Name: 2 in 1: purificazione di affinità per lanalisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri la purificazione di affinità per analizzare interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita in colture cellulari di Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente l'identificazione parallela di partner molecolari in condizioni viventi.

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Vorremmo ringraziare gentilmente Dr. Lothar Willmitzer per il suo coinvolgimento nel progetto, discussioni produttive e grande vigilanza. Siamo grati al Dr. Daniel Veyel per aiutare con le misure di MS di proteomica. Apprezziamo la signora Änne Michaelis che ci ha fornito prezioso aiuto tecnico con misurazioni di LC-MS. Inoltre, vorremmo ringraziare il Dr. Monika Kosmacz e Dr. Ewelina Sokołowska per l'aiuto e il coinvolgimento nel lavoro sul manoscritto originale e di Weronika Jasińska per il supporto tecnico.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo presentato permette l'identificazione parallela di PP e PM complessi di una proteina dell'obiettivo. Dalla clonazione ai risultati finali, l'esperimento può essere completato in appena 8-12 settimane. Completa AP prende circa 4-6 h per un set di 12 a 24 campioni, rendendo il nostro protocollo adatto per analisi di rendimento medio.
Il protocollo, pur essendo nel complesso semplice, ha un numero di passaggi critici. (i) sufficienti quantità di proteina input e branelli di affinità è cruciale per raggiungere una gamma dinamica di rilevamento del metabolita. Lisi cellulare efficiente sono quindi un passo cruciale nella procedura. Proteina poveri rendimenti possono essere una conseguenza dell'insufficiente polverizzazione del materiale o di non ottimale rapporto di lisi-buffer/materiale. (ii) dovrebbe prestare attenzione che i reagenti utilizzati sono MS-friendly. Detergenti aggressivi, glicerolo o una quantità eccessiva di sale dovrebbe essere evitata come interferiscono con rilevazione di MS. (iii) dell'agarosi branelli non dovrebbero essere eccessivamente secchi durante fasi di lavaggio, e quando si utilizza un collettore sottovuoto è importante applicare un tasso di flusso lento così come non per distruggere i branelli o influenzare la stabilità del complesso.
Ci sono alcune importanti modifiche possibili al protocollo presentato: (i) usiamo il promotore CaMV35S costitutivo per massimizzare la quantità di proteina esca. Sovraespressione, mentre molto utile, può avere gravi effetti sulla cella omeostasi28 e portano alla formazione di interazioni fisiologicamente irrilevante. Espressione di proteine etichettate utilizzando promotori nativi e dove possibile in una priorità bassa di perdita-de-funzione è considerata superiore per il recupero veri Interactiani biologici. Per le proteine non normalmente espresse in colture di cellule vegetali, una priorità bassa della pianta può rivelarsi necessaria per identificare gli interattori pertinenti. (ii) quando si lavora con proteine di membrana, il buffer di Lisi deve essere completata con un detergente compatibile con MS. (iii) l'introduzione di una seconda fase di purificazione di affinità potrebbe migliorare falsi positivi al rapporto di vero-positivi ed eliminano la necessità per EV controlli29. Un tag romanzo tandem con due siti di proteasi-taglio indipendente presenta un'alternativa attraente per il passo di cromatografia di esclusione dimensionale aggiunto da Maeda et al 201411, che è sia laboriosa e che richiede tempo.
L'inconveniente più grave dell'AP è l'alto tasso di falsi positivi. Le ragioni sono numerose. Sovraespressione costitutiva è stato già citata. Un'altra fonte di interazioni fisiologicamente irrilevante, a meno che lavorando con gli organelli isolati, è la preparazione di lisati di cellule intere contenenti miscele di proteine e metaboliti da diversi compartimenti subcellulari. Localizzazione sottocellulare dovrebbe essere utilizzata per filtrare gli Interactiani veri. Tuttavia, la maggior parte dei falsi positivi dovuti a aspecifici associazione tra proteine e resine di agarosio. Introduzione di una seconda fase di purificazione, come descritto in precedenza, offre la migliore soluzione al problema, tuttavia è disponibile al costo di tempo e velocità effettiva. Inoltre, più debole interazione può essere perso come si allunga il protocollo. Un altro avvertimento di AP è che, nonostante le informazioni complete che fornisce sui Interactoma di una proteina bersaglio, differenziando tra obiettivi diretti e indiretti della proteina innescato è impossibile. Sono necessari approcci bimolecolari mirati per confermare interazioni.
