Name: Un nuovo approccio per lanalisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su 15 N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Scopri l'analisi comparativa dei complessi multiproteici nelle membrane del tilacoide di Chlamydomonas reinhardtii mediante spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo rivela variazioni nell'abbondanza proteica in condizioni anaerobiche.

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MH riconosce il sostegno della &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; (DFG). Autore Contributi: MH progettato ricerca; KT, JS e MT svolto attività di ricerca e analizzato i dati, KT e MH ha scritto il giornale.

1. Coltura di Chlamydomonas <ol><li> Il seguente C. reinhardtii ceppi sono stati utilizzati nel presente studio: WT cc124, WT cw15-arg7 (parete cellulare carente e arginina auxotroph), un ceppo mutante ΔPSI 29 e un pgrl1 knock-out ceppo 4. </li><li> Tutti i ceppi sono stati coltivati ​​in Tris-acetato-fosfato (TAP)-mezzo 30, a 25 ° C con una intensità di luce continua di 20-50 μE / m 2 sec e agitazione a 120 rpm. La cultura della ΔPSI deve essere avvolto con della carta tissue per esposizione alla luce &lt;5 μE / m 2 sec. </li><li> Le culture dei ceppi etichettati (ΔPSI e WT cc124, rispettivamente) contenevano 7,5 mm 15 N NH 4 Cl, mentre le colture di ceppi nonlabeled (WT cw15-arg7 e pgrl1, rispettivamente) contenevano 7,5 mm 14 N NH 4 Cl. Le cellule devono crescere per almeno quattro generationi per raggiungere la piena etichettatura e devono essere mantenuti a fase di crescita esponenziale. </li><li> Il giorno prima di iniziare il conteggio dell&#39;esperimento e diluire le cellule ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in un volume di almeno 750 ml / ceppo. </li></ol> Si prega di notare che due tipi di gradiente discontinuo di densità di saccarosio sono descritte nella seguente protocollo. I gradienti di densità di saccarosio fotosistema secondo Takahashi et al. 9 sono utilizzati per separare i diversi complessi proteici fotosintetici da tilacoidi isolati e solubilizzate durante durante la notte centrifugazione e devono essere preparati il giorno prima (vedi protocollo 2) ed i tilacoidi gradienti di densità di saccarosio 8 sono applicati nella procedura di isolamento tilacoidale (vedi protocollo 3). 2. Preparazione del fotosistema saccarosio gradienti di densità <ol><li> Per versare le pendenze sono necessarie tre soluzioni stock: <ol><li> 2 M saccarosio </li><li> 10% β-DM in H 2 O </li><li> 0,5 M Tricina, pH 8,0 (NaOH) </li></ol></li><li> L&#39;utilizzo di questi titoli, preparare le seguenti soluzioni: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> Concentrazione: </td><td style="width:75px;"> 1.3 M </td><td style="width:75px;"> 1,0 M </td><td style="width:75px;"> 0.85 M </td><td style="width:75px;"> 0,7 M </td><td style="width:75px;"> 0.65 M </td><td style="width:75px;"> 0,4 M </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 2 M saccarosio </td><td style="width:75px;"> 13 ml </td><td style="width:75px;"> 10 ml </td><td style="width:75px;"> 8.5 ml </td><td style="width:75px;"> 7 ml </td><td style="width:75px;"> 6.5 ml </td><td style="width:75px;"> 4 ml </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 10%46;-DM </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td><td style="width:75px;"> 100 microlitri </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 0,5 M Tricina </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td><td style="width:75px;"> 200 ml </td></tr><tr height="20"><td height="21" style="height:20px;width:94px;"> H 2 O </td><td style="width:75px;"> 6.7 ml </td><td style="width:75px;"> 9.7 ml </td><td style="width:75px;"> 11.2 ml </td><td style="width:75px;"> 