Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

L'obiettivo generale di questo video è quello di introdurre un nuovo e semplice metodo per isolare e coltivare cellule epidermiche umane primarie da un tessuto cutaneo adulto. Questo metodo avanzato è più adatto per la produzione di un gran numero di cellule epidermiche ad alto potenziale sia per applicazioni di laboratorio che cliniche. Lavare il fazzoletto con PBS prima di pesare.

Pesare il tessuto cutaneo con una bilancia elettronica. Sciacquare il tessuto cutaneo con etanolo al 70% per 30 secondi. Incubare il tessuto in PBS con antibiotici due volte per cinque minuti ogni volta.

Trasferire il tessuto in un'altra piastra sterile e omogeneizzare accuratamente utilizzando lame di bisturi. Aggiungere 200 microlitri di PBS ogni cinque minuti per mantenere il fazzoletto bagnato. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta da 50 millilitri.

Aggiungere 10 millilitri di miscela enzimatica per ogni grammo di tessuto cutaneo. Mescolare accuratamente gli enzimi con i tessuti omogeneizzati. Incubare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius agitando.

Successivamente, aggiungi 1/5 del volume dello 0,25% di tripsina. Continuare l'incubazione per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Aggiungere la soluzione di Dnase I alla miscela in un rapporto di uno a 100.

Quindi incubare per altri cinque minuti. Arrestare il processo di digestione aggiungendo lo stesso volume di mezzo di neutralizzazione. Pipettare la soluzione su e giù per circa 20 volte.

Filtrare le cellule dissociate attraverso un colino cellulare da 100 micrometri per rimuovere i detriti tissutali. Centrifugare a 200 g per cinque minuti. Osservare il pellet sul fondo del tubo.

Rimuovere i surnatanti e lavare il pellet cellulare con 10 millilitri di mezzo di neutralizzazione. Quindi centrifugare a 200 g per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare nel terreno di inoculazione con 10 inibitori micromolari di ROCK.

Piastra due volte da 10 a sesta cellula in un piatto di coltura da 100 millimetri. Dopo tre giorni, sostituire il terreno di inoculazione con un terreno per cheratinociti privo di siero. Cambia il mezzo ogni due giorni.

Quando le cellule hanno raggiunto circa l'80% della densità, passare le cellule. Lavare le celle con PBS. Se necessario, tripsinizzare per due minuti e lavare le cellule con PBS per rimuovere le cellule dermiche contaminate.

Aggiungere lo stesso volume di mezzo di neutralizzazione. Centrifugare a 200 g per cinque minuti. Infine, rimuovere i surnatanti e risospendere il pellet cellulare.

I cheratinociti isolati da tessuti cutanei umani sono stati incubati separatamente con due metodi. Il metodo convenzionale è una digestione in due fasi che prevede una procedura di due giorni. Al contrario, il nuovo metodo è una digestione in un'unica fase che richiede circa tre ore per essere eseguita.

Il terzo giorno, possiamo facilmente trovare molti cluster cellulari coltivati con il nuovo metodo, mentre questo fenomeno non si verifica quando si utilizza il metodo convenzionale. Il quinto giorno, è stato osservato che il nuovo metodo produceva una quantità maggiore di cellule primarie. Per testare lo stato di differenziazione dei cheratinociti in coltura, abbiamo analizzato il marcatore delle cellule basali K5 e il marcatore di differenziazione terminale Loricrin.

Abbiamo scoperto che il 90% delle cellule totali erano K5 positive, ma meno del 10% delle cellule esprimeva Loricrina al passaggio tre, indicando che si tratta di cheratinociti indifferenziati. Abbiamo controllato l'espressione della vimentina, che è espressa nel fibroblasto dermico, per esaminare la contaminazione delle cellule dermiche durante l'isolamento. Abbiamo scoperto che circa il 3% delle cellule dermiche appariva nel passaggio iniziale, ma solo circa lo 0,02% delle cellule dermiche è stato rilevato al passaggio tre, indicando un'elevata purezza delle cellule epidermiche dopo il passaggio.