AP accoppiato con metabolomica basata su MS-è stata usata per studiare i complessi della proteina in S. cerevisiae12. Quest'opera, insieme a nostra osservazione precedente13 che, similmente ai lipidi, composti polari e semi-rimangano legati a complessi della proteina isolati da lisati cellulari, fornito basi concettuali per il protocollo presentato. Il nostro protocollo è caratterizzato da tre punti: (i) In opposizione al lievito lavorare12, dimostra che AP è adatto per il recupero non solo ligandi di proteine idrofobiche ma anche idrofili. (ii) con l'introduzione di un protocollo di estrazione di tre-in-one, un singolo punto di accesso consente di studiare la proteina ed il metabolita interattori della proteina esca. (iii) abbiamo adattato il protocollo per cellule vegetali.
Gli sforzi futuri si concentreranno sulla creazione di un tag di romanzo tandem con due siti di proteasi-taglio indipendente. Vorremmo anche esplorare l'idoneità del protocollo a basso-abbondanza di piccole molecole quali ormoni vegetali.

Il metodo qui descritto mira all'identificazione di partner metabolita e proteina di una proteina di scelta in condizioni di lisato cellulare vicinoin vivo . Si è ipotizzato che molti metaboliti più che caratterizza oggi hanno un' importante funzione regolatrice1. Metaboliti possono fungere da interruttori biologici, cambiando l'attività, la funzionalità e/o la localizzazione di loro recettore proteine2,3,4. Nell'ultimo decennio diversi metodi di innovazione, che consente di identificare delle PMI in vivo o in condizioniin vivo vicino, sono stati sviluppati5. Approcci disponibili possono essere separati in due gruppi. Il primo gruppo comprende tecniche che iniziano con un noto-metabolita esca per intrappolare partner nuova proteina. Metodi includono cromatografia di affinità6, droga affinità reattivo destinazione-stabilità test7, chemio-proteomica8e proteoma termica9di profilatura. Il secondo gruppo è costituito da un singolo metodo che inizia con una proteina nota per identificare piccole molecole leganti10,11.
AP accoppiato con lipidomica basati su MS è stato utilizzato per analizzare i complessi proteina-lipide in Saccharomyces cerevisiae12. Come punto di partenza, gli autori hanno usato i ceppi di lievito che esprimono 21 enzimi coinvolti nella biosintesi dell'ergosterolo e 103 chinasi fuse con una purificazione di affinità tandem (TAP) tag. 70% degli enzimi e il 20% delle chinasi sono stati trovati per associare diversi ligandi idrofobici, mettendo in luce la rete di interazione proteina-lipide intricati.
In precedenza, potremmo dimostrare che, similmente ai lipidi, composti polari e semi-anche rimangano legati a complessi della proteina isolati dai lisati cellulari13. Basato su questi risultati, abbiamo deciso di ottimizzare l'AP metodo precedentemente pubblicato10,11 tra cellule vegetali e composti idrofili14. Per questo scopo, abbiamo utilizzato vettori TAP descritti da Van Leene et al. 2010, utilizzato con successo nella pianta PPI studi15. Per accorciare il tempo necessario per ottenere linee transgeniche, abbiamo deciso su colture cellulari di Arabidopsis. Abbiamo impiegato un One-Step metil tert-butil etere (MTBE) / metanolo/acqua estrazione metodo, permettendo la caratterizzazione delle proteine (pellet), lipidi (fase organica) e metaboliti idrofili (fase acquosa)16 in una singola esperimento di purificazione di affinità. Linee di controllo di EV sono stati introdotti per escludere falsi positivi, ad esempio proteine leganti al tag da solo. Come prova di concetto siamo taggati tre (di cinque) delle chinasi del nucleoside difosfato presentano nel genoma di Arabidopsis (NDPK1-NDPK3). Tra altri reperti, potremmo dimostrare che NDPK1 interagisce con il glutatione S-transferasi e del glutatione. Di conseguenza potremmo dimostrare che NDPK1 è sottoposto a glutationilazione14.
Per riassumere, il protocollo presentato è un importante strumento per la caratterizzazione di proteine e reti di interazione della proteina-piccolo-molecola e costituisce un importante passo in avanti rispetto ai metodi esistenti.

