Un nuovo approccio per l'analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su ¹⁵ N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare comparativamente la composizione dei complessi MultiPro nelle membrane del cordone thal in diverse condizioni. Ciò si ottiene isolando prima le membrane thal dalle cellule di lamona esposte a condizioni anaerobiche. Successivamente, le membrane del cordone th vengono solubilizzate e frazionate su un gradiente di densità del saccarosio.

Quindi volumi uguali delle frazioni desiderate vengono mescolati e separati sulla pagina SDS. Infine, le bande colorate con kumasi vengono digerite con tripsina. Infine, i campioni vengono analizzati mediante spettrometria di massa quantitativa per osservare i cambiamenti nell'abbondanza proteica tra le frazioni studiate.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come gli studi di proteomica quantitativa che confrontano una quantità definita di proteine è che nel nostro approccio vengono combinati e analizzati volumi uguali di campioni frazionati. Ciò consente di studiare il comportamento di migrazione delle proteine all'interno del gradiente e, inoltre, di analizzare la composizione di diversi complessi non proteici nella membrana del terzo gruppo. Per quanto riguarda i ceppi applicati Dopo aver coltivato i ceppi resistenti alle redini di chlamidomonas, secondo il protocollo di testo, utilizzare soluzioni madre di saccarosio molare a due molari, 10% beta DM in acqua e 0,5 molari trice pH 8.0.

Per preparare le seguenti soluzioni per i gradienti di densità del saccarosio, per impostare i gradienti utilizzando provette da centrifuga da 14 x 89 millimetri, iniziare versando lentamente un millilitro di soluzione molare da 1,3 molari, seguito da un millilitro di soluzione molare da 1,0. Quindi versare due millilitri ciascuno delle soluzioni 0,85, 0,7, 0,65 e, infine, 0,4 molari. Conservare i gradienti durante la notte nella cella frigorifera per indurre condizioni anaerobiche.

Nelle colture di chlamidomonas, inserire una pipetta di vetro in fiasche di coltura e bollire con Argonne per quattro ore mescolando e illuminando continuamente per isolare le membrane del cordone di thal. Dopo l'incubazione, iniziare pellettando le cellule per cinque minuti a 2, 500 volte la gravità e quattro gradi Celsius. Quindi sospendere nuovamente i pellet cellulari in 30 millilitri di H un tampone.

Ripetere la centrifugazione e di nuovo, risus. Sospendere le cellule in H un tampone per rompere le cellule, farle passare attraverso un nebulizzatore con una pressione di azoto di 1.500 Pascal. Assicurati che la distanza tra la sfera di ceramica e il metallo sia sufficientemente piccola da consentire la rottura delle celle.

Quindi far girare le celle per sette minuti a 2.500 volte la gravità e quattro gradi Celsius. Il surnatante dovrebbe essere di colore verde chiaro. Se la rottura della cella ha avuto successo, sospendere nuovamente le cellule in 50 millilitri di H due tampone e pellettare per 10 minuti a 32, 800 volte la gravità e quattro gradi Celsius.

Quindi, dopo aver sospeso le cellule in 10 millilitri di H tre tamponi, utilizzare un vasaio per omogeneizzare il palato risospeso. Successivamente preparare i gradienti di densità del saccarosio del cordone di thal. Iniziare con 12 millilitri di cellule in H tre tampone.

Quindi versare lentamente uno strato di 12 millilitri di H quattro tampone e terminare con 12 millilitri di H cinque tampone. Utilizzare H 5 per bilanciare il rotore e centrifugare i gradienti per un'ora a 70, 700 volte la gravità. Rimuovere le bande TH dai gradienti e utilizzare un volume appropriato di H sei tampone per diluirle.

Far girare le celle a 37, 900 volte la gravità per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Se il pellet non è stretto, aggiungere altro tampone H six alla fase di centrifugazione. Poi risu.

Sospendere i cavi thal in un piccolo volume di H sei tamponi per caricare un gradiente di densità di saccarosio del sistema fotografico. Innanzitutto, calcola le quantità di cordoni thal, beta DM e H sei tampone necessari per ogni gradiente. Seguendo queste linee guida, ogni gradiente conterrà 0,8 milligrammi per millilitro di clorofilla nello 0,9% di beta DM e H sei tampone porterà il volume finale fino a 700 microlitri.

Per solubilizzare il thys, preparare separatamente Eloqua con tilacoidi beta DM e H sei tamponi per ogni gradiente. Incubare i campioni su ghiaccio per 20 minuti e capovolgerli ogni pochi minuti per mescolare. Dopo aver centrifugato i campioni a 14.000 volte la gravità per 10 minuti e quattro gradi Celsius.

Il pellet dovrebbe essere piccolo e biancastro e il surnatante sarà verde scuro. Caricare il surnatante sulla bilancia dei gradienti con H sei tampone e ultra centrifugare a 134, 470 volte la gravità per 14 ore e quattro gradi Celsius. Dopo il giro, scatta foto dei gradienti e poi frazionali.

Utilizzare un ago per praticare un foro sul fondo del tubo e raccogliere le frazioni in tubi da 500 microlitri. O un processo di piastra a 96 pozzetti. I campioni per la pagina SDS in digestione su gel e spettrometria di massa secondo il protocollo di testo come mostrato qui, utilizzando i risultati dell'analisi immuno del sangue frazione sei da wild type e frazione 13 da delta PS uno.

Le frazioni di picco di A e R 1 sono state scelte per l'analisi dei componenti del supercomplesso a flusso di elettroni ciclici in questa figura. Sono mostrati i rapporti proteici relativi raffigurati come wild type su delta PS one, 14 N su 15 N per diverse PS one core e light harvesting proteins di PS one, così come per le proteine assegnate con il supercomplesso ciclico del flusso di elettroni, le differenze nell'abbondanza di un NR uno e CAS nelle frazioni sei e 13 di PS one e delta suggeriscono che sono nuovi componenti di questo complesso mostrato ecco i risultati per il confronto quantitativo di questo super complesso ciclico a flusso di elettroni tra il tipo selvatico e un ceppo PG L one knockout. È interessante notare che HCF 1 36, citocromo B sei, citocromo B sei subunità F quattro e PET C sembrano essere arricchiti nel tipo selvatico, mentre FTSH due, citocromo F e PET O sembrano essere arricchiti in PG L uno.

Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come confrontare la composizione dei complessi MultiPro in membrane liquide in diverse condizioni. Tenete presente che per la preparazione di successo delle membrane liquide e l'isolamento del flusso di elettroni ciclici, la disgregazione cellulare super complessa, la conciatura delle cellule e l'izzazione delle membrane liquide sono i passaggi critici. Inoltre, i gradienti di densità del saccarosio devono essere centrifugati per almeno 12 ore per ottenere la completa separazione dei complessi fotosintetici.