12.7 ml </td><td style="width:75px;"> 13.2 ml </td><td style="width:75px;"> 15.7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Utilizzare 14 millimetri tubi x 89 millimetri centrifuga e versare le pendenze molto lentamente, a partire con la soluzione di più alta densità di saccarosio per la soluzione minore densità. </li><li> Versare solo 1 ml ciascuno per i 1.3 e 1.0 M soluzioni e 2 ml per il resto delle soluzioni. </li><li> Lasciare gradienti durante la notte in cella. </li></ol> 3. Anaerobica Induzione e isolamento di tilacoidale Membrane 8 <ol><li> Prima di iniziare con l&#39;isolamento delle membrane tilacoidi, indurre condizioni anaerobiche con argon per 4 ore. La formazione di bolle può essere effettuata tramite una pipetta di vetro in coltura fiaschi con una costante miscelazione della cultura con un bastoncino magnetico. </li><li> Iniziare con l&#39;isolamento delle membrane tilacoidi pastigliando le cellule per 5 minuti a 2500 xg, risospendere in tampone H1 (0,3 M saccarosio, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl 2). (Si prega di notare che quando si inizia con l&#39;isolamento di tilacoidali membrane campioni should essere tenuti in ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine, tutte le fasi di centrifugazione sono eseguite a 4 ° C e lavorare con i guanti si consiglia vivamente di evitare la contaminazione cheratina.) </li><li> Cellule pellet per 5 min a 2500 xg, risospendere in tampone H1. </li><li> Rompere le celle con due passaggi attraverso un nebulizzatore con una pressione di azoto di 1500 hPa (per i ceppi senza parete cellulare solo fare un passaggio). </li><li> Spin le cellule per 7 minuti a 2500 x g. (Dopo questo passo il surnatante deve essere di colore verde chiaro, in caso contrario, la rottura delle cellule non è riuscita.) </li><li> Risospendere le cellule in tampone H2 (0.3 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e cellule pellet per 10 min a 32800 x g. </li><li> Risospendere le cellule in tampone H3 (1.8 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e omogeneizzare pellet con potter (senza particelle verdi dovrebbero rimanere alla fine di questa fase di lavorazione). </li><li> Preparare tilacoidali gradienti di densità di saccarosio in vascaes (25 millimetri x 89 mm) avviando in fondo con uno strato di 12 ml H3 buffer con le cellule, versare uno strato intermedio di 12 ml di tampone H4 (1.3 M saccarosio, 5 HEPES mM (pH 7,5), EDTA 10 mM ( pH 8,0)) e sulla parte superiore 12 ml di tampone H5 (0,5 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). Prestare attenzione quando si versa le pendenze ed evitare la miscelazione dei tre strati. </li><li> Equilibrio con tampone H5 e centrifugare tilacoidali gradienti di densità di saccarosio per 1 ora a 70.700 x g. </li><li> Rimuovere le bande tilacoidali dalle tilacoidali gradienti di densità di saccarosio e diluirli con un adeguato volume di tampone H6 (5 HEPES mM (pH 7,5) EDTA 10 mM (pH 8,0)). </li><li> Spin le cellule a 37.900 xg per 20 min. Se il pellet non è stretto, più di buffer H6 è necessario per questa fase di centrifugazione. </li><li> Risospendere tilacoidi in un buffer H6 piccolo volume e procedere con determinazione della concentrazione di clorofilla. </li></ol> 4. Determinazione della clorofilla Concentrazione 31 </sup&gt; <ol><li> La determinazione della quantità clorofilla viene eseguita con 80% acetone. </li><li> Mescolare 995 ml 80% acetone e 5 ml di tilacoidi in tampone H6 (diluizione 1:200). </li><li> Vortex per alcuni secondi fino particelle verdi rimangono e poi girano giù a 14.1 g per 5 min. </li><li> Prendete il surnatante e misurare l&#39;estinzione a 663,6 e 646,6 nm e 750 nm, rispettivamente. </li><li> Calcolare la quantità di clorofilla