<table><tbody><tr><td>Sali basali di Murashige e Skoog con sostanze organiche minime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>Acido 1-naftilacetico</td> Soluzione di chinetina <td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 inibitore della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Proteasi</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&nbsp; Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>IgG-HRP anti-topo di capra</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Mix di tripsina / lisi-C, grado di massa</td><td>Promega</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Tiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>metanolo&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>acido formico&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Agitatore a piattaforma</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Rete di nylon (Diametro del filo 34 & micro; M, spessore 55 & micro; M, area aperta 14%)</td><td>Prosepa</td><td>Imbuto in vetro per ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Tappo del flacone con filtro 500 mL 0,2 &; M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Vibromulino MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol ""Classic"" con 2 diversi tappi a vite senza filtri</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filtro (piccolo) 35 &; micro; Dimensione dei pori M, per Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore per tubi a velocità variabile SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Piatti rotanti per rotatori SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Collettori SPE a 24 porte Resprep</td><td>Restek&nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE Colonne 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Autocampionatore&nbsp; Fiale</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&ouml; r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Colonna</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografo liquido EASY-nLC 1000</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Spettrometro di massa ibrido quadrupolo-orbitrap</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Acquity UPLC&nbsp;</td><td>Acque&nbsp;</td><td>Ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Colonna, 100A, 1.8 &; M, 2,1 mM X 100 mM, 1/pkg</td><td>Acque</td><td></td><td></td>186003533</tr><tr><td>Bagni di pulizia ad ultrasuoni ad alta potenza per soluzioni di pulizia acquosa</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN NaN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Processi cellulari sono regolati dalle interazioni tra molecole biologiche come proteine e metaboliti acidi nucleici. Mentre l'indagine sulle interazioni proteina-proteina (PPI) è una novità, approcci sperimentali con l'obiettivo di caratterizzare le interazioni della proteina-metabolita endogeno (PMI) costituiscono uno sviluppo piuttosto recente. Qui, presentiamo un protocollo che consente la simultanea caratterizzazione del PPI e PMI di una proteina di scelta, di cui come esca. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per Arabidopsis cell culture e combina la purificazione di affinità (AP) con spettrometria di massa (MS)-base di rilevazione della proteina e del metabolita. In breve, linee transgeniche di Arabidopsis, che esprimono la proteina esca fusa a un tag di affinità, in primo luogo vengono lisate per ottenere un estratto cellulare nativo. Anticorpi anti-tag sono usati per tirare giù partner della proteina e del metabolita della proteina esca. I complessi purificato per affinità vengono estratti mediante un One-Step metil tert-butil etere (MTBE) / metanolo/acqua metodo. Mentre metaboliti separano in polare o la fase idrofoba, proteine possono essere trovate nel pellet. Entrambi i metaboliti e proteine vengono poi analizzate tramite spettrometria della cromatografia-massa liquida ultra-prestazioni (UPLC-MS o UPLC-MS/MS). Linee di controllo di vuoto-vector (EV) vengono utilizzati per escludere falsi positivi. Il vantaggio principale del nostro protocollo è che esso consente l'identificazione dei partner della proteina e del metabolita di una proteina dell'obiettivo in parallelo in condizioni di quasi-fisiologiche (lisato cellulare). Il metodo proposto è semplice, veloce e può essere facilmente adattato a sistemi biologici diversi da colture di cellule vegetali.

Nello studio originale, tre geni di a. thaliana NDPK overexpressed in colture di sospensioni cellulari PSB-L sotto il controllo del promotore 35S costitutiva14 (Figura 1). Tag di affinità tandem è stato fuso a due estremità carbossi - o amminico-terminale di una proteina esca. I complessi purificato per affinità sono stati sottoposti a MTBE/metanolo/acqua estrazione16. Affinità-tirato proteine e piccole molecole sono stati identificati usando MS (tabelle S2 e S3).
