Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

Qui, presentiamo un protocollo per tappa e sezionare lo sviluppo di tessuto olfattivo da specie di Drosophila . Il tessuto dissecato più tardi può essere utilizzato per le analisi molecolari, quali quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) o RNA sequenziamento (RNAseq), così come in vivo analisi quali immunoistochimica o in situ ibridazione.

L'obiettivo generale della stadiazione e della dissezione dei tessuti olfattivi in via di sviluppo della pupilla e della periferia adulta nelle specie di Drosophila è quello di generare campioni per analisi molecolari e di sviluppo dei tessuti olfattivi periferici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo e dell'evoluzione del sistema olfattivo, come la dinamica di espressione, i livelli e i modelli di geni specifici nei tessuti olfattivi periferici in via di sviluppo. Attraverso questo metodo possiamo ottenere informazioni sullo sviluppo del sistema olfattivo periferico nelle specie di Drosophila.

Può essere applicato anche ad altri sistemi sensoriali, come il gusto periferico e i sistemi visivi. Per un esperimento di sequenziamento dell'RNA, pianificare la raccolta di 100-200 dischi antennali o antenne per quattro diverse fasi di sviluppo. Per l'immunoistochimica, pianificare di sezionare da 10 a 20 mosche.

Pulire tutti i materiali coinvolti nella dissezione utilizzando etanolo al 70%. Quindi, pulire ulteriormente i materiali con neutralizzatori di RNasi. E prepara tutte le soluzioni utilizzando acqua priva di nucleasi o trattata con DEPC.

Per raccogliere le pupe, monitorare le larve a intervalli di 30 minuti. E raccogli la pupa allo stadio prepupale APF dell'ora zero. Le larve saranno immobili e circondate da una custodia pupale molto leggera, di colore quasi bianco.

A questo punto, trasferisci le larve in una piccola capsula di Petri da due pollici con una carta da filtro umida. Per le dissezioni dello stadio APF dell'ora zero, procedere immediatamente al prelievo del disco antennale prepupale. Altrimenti, copri il piatto con pellicola di paraffina e lascia che gli animali si sviluppino a 25 gradi Celsius, fino a quando non sono allo stadio di sviluppo di interesse.

Per mettere in scena lo sviluppo delle pupe di altre specie di Drosophila, raccogli le larve prepupali dell'ora zero e ordinale in una fiala fresca. Quindi registra il numero di giorni dalla prepupa all'età adulta. E semplicemente ridimensiona questo tempo alla linea temporale per melanogaster.

Per iniziare, raffreddare 150 microlitri di soluzione di isolamento dell'RNA in un tubo da 1,5 millimetri privo di RNasi. Successivamente, depositare diverse goccioline separate di PBS sul tampone di dissezione. In ogni goccia di PBS, posiziona una pupa da sezionare.

Per le pupe da zero a due ore, usa una pinza per afferrare i ganci della bocca e tirare queste strutture per strappare ed esporre il cervello e i dischi immaginali. Per le pupe di otto ore, prima staccare delicatamente la custodia pupale dal quarto più anteriore della pupa, per esporre la testa in via di sviluppo. Quindi staccare la testa dall'articolazione del collo.

I dischi antennali si trovano nella testa in questa fase di sviluppo. Ora trasferisci i tessuti contenenti i dischi antennali in un'altra gocciolina di PBS. Successivamente, identificare il disco antennale dell'occhio collegato al cervello ai lobi ottici.

Usando una pinza, scollegare il disco dell'antenna oculare e trasferirlo in una nuova gocciolina. Nelle pupe di otto ore, i dischi oculari coprono i dischi antennali ed entrambi sono anteriori al cervello. Nella gocciolina successiva, dividere l'occhio e i dischi antennali usando una pinza.

Quindi, utilizzando un puntale per pipetta P20, raccogliere delicatamente il tessuto sezionato con una quantità minima di liquido. Depositare il disco nel reagente della soluzione di isolamento dell'RNA e continuare a sezionare i dischi antennali fino a raccoglierne almeno 100. Entro 40 ore dalla formazione della pupa, l'antenna adulta ha assunto la sua forma definitiva, ma è ancora trasparente.