utilizzando le seguenti formule: <ol><li> C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * fattore di diluizione </li><li> C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * fattore di diluizione </li><li> C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b </li></ol></li></ol> 5. Caricamento del fotosistema saccarosio gradienti di densità <ol><li> Calcolare la quantità di tilacoidi, β-DM e tampone H6 che sono necessariper ogni sfumatura: <ol><li> Ogni sfumatura deve essere caricata con un volume totale di 700 ml con 0,8 mg / ml clorofilla a 0,9% β-DM (sciogliere β-DM in H 2 O), riempire il volume rimanente con tampone H6. </li></ol></li><li> Per solubilizzazione preparare diverse aliquote con tilacoidi, β-DM e tampone H6 per ogni sfumatura. </li><li> Lasciare i campioni per 20 minuti sul ghiaccio con mescolando regolarmente (invertito) ogni pochi minuti (solubilizzazione passo). </li><li> Centrifugare alla massima velocità (14.000 xg) per 10 min a 4 ° C. (Dopo centrifugazione, il pellet dovrebbe essere piccolo e biancastro mentre il surnatante è verde scuro.) </li><li> Caricare surnatante sulle pendenze. </li><li> Equilibrio con tampone H6 e spin usando Ultracentrifuge a 134.470 xg durante la notte (14 ore) a 4 ° C. (Si prega di notare che il successo separazione dei complessi fotosintetici utilizzando gradienti di densità fotosistema saccarosio come presentato in questo protocollo si ottiene solo quando using isolate di fresco tilacoidi, poiché una previsione per solubilizzazione e separazione complesso è difficile fare quando si lavora con membrane tilacoidi che sono stati congelati prima.) </li></ol> 6. Frazionamento del fotosistema saccarosio gradienti di densità <ol><li> Scattare foto dei gradienti. </li><li> Perforare un foro nella parte inferiore del tubo con ago e gradienti frazionare in tubi 500 microlitri. In alternativa, il frazionamento può essere eseguita anche utilizzando una piastra a 96 pozzetti (micropiastra). </li><li> Quando si utilizza una micropiastra, determinare l&#39;assorbanza delle diverse frazioni gradiente a 675 nm. (A questo passo campioni possono essere conservati a -80 ° C per alcune settimane.) </li></ol> 7. SDS-PAGE e immunorivelazione (Si prega di notare che solo per il confronto delle WT vs ΔPSI è stata effettuata un&#39;analisi western blot per selezionare le frazioni per la successiva MS-analisi. Per l&#39;esperimento WT vs pgrl1 frazioni sono stati scelti mediante l&#39;assorbanza nelle diverse frazioni.) <ol><li> Separa i 30 ml di ogni frazione di WT e ΔPSI sfumato su un 13% di SDS poliacrilammide gel 32. </li><li> Eseguire l&#39;analisi Western Blot 33 utilizzando i seguenti anticorpi: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, il PSI subunità psad 32 e il PSII nucleo subunità D1. Utilizzare tutti gli anticorpi con una diluizione di 1:1000 (per una migliore tecnica chemiluminescenza), fatta eccezione per l&#39;anticorpo D1, che dovrebbe essere utilizzato con una diluizione di 1:10.000. </li><li> Sulla base dei risultati del immunorivelazione, prendere le frazioni di picco di ANR1, PGRL1 e PSAD per WT e ΔPSI (qui frazioni 6 e 13, rispettivamente), miscelare 30 ml di frazione 6 da WT e ΔPSI e fare lo stesso con la frazione da 13 entrambi preparati e li separano di nuovo su un gel SDS poliacrilammide 13%. </li><li> Per il confronto quantitativo di WT vs pgrl1 prendere la CFrazioni EF-supercomplex come determinata misurando l&#39;assorbanza nelle diverse frazioni gradiente e Mescolare 30 ml di entrambi i campioni seguiti da separazione su gel di poliacrilammide SDS 13%. </li><li> Macchiare le bande proteiche con una soluzione di Coomassie (85% acido fosforoso, 757 mM di solfato di ammonio, 1,2% blu brillante Coomassie, 