Decellularizzazione e metodologia di ricellularizzazione per le vene safena umane

Questo metodo spiega una procedura dettagliata per l'ingegneria tissutale della vena safena. Dimostriamo anche la preparazione di configurazioni di decellularizzazione e bioreattori per la ricellularizzazione utilizzando semplici apparecchi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è necessario un semplice campione di sangue per la ricellularizzazione, eliminando così la dolorosa raccolta del midollo osseo e le lunghe procedure di coltura cellulare.

Per la perfusione e il lavaggio Triton-X 100, preparare la configurazione di decellularizzazione. In una camera da due litri, fissare con nastro adesivo tutti e tre i pezzi di tubo A.Fissare un tubo alla parete nel punto in cui il bordo tocca il fondo della camera per l'ingresso del detersivo. Fissare gli altri due tubi alla parete opposta con una distanza da cinque a 10 centimetri tra loro, a seconda della lunghezza della vena.

Almeno cinque centimetri di questi tubi dovrebbero anche essere attaccati con nastro adesivo al pavimento della camera. Collegare il tubo di ingresso del detersivo al tubo B utilizzando i connettori dell'esca maschio e femmina. Quindi collegare il tubo B al tubo F e il tubo F al tubo C.Collegare il tubo C all'ingresso della vena.

A questo punto, posizionare il tubo F nella cassetta della pompa peristaltica. Prendi un altro tubo C e collega un'estremità all'uscita della vena. Metti l'altra estremità in un barattolo di vetro dotato di un'uscita del tubo inferiore e posizionato a 45 centimetri sopra la camera, e fissalo con del nastro adesivo.

Questo funge da uscita del detersivo. Quindi, spingere un'estremità del tubo G nell'uscita del tubo del barattolo di vetro e posizionare l'altra estremità nella camera delle vene. Successivamente, preparare la configurazione di decellularizzazione due per la perfusione TnBP come descritto nel protocollo di testo.

Preparare anche la configurazione di decellularizzazione tre per la perfusione del DNA, come descritto nel testo, e posizionarla a 37 gradi Celsius. Per preparare il bioreattore di ricellularizzazione, inserire la provetta H in una porta di un tappo a quattro porte che funga da uscita della vena. Nella seconda porta, inserire il tubo I che funge da ingresso del fluido.

E nella terza porta, inserire il tubo J per l'ingresso della vena. Quindi, inserire l'altra estremità del tubo H nella quarta porta che funge da uscita del supporto. Collegare i connettori di riduzione alle estremità interne dei tubi H e J.Piegare l'altra estremità del tubo J a forma di U e legarlo con una sutura.

Ora, metti un tubo da 60 millilitri con una base piatta in un bicchiere da 250 millilitri. Quindi, collegare un'estremità del tubo K all'ingresso della vena e collegare l'altra estremità al tubo E.Collegare il tubo E a un secondo tubo K, quindi all'ingresso del fluido. Quindi posizionare la configurazione del tappo preparata nel tubo presente nella bottiglia.

Infine, sterilizzare il bioreattore mediante autoclave. Eseguire due cicli di congelamento-scongelamento su una vena safena umana come descritto nel protocollo di testo prima di tagliare una biopsia di due millimetri di lunghezza con le forbici. Fissare la biopsia in formaldeide per 24-48 ore a temperatura ambiente.

Legare ciascuna estremità della vena alle punte di un connettore per esche maschio e femmina con una sutura. Collegare la vena alla configurazione di decellularizzazione uno e riempire la camera con un litro di soluzione due. Ora, perfondere per 15 minuti a 35 millilitri al minuto e svuotare il contenuto della configurazione.

Quindi, aggiungere un litro di soluzione quattro e lasciare in infusione per quattro ore a 35 millilitri al minuto. Svuotare il contenuto, aggiungere 500 millilitri di soluzione due, perfondere per cinque minuti e svuotare nuovamente il contenuto. Scollegare la vena dalla configurazione di perfusione uno e collegarla alla configurazione di perfusione due.

Quindi, aggiungere un litro di soluzione cinque, accendere l'agitatore e perfondere per quattro ore a 35 millilitri al minuto. Scollegare la vena dalla configurazione di perfusione due e lavare due volte l'esterno della vena con 20 millilitri di acqua ultrapura. Quindi utilizzare una siringa per lavare due volte l'interno della vena con 20 millilitri di acqua ultrapura per 5-10 minuti.

Dopo aver effettuato la perfusione con la configurazione di perfusione tre come descritto nel protocollo di testo, collegare la vena alla configurazione di perfusione uno. Riempire un litro di soluzione due e perfondere per una notte a 35 millilitri al minuto. Ripetere il processo di perfusione quattro volte per la rimozione completa del materiale nucleare.