In questa fase sono necessarie almeno 50 prepupe per la raccolta della sequenza di RNA. Per prima cosa preparare 150 microlitri di soluzione di isolamento dell'RNA refrigerato. Sul tampone di dissezione, posizionare una pupa in una gocciolina di PBS.

Quindi stabilizzare il corpo con un paio di pinze e staccare delicatamente la custodia pupale dal quarto più anteriore per esporre la testa. Quindi, rimuovere con cautela la testa dall'articolazione del collo. Ora trasferisci delicatamente la testina in una gocciolina pulita di PBS.

Lì per rimuovere la membrana che circonda la testa, pipettare la testa su e giù nel PBS. Con questa pulizia, l'antenna dovrebbe diventare visibile. Scollegare ora l'antenna dalla membrana tra il secondo e il terzo segmento in corrispondenza del giunto segmentale.

Il terzo segmento contiene i recettori olfattivi antennali. Quindi utilizzare una pipetta per trasferire delicatamente il tessuto sezionato nella soluzione di isolamento dell'RNA, riducendo al minimo la quantità di liquido trasferito. Per l'estrazione dell'RNA, sezionare gli adulti mentre sono anestetizzati su un tampone di CO2.

Innanzitutto, trattare il tampone di CO2 e la pinza con inibitori della RNasi. Quindi anestetizzare gli adulti e visualizzare il tampone al microscopio da dissezione. Usando due paia di pinze, stabilizzare il corpo e tirare o pizzicare delicatamente il terzo segmento antennale dal secondo segmento antennale per raccogliere i tessuti.

Trasferire le antenne in un tubo di soluzione di isolamento dell'RNA immergendo la pinza nel liquido e rilasciandola. L'antenna deve essere sommersa. Se l'antenna si blocca sulla parete laterale, l'RNA si degraderà prematuramente.

Dopo aver raccolto un numero sufficiente di antenne, procedere con l'estrazione dell'RNA. Oppure conservare la provetta di raccolta a 80 gradi Celsius a tempo indeterminato. Se l'antenna è destinata all'immunoistochimica, eseguire questa dissezione su un tampone di dissezione con la mosca immersa in PBS con o senza Tritone.

Il tessuto olfattivo in via di sviluppo sezionato può essere utilizzato per l'estrazione dell'RNA seguita da RT-PCR per valutare l'espressione genica. Ad esempio, l'espressione dei trascritti dei recettori di superficie e dei recettori olfattivi può essere studiata in questo modo. In alternativa, i tessuti possono essere utilizzati per l'immunoistochimica per determinare il pattern di espressione e la localizzazione subcellulare dei geni di interesse.

Ad esempio, i moscerini transgenici Rn-EGFP possono essere colorati con anticorpi anti-GFP e anti-laminina. L'analisi mostra che a 40 ore dalla formazione della pupa, il gene Or67d è attivo in cellule specifiche dell'antenna, guidando l'espressione di GFP sotto il sistema GAL4-UAS. Una volta padroneggiate, le dissezioni possono essere eseguite in un'ora se eseguite correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il tempo e di programmare adeguatamente la raccolta, l'invecchiamento e la dissezione, in base al periodo di sviluppo delle pupe per ciascuna specie di Drosophila. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la qRT-PCR, l'immunoistochimica e altre tecniche di colorazione in vivo e di profilazione trascrizionale per rispondere a ulteriori domande riguardanti il modello e i profili di trascrizione a livello di sistemi all'interno di un tessuto in via di sviluppo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'evoluzione e dello sviluppo dei sistemi sensoriali per esplorare le dinamiche trascrizionali e la scoperta di nuovi geni in altri sistemi sensoriali nelle specie di Drosophila.

Non dimenticare che lavorare con pinze affilate, alcune soluzioni di estrazione dell'RNA e formaldeide può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come la pratica precedente con le dissezioni, per sviluppare le capacità motorie, l'elevata attenzione e l'uso di abiti da laboratorio adeguati.