20% metanolo) per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. </li><li> Per rimuovere la colorazione aspecifica, lavare più volte con DDH 2 O. </li><li> Tagliare le corsie a 1 millimetro pezzi di gel e procedere con la digestione in-gel. (In alternativa, i campioni possono essere asciugati in pochi minuti in una centrifuga a vuoto e conservati per un paio di settimane prima di continuare con la digestione in-gel.) </li></ol> 8. In-gel Digestione (Modificato da Shevchenko et al. 35) Si prega di notare per preparare tutti i buffer e le soluzioni poco prima dell&#39;uso e prendere bottiglie di vetro per tamponi contenenti acetonitrile (ACN). &lt;br /&gt; ATTENZIONE! Lavorare con ACN potrebbe essere dannoso; ulteriori informazioni può essere scaricato da: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013). <ol><li> Lavare i pezzi di gel con&gt; 10 volumi di DDH 2 O (~ 200 ml) per 30 sec. </li><li> Incubare i pezzi di gel con 300 ml di 25 mM NH 4 HCO 3 per 15 minuti con agitazione, rimuovere il liquido. </li><li> Incubare i pezzi di gel con 300 ml di 25 mM NH 4 HCO 3 nel 50% ACN (prepara mescolando ACN e 50 NH mm 4 HCO 3 con un rapporto di 1:1) per 15 minuti con agitazione, rimuovere il liquido. </li><li> Se i pezzi gel sono ancora blu, ripetere l&#39;NH 4 HCO 3 e NH 4 HCO 3 / ACN lava fino a quando la maggior parte del Coomassie viene rimosso. (Anche se la maggior parte di Coomassie colorante deve essere rimosso, non è necessario Destain completamente i pezzi di gel.) </li><li> Aggiungere 100 ml di ACN a disidratare i pezzi di gel per 5 min. I pezzi di gel dovrebbero ridurre unand guardare completamente bianco. </li><li> Rimuovere il più ACN possibile e procedere con tripsina digestione. In alternativa, i campioni possono essere conservati a -20 ° C per alcune settimane. </li><li> Aggiungere 10-20 ml per ogni gruppo di 20 ng / mL tripsina nel 10% ACN / 25 NH mm 4 HCO 3 (appena diluito), mantenere i campioni in ghiaccio. </li><li> Dopo 30 minuti, controllare se tutto soluzione è stata assorbita e aggiungere più tampone tripsina, se necessario. Pezzi di gel devono essere completamente coperti con tampone di tripsina. Conservare i campioni in ghiaccio. </li><li> Lasciare pezzi di gel per altri 90 minuti sul ghiaccio di saturare loro con tripsina. (Passaggio critico: la resa di peptidi triptici aumenta notevolmente con l&#39;aumentare i tempi di incubazione in ghiaccio, probabilmente a causa della lenta diffusione dell&#39;enzima nella matrice poliacrilammide E &#39;necessario avere un piccolo eccesso di soluzione copre i pezzi di gel per evitare che i pezzi. cadere asciutto durante la notte di incubazione.) </li><li> Digerire a 37 ° C per 4-6 ore. Per esperimenti che richiedonorecupero peptide massimo, digerire durante la notte. </li><li> Dopo la digestione spin down del buffer condensato. </li><li> Tubi ultrasuoni per 5 min a eluiscano peptidi e centrifugare di nuovo. </li><li> Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta. </li><li> Procedere all&#39;estrazione del peptide con 80 ml di 30% ACN / acido formico 1% (FA) in un bagno sonico per 15 min. </li><li> Eseguire l&#39;estrazione con 80 ml di 30% ACN / 1% FA in un bagno sonico per 15 min. </li><li> Eseguire l&#39;estrazione con 80 ml di 70% ACN / 1% FA in un bagno sonico per 15 min. </li><li> Centrifuga di nuovo e la piscina surnatante con l&#39;eluato precedente. (FA serve per inattivare la tripsina e aumentare il peptide solubilità.) </li><li> Soluzione peptide asciugare completamente in una centrifuga a vuoto. (A questo punto i campioni possono essere conservati per un paio di settimane a -20 ° C prima di procedere con MS-analisi.) </li><li> Peptidi Risospendere in 6 microlitri di buffer MS (5% ACN, 0,1 v / v FA, acqua) e ultrasuoni