Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta
25 agosto 2018
Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.
L'obiettivo generale di questo video è quello di introdurre un nuovo e semplice metodo per isolare e coltivare cellule epidermiche umane primarie da un tessuto cutaneo adulto. Questo metodo avanzato è più adatto per la produzione di un gran numero di cellule epidermiche ad alto potenziale sia per applicazioni di laboratorio che cliniche. Lavare il fazzoletto con PBS prima di pesare.
Pesare il tessuto cutaneo con una bilancia elettronica. Sciacquare il tessuto cutaneo con etanolo al 70% per 30 secondi. Incubare il tessuto in PBS con antibiotici due volte per cinque minuti ogni volta.
Trasferire il tessuto in un'altra piastra sterile e omogeneizzare accuratamente utilizzando lame di bisturi. Aggiungere 200 microlitri di PBS ogni cinque minuti per mantenere il fazzoletto bagnato. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta da 50 millilitri.
Aggiungere 10 millilitri di miscela enzimatica per ogni grammo di tessuto cutaneo. Mescolare accuratamente gli enzimi con i tessuti omogeneizzati. Incubare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius agitando.
Successivamente, aggiungi 1/5 del volume dello 0,25% di tripsina. Continuare l'incubazione per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Aggiungere la soluzione di Dnase I alla miscela in un rapporto di uno a 100.
Quindi incubare per altri cinque minuti. Arrestare il processo di digestione aggiungendo lo stesso volume di mezzo di neutralizzazione. Pipettare la soluzione su e giù per circa 20 volte.
Filtrare le cellule dissociate attraverso un colino cellulare da 100 micrometri per rimuovere i detriti tissutali. Centrifugare a 200 g per cinque minuti. Osservare il pellet sul fondo del tubo.
Rimuovere i surnatanti e lavare il pellet cellulare con 10 millilitri di mezzo di neutralizzazione. Quindi centrifugare a 200 g per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare nel terreno di inoculazione con 10 inibitori micromolari di ROCK.
Piastra due volte da 10 a sesta cellula in un piatto di coltura da 100 millimetri. Dopo tre giorni, sostituire il terreno di inoculazione con un terreno per cheratinociti privo di siero. Cambia il mezzo ogni due giorni.
Quando le cellule hanno raggiunto circa l'80% della densità, passare le cellule. Lavare le celle con PBS. Se necessario, tripsinizzare per due minuti e lavare le cellule con PBS per rimuovere le cellule dermiche contaminate.
Aggiungere lo stesso volume di mezzo di neutralizzazione. Centrifugare a 200 g per cinque minuti. Infine, rimuovere i surnatanti e risospendere il pellet cellulare.
I cheratinociti isolati da tessuti cutanei umani sono stati incubati separatamente con due metodi. Il metodo convenzionale è una digestione in due fasi che prevede una procedura di due giorni. Al contrario, il nuovo metodo è una digestione in un'unica fase che richiede circa tre ore per essere eseguita.
Il terzo giorno, possiamo facilmente trovare molti cluster cellulari coltivati con il nuovo metodo, mentre questo fenomeno non si verifica quando si utilizza il metodo convenzionale. Il quinto giorno, è stato osservato che il nuovo metodo produceva una quantità maggiore di cellule primarie. Per testare lo stato di differenziazione dei cheratinociti in coltura, abbiamo analizzato il marcatore delle cellule basali K5 e il marcatore di differenziazione terminale Loricrin.
Abbiamo scoperto che il 90% delle cellule totali erano K5 positive, ma meno del 10% delle cellule esprimeva Loricrina al passaggio tre, indicando che si tratta di cheratinociti indifferenziati. Abbiamo controllato l'espressione della vimentina, che è espressa nel fibroblasto dermico, per esaminare la contaminazione delle cellule dermiche durante l'isolamento. Abbiamo scoperto che circa il 3% delle cellule dermiche appariva nel passaggio iniziale, ma solo circa lo 0,02% delle cellule dermiche è stato rilevato al passaggio tre, indicando un'elevata purezza delle cellule epidermiche dopo il passaggio.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo semplificato per l'isolamento di cheratinociti umani primari da tessuti cutanei adulti. Il metodo utilizza l'inibitore ROCK Y-27632 per facilitare la separazione delle cellule epidermiche dalle cellule dermiche.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Dermatologia
- Medicina rigenerativa
Sfondo
- I cheratinociti umani primari sono essenziali per varie applicazioni di ricerca.
- I metodi di isolamento convenzionali possono essere complessi e dispendiosi in termini di tempo.
- L'uso dell'inibitore ROCK Y-27632 offre un approccio più efficiente.
- I cheratinociti isolati possono essere utilizzati sia in ambiente di laboratorio che clinico.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo più efficiente per l'isolamento delle cellule epidermiche.
- Migliorare la resa delle cellule epidermiche ad alto potenziale.
- Facilitare la ricerca e le applicazioni cliniche che coinvolgono le cellule cutanee.
Metodi utilizzati
- Lavare il tessuto cutaneo con PBS prima di pesarlo.
- Peso del tessuto cutaneo utilizzando una bilancia elettronica.
- Risciacquare il tessuto con etanolo al 70% per 30 secondi.
- Incubare il tessuto in PBS con antibiotici due volte per cinque minuti ciascuna.
Risultati principali
- Il protocollo isola con successo i cheratinociti primari.
- Sono stati ottenuti alti rendimenti di cellule epidermiche vitali.
- Il metodo è riproducibile ed efficiente.
- Le cellule isolate possono essere utilizzate per varie applicazioni.
Conclusioni
- Questo metodo semplifica l'isolamento dei cheratinociti primari.
- Fornisce un approccio affidabile per i ricercatori nel campo.
- L'uso dell'inibitore ROCK migliora la resa e la vitalità delle cellule.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