Dopo la perfusione, svuotare l'impianto, riempire un litro di soluzione due e perfondere per 24 ore a 35 millilitri al minuto. Trascorse 24 ore, svuotare nuovamente l'impianto e riempirlo con un litro di acqua ultrapura. Perfondere per altre 24 ore a 35 millilitri al minuto.

Infine, ripetere la perfusione utilizzando le stesse condizioni ma con la soluzione sette. Dopo aver verificato la decellularizzazione come descritto nel protocollo di testo, sterilizzare la vena mettendola in una provetta da 50 millilitri contenente 50 millilitri di soluzione otto. Agitare a 80 rotazioni al minuto in uno shaker per un'ora a 37 gradi Celsius.

Lavorando in una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità, ora utilizza una pinza sterile per trasferire la vena sterile in una nuova provetta da 50 millilitri contenente 50 millilitri di soluzione sterile sette, contenente 500 microlitri di anti anti. Agitare la vena come prima per 12 ore, cambiando la soluzione sette almeno due volte tra l'una e l'altra. Utilizzando una pinza sterile, trasferire la vena in una nuova provetta da 50 millilitri, aggiungere 50 millilitri di terreno endoteliale e agitare per 11 ore.

Ora, collegare la vena legandola all'ingresso e all'uscita della vena del bioreattore con sutura sterile e pinza e serrare il tappo al flacone da 250 millilitri. Riempire il bioreattore con lo stesso mezzo endoteliale. Aggiungere eparina a 50 unità per millilitro e perfondere per un'ora a due millilitri al minuto nell'incubatrice.

Raccogliere da 15 a 25 millilitri di sangue fresco dal donatore in provette vacutainer rivestite di eparina e diluirlo uno a uno con una soluzione di steen. Successivamente, aggiungere il fattore di crescita dell'endotelio vascolare derivato dalle ghiandole endocrine, il fattore di crescita dei blasti fibroblastici basici e un sottile acido salicilico. Dopo aver svuotato il terreno endoteliale dal bioreattore, aggiungere il sangue e perfondere per 48 ore a due millilitri al minuto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica.

Circa 12 ore dopo, lavorare nella cabina a flusso laminare per rimuovere una goccia di sangue dal bioreattore e misurare il glucosio utilizzando un dispositivo di monitoraggio della glicemia. Se il livello è inferiore a tre millimoli per litro, aggiungere glucosio per portarlo nell'intervallo da sette a nove millimoli per litro. Dopo 48 ore di nuovo nell'incubatrice, drenare il sangue dal bioreattore nella cappa a flusso laminare.

Aggiungere 30 millilitri di soluzione sterile sette, perfondere per cinque minuti e scolare la soluzione. Ripeti questo processo fino a quando il colore rosso sangue non viene perso. Infine, aggiungere da 30 a 45 millilitri di terreno endoteliale e perfondere per 96 ore nell'incubatrice a due millilitri al minuto.

Scollegare la vena ricellularizzata dal bioreattore nella cappa a flusso laminare, tagliare i bordi di cinque millimetri della vena usando le forbici e scartarla. Eseguire una biopsia come prima, immergerla in formaldeide ed eseguire la verifica della ricellularizzazione come descritto nel protocollo di testo. La morfologia grossolana di una vena normale sembra di colore rosso vivo.

Il colore rosso si perde nei cicli di decellularizzazione progressiva e, dopo cinque cicli di trattamento, appare pallido e bianco. La vena ricellularizzata dalla perfusione del sangue periferico e del mezzo endoteliale appariva di nuovo di colore rosso vivo. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa di colorazione con emotossilina ed eosina di vena normale che mostra la presenza di molti nuclei blu.

Tuttavia, nuclei blu non sono stati osservati nella colorazione con emotossilina ed eosina della vena decellularizzata. Nella vena ricellularizzata perfusa con sangue e mezzo endoteliale, la colorazione con emotossilina ed eosina ha mostrato la presenza di attacco cellulare al lume. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la decellularizzazione della vena safena con detergenti e la ricellularizzazione con sangue periferico e mezzo endoteliale.

Questa tecnica di decellularizzazione utilizzando la perfusione di Triton-X 100, TnBP e DNA sotto pressione ha avuto successo ed è stata riproducibile nella rimozione di nuclei dalle vene safene umane. Sebbene questa tecnica richieda 20 giorni per essere completata, la conservazione della vena decellularizzata come prodotto after-shelf ridurrà il tempo della procedura a otto giorni. La ricellularizzazione delle vene utilizzando il sangue periferico del ricevente può essere considerata clinicamente rilevante.

La vena ricellularizzata con un protocollo simile si è dimostrata promettente nel trapianto clinico, fornendo un apporto di sangue funzionale dopo l'operazione. Con lievi modifiche, questo protocollo può essere utilizzato per qualsiasi tipo di vena e come innesto personalizzato nelle cliniche per tutti gli interventi di chirurgia vascolare.