per 2-5 min. </li><li> Centrifugare i campioni a maximum velocità per 5 minuti per rimuovere il materiale particolato. </li><li> Utilizzare 4 ml di surnatante per l&#39;analisi di spettrometria di massa. </li></ol> 9. MS-Analisi dei dati con &quot;Proteomatic&quot; L&#39;analisi dei dati è stata effettuata con il software open-source &quot;Proteomatic&quot; (che può essere scaricato http://www.proteomatic.org/), una piattaforma che consente la generazione e completamento di MS / MS condotte valutazione dei dati in base software libero e commerciale 36. In breve, le impostazioni sono descritte di seguito e più dettagliate informazioni possono essere trovati in 6,26. <ol><li> Identificazione e quantificazione di MS-dati Identificazione e quantificazione delle proteine ​​dal esperimenti WT vs ΔPSI sono state fatte con OMSSA (versione 2.1.4 37) e qTrace 26, rispettivamente, come descritto 6,26. Per l&#39;analisi MS-dati dall&#39;esperimento WT vs pgrl1 seguente conduttura aggiornato è stato utilizzato:<ol><li> Oltre a OMSSA 37, proteine ​​sono state anche identificate con X! Tandem (versione 2013/02/01 38). Entrambi gli algoritmi sono stati applicati da una ricerca su un database generato combinando il JGI Chlamydomonas database model gene versione 4.3 con la versione del database AUGUSTUS 10.2, nonché un database unita del NCBI banche dati BK000554.2 e NC_001638.1. </li><li> MS 2 Identificazione di peptidi è stata effettuata utilizzando un approccio target-richiamo 39. Un richiamo per ogni proteina è stato creato da mischiare a caso peptidi triptici, pur mantenendo la ridondanza dei peptidi nonproteotypic. </li><li> Validazione statistica dei peptidi è stata effettuata con il software qvality (versione 0.3.3 40) con una probabilità di errore posteriore (PEP) soglia inferiore a 0,01 e risultati sono stati filtrati con una tolleranza massa precursore di 5 ppm. </li><li> Peptidi da OMSSA e X! Corre Tandem sono state riunite e quantificate con qTrace <sup&gt; 26 applicando i seguenti passaggi filtranti: richiede MS 2 Identificazione, aggiungere i nomi di proteine ​​/ informazioni sul gruppo e richiedono entrambi i peptidi sorella. </li></ol></li></ol> Per studiare se Proporzioni proteina erano significativamente differenti l&#39;una verso l&#39;altra nelle frazioni CEF-supercomplex contrastanti da WT e pgrl1, analisi statistica è stata effettuata applicando il software SPSS (versione 21). Le subunità del citocromo b complesso 6 / f sono stati testati contro l&#39;altro, così come le proteine ​​FNR, FTSH2 e HCF136 contro le subunità PSI. I rapporti peptidici ogni conteggio scansione per proteine ​​di tutti i quattro replicati sono stati testati per la distribuzione normale con il test di Shapiro-Wilks. Poiché le popolazioni peptide non erano normalmente distribuiti (p &lt;0.001), sono stati eseguiti statistica non parametrica. In primo luogo, il test di Kruskal-Wallis è stato applicato valutare una divergenza significativa tra i gruppi. Solo se questo test previsto differenza significativas tra gruppi, ulteriori analisi è stata effettuata per prevedere differenze significative tra i due gruppi indipendenti con il test di Mann-Whitney-U.

Gli autori dichiarano assenza concorrente interesse finanziario.

Diversi studi di proteomica quantitativa, utilizzando l&#39;etichettatura degli isotopi stabili sono stati pubblicati negli ultimi anni. In questi esperimenti solitamente due diversi campioni sono confrontati, di cui un campione è marcato con un isotopo stabile. Successivamente proteine ​​o peptidi dai due campioni vengono combinati in un rapporto uguale e successivamente trattati insieme 48. Tali studi spesso intendono confrontare compartimenti definiti isolati cellulari (ad esempio cloroplasti, mit...