Per correggere errori di falsi positivi, campioni bianchi sono stati utilizzati per escludere le sostanze contaminanti della piccolo-molecola da prodotti chimici e consumabili per laboratorio. Inoltre, metaboliti e proteine che legano sia un tag di affinità o resina da solo sono state contabilizzate utilizzando linee di controllo EV. Per recuperare i veri positivi, due code non associati Student t-test e tasso di falsi scoperta Benjamini &amp; Hochberg correzione è stata applicata per identificare metaboliti (Tabella S4) e proteine (Tabella S5) arricchiti in modo significativo l'AP NDPKs esperimenti (N - e C-terminali contrassegnati NDPKs) in confronto le linee di controllo EV (FDR &lt; 0,1). Si noti che nel lavoro precedente, abbiamo usato i criteri di presenza/assenza di delineare interattori della proteina e della piccolo-molecola.
Risultati rappresentativi sono dato per NDPK1, mentre il metabolita dati focus su dipeptidi, una nuova classe di regolatori della piccolo-molecola studiata nel nostro gruppo. Analisi proteomica ha rivelato 26 partner della proteina presunta di NDPK1. Applicando un filtro ulteriore per proteine co-localizzati nello stesso contenitore subcellulare NDPK1 (citosol), l'elenco ristretto giù per 13 interattori della proteina presunta. Tra le proteine identificate erano glutatione S-transferasi, fattori di inizio due allungamento, tubulina e aconitato idratasi. Analisi metabolomica ha rivelato quattro dipeptidi Val-Leu, Ile-Glu, Leu-Ile e Ile-Phe che specificamente co-eluiti con NDPK1 (Figura 2). Si noti che tutti i quattro dipeptidi condividono un residuo idrofobico in loro N-terminale, suggerendo la specificità di legame comune.
Per cercare noti complessi proteina-proteina e proteina-metabolita abbiamo interrogato 13 identificate proteine e quattro dipeptidi contro il Stitch database25 (Figura 3). Potrebbero essere fatto diverse osservazioni: (i) nessuna degli Interactiani precedentemente è stata segnalata per NDPK1. (ii) APX1 ortholog è stato segnalato per interagire con aldeide deidrogenasi membro della famiglia ALDH7B4, mentre il fattore di inizio di traduzione FBR12 con un altro fattore di inizio di traduzione codificato dal gene AT2G40290. (iii) i dipeptidi identificati non sono segnalati partner proteici. Co-eluiti dipeptidi non sono stati segnalati in precedenza come associati a qualsiasi proteina vegetale estratto. Tuttavia, essi svolgono i ruoli importanti in altri organismi: Leu-Ile, per esempio, ha un effetto d'attivazione neurotrophin in una linea cellulare umana26. Si noti che l'esperimento non consente di identificare l'esatta topologia del sistema. Ad esempio, un dipeptide può interagire direttamente con NDPK1 ma ben può essere collegato a qualsiasi delle proteine co-purificate.
Presi insieme, i nostri risultati indicano che la procedura stabilita, che impiegano AP insieme a spettrometria di massa, facilita l'identificazione di interattori della proteina-proteina e proteina-piccolo-molecola e aiuta a genera informazioni esaustive circa la Interactoma della proteina bersaglio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Figura 1. Schema di flusso di lavoro AP-MS. (A) preparazione di una frazione solubile nativa da colture cellulari vegetali. (B) passaggi successivi della procedura di AP. Dopo aver caricato il campione sulla colonna, la proteina di interesse (PDI) fuso a un tag di rubinetto si lega all'anticorpo di IgG immobilizzati sulle perle di agarosio. Lavaggio della colonna facilita la rimozione delle proteine non associati e metaboliti. Dopo aver eseguito AcTEV fenditura, complessi proteina-metabolita POI vengono eluite. (C) separazione dei complessi nella frazione della proteina e del metabolita, seguita da analisi semi-quantitativa di MS. Questa figura è riprodotta da Luzarowski et al 201714. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Figura 2. Dipeptidi in particolare co-eluizione con NDPK1. Intensità media di quattro dipeptidi Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)e Ile-Phe (D) misurato in esperimento di AP sono state tracciate. Tutti i quattro dipeptidi Visualizza arricchimento significativo nei campioni di NDPK1 rispetto al controllo di EV (asterischi rappresentano FDR &lt; 0,1). Barre di errore rappresentano errore standard per 6 misure (3 replicati del N - e 3 di C-terminale etichettato proteine). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Figura 3. Rete di interazione di tutte le molecole co-eluizione con NDPK1, eseguire una query su database STITCH considerando solo precedente sperimentali ed evidenze di database (fiducia &gt; 0,2). Confidence più elevato indica una maggiore probabilità di interazione e viene calcolato in base ai dati depositati. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella S1. MaxQuant uscita tabella "parameters.txt". Tabella include i valori di soglia per identificazione e quantificazione, così come informazioni sui database utilizzati. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella S2. Informazioni da MaxQuant uscita tabella "proteinGroups.txt". Tabella contiene un elenco di tutti i gruppi di proteine identificate, intensità e ulteriori informazioni quali numero di peptidi unici e punteggio. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella S3. File di output contenente analisi di metaboliti polari. Tabella contiene un elenco di tutte le caratteristiche di massa identificati caratterizzata da specifiche m/z, RT e intensità. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella S4. Dipeptidi trovano in campioni di AP in cui NDPK1, NDPK2 o NDPK3 sono stati usati come esca. Dipeptidi presenti in campioni bianchi sono stati esclusi dall'elenco. Due linee indipendenti (contrassegnati in entrambi N - o C-terminale) per ogni NDPK sono stati eseguiti in triplice copia. Dello studente t-test e ulteriore correzione del p-valore utilizzando Benjamini &amp; Hochberg metodo sono stati usati per determinare significativamente arricchito interactor partner di NDPKs (FDR &lt; 0,1). Dato ΔRT viene calcolato in relazione ai composti di riferimento e Δppm in relazione monoisotopic massa dato in Metlin27. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella S5. Le proteine co-purificate con NDPK1. Due linee indipendenti (contrassegnati in entrambi N - o C-terminale) per ogni NDPK sono stati eseguiti in triplice copia. Dello studente t-test e ulteriore correzione del p-valore utilizzando Benjamini &amp; Hochberg metodo sono stati usati per determinare significativamente arricchito interactor partner di NDPKs (FDR &lt; 0,1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Questo metodo può essere utilizzato non solo per affrontare questioni chiave nella ricerca di base, ma anche per contribuire ai campi medico, farmaceutico e biotecnologico, delineando nuovi piccoli ligandi molecolari di proteine essenziali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi parallela delle proteine e dei partner metabolici della proteina di scelta in condizioni strettamente vivo. Questo metodo aiuta a pescare molecole interagenti senza essere limitato a ligandi preselezionati.Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per le piante, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le cellule HeLa, E.coli e S.Cerevisiae. Per iniziare, prepara il terreno MSMO e regola il pH a 5,7 con un idrossido di potassio molare. Quindi, sterilizzare in autoclave la soluzione per 15 minuti a 121 gradi Celsius.Aggiungi gli integratori al terreno appena prima dell'inizio dell'esperimento. Ora, coltiva la coltura cellulare transgenica di PSBL Arabidopsis thaliana in 50 millilitri di terreno MSMO in un pallone da 100 millilitri. Quindi, posizionare il pallone su un agitatore a piattaforma orbitale e agitare delicatamente le celle a 130 giri/min a 20 gradi Celsius alla luce.Ogni sette giorni, sottocoltivare le cellule in terreno fresco con una soluzione da uno a 10. Successivamente, utilizzare un imbuto di vetro con una rete di nylon montata su un pallone conico, collegato a una pompa a vuoto per raccogliere le cellule durante la fase di crescita logaritmica. Quindi, avvolgere le celle essiccate in un foglio di alluminio e congelarle in azoto liquido.Utilizzando un vibromulino pre-raffreddato, impostato ad una frequenza vibrazionale di 20 hertz. Omogeneizzare il materiale cellulare vegetale raccolto e congelato in una polvere fine per due minuti. Quindi, aliquotare tre grammi di polvere macinata per campione utilizzando azoto liquido, apparecchiature pre-refrigerate per evitare che si scongeli.Quindi, utilizzando una malta pre-raffreddata con azoto liquido, triturare la polvere macinata con tre millilitri di tampone di lisi ghiacciata fino a quando non si scongela. Dividere immediatamente il campione scongelato in provette da microcentrifuga da due millilitri. Centrifugare i campioni a 20, 817 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari.Durante la centrifugazione del campione, aliquotare 100 microlitri di perle di sefarosio IgG per campione. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi e risospendere le perle mediante vortex. Flash centrifugare per tre secondi a 2.000 g ed eliminare il tampone di lisi.Infine, risospendere le perle in 400 microlitri di tampone di lisi. Dopo la centrifugazione, trasferire tre millilitri di lisato vegetale chiaro in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri. Aggiungere le perle pre-equilibrate al lisato vegetale e incubare la miscela su una ruota rotante per un'ora a quattro gradi Celsius.Trasferire la miscela in una siringa collegata a un tappo bloccato da un'esca su una colonna rotante con un filtro poroso di 35 micrometri situato sulla parte superiore del collettore del vuoto. Far passare il lisato attraverso l'unità accendendo la pompa del vuoto con una leggera pressione per evitare danni alle perline. Il lisato non legato viene drenato nella stazione di scarto situata alla base del collettore e i complessi proteici, legati alle perle, rimangono sul filtro.Una volta svuotata la siringa dal lisato cellulare, aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio per lavare le perle. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione per eseguire la seconda fase di lavaggio. Ora, rimuovi la siringa e il tappo di blocco dell'esca.Chiudere il tappo inferiore della colonna e aggiungere alle perle 400 microlitri del tampone di eluizione contenente 50 unità della forma potenziata del virus dell'incisione del tabacco, la proteasi. Posizionare la colonna su uno shaker da tavolo, impostato a 1.000 giri/min per 30 minuti a 16 gradi Celsius. Quindi, aggiungere altre 50 unità di proteasi alla colonna e incubare la miscela sull'agitatore come nel passaggio precedente.Quindi, rimuovere il tappo inferiore e riposizionare la colonna in una provetta per microcentrifuga da due millilitri. Centrifugare a 20,817 g per un minuto per raccogliere l'eluato e procedere con l'estrazione di proteine e metaboliti. Per iniziare l'estrazione, aggiungere all'eluato un millilitro di solvente acquoso di metanolo MTBE da tre a uno.Capovolgere il tubo per miscelare al campione. Quindi, aggiungere 0,4 millilitri di soluzione acquosa di metanolo alla miscela e capovolgere la provetta per miscelare il campione. Quindi, centrifugare il campione a 20, 817 g per due minuti a temperatura ambiente per consentire la separazione di fase.Utilizzando una pipetta manuale per la manipolazione dei liquidi da un millilitro, rimuovere la fase superiore contenente i lipidi. Quindi, aggiungere 0,2 millilitri di metanolo e capovolgere la provetta per miscelare il campione. Centrifugare a 20, 817 g per due minuti a temperatura ambiente e raccogliere la fase polare in una nuova provetta per le misurazioni dei metaboliti.Lasciare circa 50 microlitri della fase polare sul fondo del tubo per evitare di spostare il pellet proteico. Quindi, asciugare il tubo contenente la fase polare in un evaporatore centrifugo per una notte. Asciugare i tubi di pellet proteico per 30-60 minuti per evitare che si secchino eccessivamente.Utilizzando la purificazione di affinità in un solo passaggio, insieme alla spettrometria di massa, sono state identificate le interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita in colture cellulari transgeniche di arabidopsis thaliana. Le colture cellulari che esprimono NDPK1 mostrano un arricchimento significativo in valina-leucina, isoleucina glutammato, leucina isoleucina e isoleucina fenilalanina rispetto ai campioni di vettore vuoto, NDPK2 e NDPK3. Per cercare interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita note, 13 proteine e quattro dipeptidi co-eluenti con NDPK1, sono stati interrogati nel database stitch.Le principali associazioni si osservano tra l'ortologo APX1 e la famiglia delle aldeidi deidrogenasi, e il fattore di inizio della traduzione, FBR12, con l'omologo del fattore di inizio della traduzione della subunità alfa due. I dipeptidi identificati non mostrano partner proteici segnalati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore, se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere freddi i campioni, le attrezzature e i reagenti durante l'esperimento. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la termoforesi al microscopio o il saggio di attività, al fine di determinare l'interazione diretta tra le molecole o l'inferenza del loro ligando sull'attività proteica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come maneggiare il campione durante l'intera procedura per ottenere risultati affidabili e identificare i ligandi della tua proteina preferita.Non dimenticare che lavorare con metanolo e soluzione MTBE può essere estremamente pericoloso. È necessario indossare dispositivi di protezione individuale adeguati e prendere sempre precauzioni, come lavorare sotto la cappa aspirante, durante l'esecuzione di questa procedura.

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