccaniche simili utilizzando sia il metodo di decellularizzazione a base di detergente che quello senza detergente.
Tuttavia, la proprietà meccanica UTS di F.hispida mostra un valore medio significativamente più alto utilizzando SDS piuttosto che candeggina per la decellularizzazione. Anche il contenuto di DNA genomico delle specie vegetali eliminate studiate è significativamente ridotto dopo la decellularizzazione rispetto ai campioni non decellularizzati. Successivamente, l'attività metabolica dei tiroblasti dermici umani viene misurata anche in presenza di scaffold decellularizzati di P. aquatica o Garcinia.
È interessante notare che gli scaffold a base di detergenti hanno suscitato un impatto ridotto sull'attività metabolica cellulare, ma il lavaggio con tampone trisidrocloruro, seguito da un terreno privo di siero dopo l'eliminazione della SDS, riduce l'impatto sull'attività metabolica cellulare rispetto al lavaggio con la sola acqua deionizzata. Infine, qui viene mostrata la crescita delle cellule staminali mesenchimali colorate con calcina sulla superficie della struttura fogliare di F. hispida. Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere completate da circa sette giorni a soli 15 minuti se eseguite correttamente.
Quando si eseguono queste procedure, è importante ricordare di monitorare i campioni mentre si decellularizzano perché i campioni possono variare da lotto a lotto, il che può comportare tempi di chiarifica diversi. Seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi, come la dequantificazione o i test meccanici, per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio in che misura i campioni vengono eliminati e a quali altri tessuti i campioni sono meccanicamente simili. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha contribuito a spianare la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per la produzione di scaffold perfusibili.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come decellularizzare i tessuti vegetali per utilizzarli come scaffold. Non dimenticare che lavorare con detergenti e fumi di candeggina può essere pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione adeguati e l'uso di una cappa aspirante devono essere sempre prese durante l'esecuzione di queste procedure.
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Panoramica
Questo articolo presenta e confronta due protocolli per la decellularizzazione dei tessuti vegetali: un approccio basato su detergenti e un approccio privo di detergenti. Entrambi i metodi preservano la matrice extracellulare, che può servire come scaffold per applicazioni di ingegneria tissutale.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biomateriali
- Ingegneria tissutale
- Biologia vegetale
Contesto
- Le tecniche di decellularizzazione sono cruciali per creare scaffold.
- Gli scaffold possono migliorare le capacità di trasferimento di fluidi.
- I metodi possono essere applicati a vari tessuti di fusti di piante.
- Non sono necessarie apparecchiature specializzate per queste tecniche.
Obiettivo dello studio
- Confrontare i metodi di decellularizzazione basati su detergenti e privi di detergenti.
- Valutare il potenziale delle matrici extracellulari vegetali come scaffold.
- Affrontare le sfide nello sviluppo di scaffold per l'ingegneria tissutale.
Metodi utilizzati
- Raccolta di campioni di foglie fresche o congelate di F.hispida.
- Conservazione dei campioni a -20 gradi Celsius.
- Emersione delle foglie in acqua deionizzata a 20-25 gradi Celsius.
- Taglio delle foglie in dischi di otto millimetri di diametro utilizzando un punzone per biopsia.
Principali risultati
- Entrambi i metodi di decellularizzazione preservano efficacemente la matrice extracellulare.
- Gli scaffold creati possono essere utilizzati in varie applicazioni di ingegneria tissutale.
- Le capacità di trasferimento di fluidi degli scaffold sono state migliorate.
- I metodi sono scalabili e applicabili alla maggior parte delle specie vegetali.
Conclusioni
- Le tecniche di decellularizzazione forniscono scaffold praticabili per l'ingegneria tissutale.
- Entrambi i metodi hanno vantaggi distinti e possono essere scelti in base a esigenze specifiche.
- La ricerca futura può esplorare ulteriori applicazioni degli scaffold derivati dalle piante.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Plant-derived scaffolds address critical biomaterials challenges in tissue engineering by offering scalable, biocompatible alternatives to autologous, synthetic, and animal-derived grafts. The described decellularization methods enable reproducible production of scaffolds with preserved extracellular matrix architecture, supporting fluid transfer and mechanical functionality essential for regenerative medicine applications. This positions plant-based systems as a strategic option for de-risking early-stage scaffold development in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of extracellular matrix contributions to scaffold biocompatibility and mechanical integrity.
- Operational Value: Provides standardized plant tissue preparation workflows applicable across species without specialized equipment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields scaffolds with quantifiable mechanical properties (UTS, MTM, SAF) for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay-ready scaffold production with low cellular metabolic impact, enabling reproducible cell-seeding experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of human cell responses (e.g., dermal thyroblasts, mesenchymal stem cells) on plant-derived matrices.
- Operational Value: Offers dual-method flexibility (detergent-based vs. detergent-free) to optimize scaffold properties for specific tissue engineering endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
These decellularization methods integrate into the discovery continuum by providing preparatory scaffolds for cell-based assays, supporting progression from biomaterial screening to preclinical validation in tissue engineering workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding plant extracellular matrix suitability as a scaffold foundation.
- Screening: Delivers reproducible scaffolds with measurable mechanical and biological outputs for comparative evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable data (genomic DNA reduction, metabolic activity, UTS) to inform scaffold selection criteria.
- Translational Research: Supports continuity from biomaterial discovery to preclinical testing via standardized scaffold production.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-agnostic protocol adaptable to multiple plant species, enhancing resource efficiency across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in scaffold performance by decoupling cellular and extracellular matrix contributions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized incubation times, solution concentrations, and washing steps.
- Strategic Value: Lowers development barriers by eliminating need for specialized equipment, enabling broader lab adoption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing scaffolds with tunable properties (e.g., UTS modulation via SDS vs. bleach).
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial handling and decellularization monitoring to prevent over-processing.
- Necessitates access to standard lab equipment (shake plate, hot plate, fume hood, biopsy punch) and reagents (SDS, bleach, sodium bicarbonate).
- Demands cross-team standardization of clearing endpoint assessment (e.g., visual inspection timing) to ensure batch consistency.
- Requires adaptation of incubation durations based on plant species and tissue thickness, as noted in sample variability observations.
- Involves safety considerations for handling detergents and bleach, including PPE use and fume hood operation during heated steps.