Processi fotosintetici nelle membrane tilacoidi di piante e alghe possono funzionare in modo lineare e ciclica. Durante lineare flusso di elettroni (LEF) fotosistema I (PSI), fotosistema II (PSII) e citocromo b 6 / f definitiva trasferire elettroni dall&#39;acqua al NADP + 1, che porta alla generazione di NADPH e ATP 2. Al contrario, ciclico flusso di elettroni (CEF), che è noto per essere indotta in diverse condizioni ambientali come stato 2 e 3 anaerobici condizioni 4, provoca la re-riduzione del PSI ossidato iniettando elettroni indietro nella catena di trasporto degli elettroni. Questo processo può avvenire sia sul lato stromale del citocromo b complesso di 6 / f 1 o in piscina plastoquinone 5 e genera ATP, ma non NADPH 2. Lo scopo del protocollo presentato è dimostrare una spettrometria di massa (MS) m basatoetodo per il confronto, l&#39;analisi quantitativa dei complessi multiproteici nelle membrane tilacoidi di Chlamydomonas reinhardtii al fine di conoscere la composizione di questi complessi in condizioni diverse (esemplificati confrontando ceppi geneticamente differenti). Questo approccio è stato applicato in una pubblicazione di Terashima et al. Nel 2012 mostra un Ca 2 +-dipendente regolamento del CEF in C. reinhardtii mediata da un complesso multiproteico comprese le proteine ​​CAS, ANR1, e PGRL1 6. La procedura verrà spiegata analizzando comparativamente la composizione del CEF-supercomplex in due ceppi geneticamente diversi, sfruttando così etichettatura uno dei due ceppi con azoto pesante (15 N). Brevemente, il protocollo prevede la preparazione di membrane tilacoidi, seguita da detersivo solubilizzazione e frazionamento di complessi fotosintetici in un gradiente di densità di saccarosio. Dopo frazionamento del gradiente, Frac selezionatozioni di due ceppi sono mescolati basano sulla parità di volume, separate mediante SDS-PAGE seguita da in-gel digestione e successiva analisi MS quantitativa. Come accennato in precedenza, CEF è indotta in diverse condizioni ambientali e una pubblicazione dal 2010 dimostra l&#39;isolamento di un funzionale CEF-supercomplex da stato 2 celle bloccate di C. reinhardtii 7, che è stata eseguita separando membrane tilacoidi solubilizzate su un gradiente di saccarosio durante ultracentrifugazione. Diverso da Iwai et al. 7, il protocollo presentato descrive l&#39;isolamento del CEF-supercomplex da anaerobico cresciuto C. culture reinhardtii seguendo una procedura alternativa. Questo comprende cambiamenti nel protocollo di isolamento tilacoidi nonché le differenze riguardanti la fase di solubilizzazione e la separazione dei complessi proteici mediante ultracentrifugazione. Nel presente protocollo, le membrane tilacoidisono isolati applicando la procedura pubblicata da Chua e Bennoun 8, mentre i buffer utilizzati per la preparazione tilacoidi da Iwai et al. contenute Mes 25 mM, saccarosio 0,33 M, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) come descritto 9. La solubilizzazione è stata effettuata con 0,7-0,8% di detergente (n-tridecil-β-D-maltoside) per 30 min in ghiaccio in caso di Iwai e collaboratori, mentre il metodo di solubilizzazione qui descritto si basa sull&#39;utilizzo di 0,9% di detergente (n -Dodecil-β-D-maltoside (β-DM)) e viene eseguita solo per 20 min in ghiaccio. Entrambi i gruppi utilizzati 0,8 mg di clorofilla per ml per la solubilizzazione con il rispettivo detersivo. Per la separazione dei complessi fotosintetici dalle membrane tilacoidi solubilizzate Iwai et al. Applicato concentrazioni di saccarosio tra 0,1-1,3 M, che di questo protocollo gli autori hanno utilizzato concentrazioni comprese 0,4-1,3 M. L&#39;ultima differenza è la velocità di centrifugazione, che è inferiore rispetto Per il bisrlier pubblicazione. Solubilizzazione delle membrane tilacoidi con detergenti non ionici seguite da densità gradiente di saccarosio frazionamento già applicato in numerosi studi che vanno dal 1980 fino ad oggi 7, 9-14 e anche l&#39;applicazione di marcatura metabolica delle proteine ​​è un metodo diffuso nel campo proteomica. L&#39;approccio descritto si applica l&#39;etichettatura 15 N metabolica per uno dei due ceppi confrontati da coltura in presenza di azoto pesante come unica fonte di azoto in forma di 15 N NH 4 Cl, che è integrata in tutti gli aminoacidi che conducono ad una massa spostare a seconda della sequenza amminoacidica del peptide. Quando si analizza una miscela di 14 N e 15 N entro un MS eseguito, questo spostamento di massa può essere utilizzato per determinare l&#39;origine del campione per ogni peptide e peptide abbondanza relativa possono essere calcolati rappresentano abbondanze relative per l&#39;corrispondonoing proteine ​​15. Numerosi studi di proteomica quantitative C. reinhardtii sono disponibili, che confronta una quantità definita di proteine ​​per analizzare i cambiamenti