2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Questo metodo può essere utilizzato non solo per affrontare questioni chiave nella ricerca di base, ma anche per contribuire ai campi medico, farmaceutico e biotecnologico, delineando nuovi piccoli ligandi molecolari di proteine essenziali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi parallela delle proteine e dei partner metabolici della proteina di scelta in condizioni strettamente vivo. Questo metodo aiuta a pescare molecole interagenti senza essere limitato a ligandi preselezionati.

Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per le piante, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le cellule HeLa, E.coli e S.Cerevisiae. Per iniziare, prepara il terreno MSMO e regola il pH a 5,7 con un idrossido di potassio molare. Quindi, sterilizzare in autoclave la soluzione per 15 minuti a 121 gradi Celsius.

Aggiungi gli integratori al terreno appena prima dell'inizio dell'esperimento. Ora, coltiva la coltura cellulare transgenica di PSBL Arabidopsis thaliana in 50 millilitri di terreno MSMO in un pallone da 100 millilitri. Quindi, posizionare il pallone su un agitatore a piattaforma orbitale e agitare delicatamente le celle a 130 giri/min a 20 gradi Celsius alla luce.

Ogni sette giorni, sottocoltivare le cellule in terreno fresco con una soluzione da uno a 10. Successivamente, utilizzare un imbuto di vetro con una rete di nylon montata su un pallone conico, collegato a una pompa a vuoto per raccogliere le cellule durante la fase di crescita logaritmica. Quindi, avvolgere le celle essiccate in un foglio di alluminio e congelarle in azoto liquido.

Utilizzando un vibromulino pre-raffreddato, impostato ad una frequenza vibrazionale di 20 hertz. Omogeneizzare il materiale cellulare vegetale raccolto e congelato in una polvere fine per due minuti. Quindi, aliquotare tre grammi di polvere macinata per campione utilizzando azoto liquido, apparecchiature pre-refrigerate per evitare che si scongeli.

Quindi, utilizzando una malta pre-raffreddata con azoto liquido, triturare la polvere macinata con tre millilitri di tampone di lisi ghiacciata fino a quando non si scongela. Dividere immediatamente il campione scongelato in provette da microcentrifuga da due millilitri. Centrifugare i campioni a 20, 817 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari.

Durante la centrifugazione del campione, aliquotare 100 microlitri di perle di sefarosio IgG per campione. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi e risospendere le perle mediante vortex. Flash centrifugare per tre secondi a 2.000 g ed eliminare il tampone di lisi.

Infine, risospendere le perle in 400 microlitri di tampone di lisi. Dopo la centrifugazione, trasferire tre millilitri di lisato vegetale chiaro in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri. Aggiungere le perle pre-equilibrate al lisato vegetale e incubare la miscela su una ruota rotante per un'ora a quattro gradi Celsius.

Trasferire la miscela in una siringa collegata a un tappo bloccato da un'esca su una colonna rotante con un filtro poroso di 35 micrometri situato sulla parte superiore del collettore del vuoto. Far passare il lisato attraverso l'unità accendendo la pompa del vuoto con una leggera pressione per evitare danni alle perline. Il lisato non legato viene drenato nella stazione di scarto situata alla base del collettore e i complessi proteici, legati alle perle, rimangono sul filtro.

Una volta svuotata la siringa dal lisato cellulare, aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio per lavare le perle. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione per eseguire la seconda fase di lavaggio. Ora, rimuovi la siringa e il tappo di blocco dell'esca.

Chiudere il tappo inferiore della colonna e aggiungere alle perle 400 microlitri del tampone di eluizione contenente 50 unità della forma potenziata del virus dell'incisione del tabacco, la proteasi. Posizionare la colonna su uno shaker da tavolo, impostato a 1.000 giri/min per 30 minuti a 16 gradi Celsius. Quindi, aggiungere altre 50 unità di proteasi alla colonna e incubare la miscela sull'agitatore come nel passaggio precedente.

Quindi, rimuovere il tappo inferiore e riposizionare la colonna in una provetta per microcentrifuga da due millilitri. Centrifugare a 20,817 g per un minuto per raccogliere l'eluato e procedere con l'estrazione di proteine e metaboliti. Per iniziare l'estrazione, aggiungere all'eluato un millilitro di solvente acquoso di metanolo MTBE da tre a uno.

Capovolgere il tubo per miscelare al campione. Quindi, aggiungere 0,4 millilitri di soluzione acquosa di metanolo alla miscela e capovolgere la provetta per miscelare il campione. Quindi, centrifugare il campione a 20, 817 g per due minuti a temperatura ambiente per consentire la separazione di fase.

Utilizzando una pipetta manuale per la manipolazione dei liquidi da un millilitro, rimuovere la fase superiore contenente i lipidi. Quindi, aggiungere 0,2 millilitri di metanolo e capovolgere la provetta per miscelare il campione. Centrifugare a 20, 817 g per due minuti a temperatura ambiente e raccogliere la fase polare in una nuova provetta per le misurazioni dei metaboliti.

Lasciare circa 50 microlitri della fase polare sul fondo del tubo per evitare di spostare il pellet proteico. Quindi, asciugare il tubo contenente la fase polare in un evaporatore centrifugo per una notte. Asciugare i tubi di pellet proteico per 30-60 minuti per evitare che si secchino eccessivamente.

Utilizzando la purificazione di affinità in un solo passaggio, insieme alla spettrometria di massa, sono state identificate le interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita in colture cellulari transgeniche di arabidopsis thaliana. Le colture cellulari che esprimono NDPK1 mostrano un arricchimento significativo in valina-leucina, isoleucina glutammato, leucina isoleucina e isoleucina fenilalanina rispetto ai campioni di vettore vuoto, NDPK2 e NDPK3. Per cercare interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita note, 13 proteine e quattro dipeptidi co-eluenti con NDPK1, sono stati interrogati nel database stitch.

Le principali associazioni si osservano tra l'ortologo APX1 e la famiglia delle aldeidi deidrogenasi, e il fattore di inizio della traduzione, FBR12, con l'omologo del fattore di inizio della traduzione della subunità alfa due. I dipeptidi identificati non mostrano partner proteici segnalati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere freddi i campioni, le attrezzature e i reagenti durante l'esperimento. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la termoforesi al microscopio o il saggio di attività, al fine di determinare l'interazione diretta tra le molecole o l'inferenza del loro ligando sull'attività proteica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come maneggiare il campione durante l'intera procedura per ottenere risultati affidabili e identificare i ligandi della tua proteina preferita.

Non dimenticare che lavorare con metanolo e soluzione MTBE può essere estremamente pericoloso. È necessario indossare dispositivi di protezione individuale adeguati e prendere sempre precauzioni, come lavorare sotto la cappa aspirante, durante l'esecuzione di questa procedura.