del proteoma tra le condizioni sperimentali (ad esempio cambiamenti nella proteoma a causa di nutrienti 16-19 o alla luce di stress 20,21). Rispetto a tali studi, nell&#39;approccio attualmente presentata uguali volumi di campioni vengono combinati e analizzati. Questa configurazione permette di studiare il comportamento di migrazione delle proteine ​​all&#39;interno del gradiente ed inoltre per analizzare la composizione di diversi complessi rispetto ai ceppi esaminati. Questo metodo sarà spiegata principalmente da concentrandosi su tre proteine: Il primo candidato è il calcio proteina sensore CAS cloroplasto-localizzato, che ha dimostrato di essere coinvolti in foto-acclimatazione in C. reinhardtii 22. Il calcio è considerato un segnale importantezione di ioni per percorsi che vengono attivati ​​a causa di diversi stress biotici e abiotici, infine, che porta a cambiamenti nell&#39;espressione genica e fisiologia cellulare 23 ed è stato proposto che cloroplasti potrebbero contribuire a cellulare Ca 2 + segnalazione tramite la proteina CAS 22,24,25. La seconda proteina è ANR1 (risposta anaerobica 1 6), una proteina che ha dimostrato di essere indotta in condizioni anossiche crescita in C. reinhardtii 26. In particolare, CAS nonché ANR1 sono stati identificati come subunità del CEF-supercomplex ed inoltre, utilizzando approcci di genetica inversa, è stato dimostrato che entrambe le proteine ​​contribuiscono funzionalmente al CEF in vivo 6, sostenendo il loro ruolo di subunità funzionali di questo complesso proteico. La terza proteina è la proteina tilacoidi PGR5-Like 1 (PGRL1), che ha dimostrato di essere coinvolti in CEF in Chlamydomonas 4,27 e 5,28 in Arabidopsis e era anche identified nel lavoro di Iwai et al. 7 Questo approccio sarà presentato mostrando i risultati di due esperimenti diversi: di tipo selvatico (WT) contro (vs) una ΔPSI 29 ceppo, esibendo una delezione del gene PSAB, che codifica per un fotosistema I essenziale subunità, che è anche parte del CEF-supercomplex e WT contro un pgrl1 knock-out ceppo 4. Per ciascuno di questi esperimenti la composizione quantitativa del CEF-supercomplex tra 15 N e un ceppo 14 N-marcato è stato confrontato.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>AppliChem</td><td>A0662</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Acetone</td><td>AppliChem</td><td>A2300</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Acetonitrile Optigrade f&uuml; r LC-MS</td><td>Diagonal</td><td>9340</td><td>Dannoso, lavorare con i guanti. Vedere il testo del protocollo per ulteriori precauzioni. https://www.diagonal.de/</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio 15N</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>39466-62-1</td><td>http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio 14N</td><td>AppliChem</td><td>A0988</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Idrogeno fosfato di ammonio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3583</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Solfato di ammonio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3598</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Coomassie blu brillante R-250</td><td>Fisher Scientific</td><td>10041653</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td></tr><tr><td>n-dodecil-&beta;-D-maltoside</td><td>AppliChem</td><td>A0819</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>acido formico&nbsp; &nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3858</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>AppliChem</td><td>A4425</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Metanolo</td><td>AppliChem</td><td>A2954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Acido fosforoso</td><td>AppliChem</td><td>A0989</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Idrogeno fosfato dipotassico&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Diidrogeno fosfato di potassio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>idrossido di sodio</td><td>AppliChem</td><td>A1551</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>saccarosio</td><td>AppliChem</td><td>A1125</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tripsina (grado di sequenziamento modificato) e tampone tripsina</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>http://www.promega.de/</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nebulizzatore (disgregatore cellulare BioNeb)</td><td>Glas-Col</td><td></td><td>http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga (14 mm x 89 mm)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>per la preparazione di gradienti in stile Takahashi
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga 25 mm x 89 mm </td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>per la preparazione di gradienti di isolamento tilacoidale.
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://www.beckmancoulter.de/</td></tr> <tr><td>Camera di couting cellulare Fuchs-Rosenthal</td><td>Diagonal</td><td>449/72</td><td>https://www.diagonal.de/</td></tr> <tr><td>Omogeneizzatore (Potter) 50 ml&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>10618242</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Pistillo per omogeneizzatore</td><td>Fisherbrand</td><td>105252220</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)</td><td>Sito web di Beckman Coulter</td><td></td><td>: http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi&nbsp;</td><td>Agrisera</td><td></td><td>http://www.agrisera.com/en/index.html</td></tr></tbody></table>

un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico complessi basato su<sup&gt; 15</sup&gt; n metabolica etichettatura e quantitativa spettrometria di massa

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Il protocollo introdotto fornisce uno strumento per l&#39;analisi di complessi multiproteici nella membrana tilacoidi, rivelando intuizioni composizione complessa in condizioni diverse. In questo protocollo l&#39;approccio è dimostrato confrontando la composizione della proteina complessa responsabile ciclico flusso di elettroni (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolata da ceppi geneticamente diversi. Il procedimento comprende l&#39;isolamento di membrane tilacoidi, seguita dalla loro separazione in complessi multiproteici da centrifugazione su gradiente di densità di saccarosio, SDS-PAGE, immunodetection e comparativa, spettrometria di massa quantitativa (MS) basato su marcatura metabolica differenziale (14 N / 15 N) del ceppi analizzati. Detergente membrane tilacoidi solubilizzate vengono caricati su gradienti di densità di saccarosio in concentrazione pari clorofilla. Dopo ultracentrifugazione, le pendenze sono separati in frazioni, che vengono analizzati dai mass-spectrometry basato sulla parità di volume. Questo approccio permette l&#39;indagine della composizione all&#39;interno delle frazioni gradiente ed inoltre per analizzare il comportamento di migrazione di diverse proteine, in particolare concentrandosi su ANR1, CAS, e PGRL1. Inoltre, questo metodo è dimostrato confermando i risultati con immunoblotting e inoltre sostenendo i risultati di studi precedenti (identificazione e di migrazione PSI-dipendente delle proteine ​​precedentemente descritti a far parte del CEF-supercomplex come PGRL1, FNR, e cyt f). In particolare, questo approccio è applicabile ad affrontare una vasta gamma di domande per le quali questo protocollo può essere adottato e, ad esempio utilizzato per le analisi comparative dei multiproteico composizione complessa isolato da condizioni ambientali diverse.

L&#39;approccio di proteomica quantitativa introdotto mira a caratterizzare la composizione dei complessi multiproteici in membrane tilacoidi dimostrato dall&#39;analisi comparata dei componenti CEF-supercomplex in geneticamente differenti C. reinhardtii ceppi. Il metodo descritto è stato applicato con successo da Terashima et al. 6 e comprende l&#39;isolamento di membrane tilacoidi da colture anaerobiche cresciuta, seguiti da solubilizzazione detergente. Successivamente, i campioni vengono ...

Il confronto, approccio di proteomica quantitativa descritta mira ad ottenere intuizioni nella composizione dei complessi multiproteici in condizioni diverse ed è dimostrato dal confronto ceppi geneticamente diversi. Per l&#39;analisi quantitativa volumi uguali di frazioni diverse da un gradiente di densità di saccarosio sono mescolati e analizzati mediante spettrometria di massa.

Un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare in modo comparativo la composizione dei complessi MultiPro nelle membrane del cordone talare in diverse condizioni. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto le membrane talari da cellule lamonari esposte a condizioni anaerobiche. Successivamente, le membrane del cordone talare vengono solubilizzate e frazionate su un gradiente di densità al saccarosio.Quindi volumi uguali delle frazioni desiderate vengono miscelati e separati mediante elettroforesi SDS-PAGE. Infine, le bande colorate con Coomassie vengono digerite con tripsina. Alla fine, i campioni vengono analizzati mediante spettrometria di massa quantitativa per osservare le variazioni nell'abbondanza proteica tra le frazioni esaminate.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli studi proteomici quantitativi che confrontano una quantità definita di proteine, è che nel nostro approccio vengono combinati ed analizzati volumi uguali di campioni frazionati. Questo consente di studiare il comportamento migratorio delle proteine all'interno del gradiente e, inoltre, di analizzare la composizione di diversi complessi non proteici nella membra

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Un nuovo approccio per lanalisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su 15 N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa (Video) | JoVE Journal

Un nuovo approccio per l'analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su

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