Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

L'obiettivo generale di questo metodo è ottenere quantità dell'ordine del milligrammo di proteine beta-barile della membrana esterna che possano cristallizzare e diffrangere. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ripiegamento e del trasporto delle proteine di membrana, ad esempio in che modo le proteine beta-barile vengono inserite nelle membrane cellulari. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua robustezza per le proteine beta-barile.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la scelta dei detergenti per la purificazione, la cristallizzazione e la defrazione è complessa. Jeremy Guerin, un postdoc del laboratorio di Susan Buchanan, mostrerà la procedura, oltre a me e ai colleghi del laboratorio. Iniziare questa procedura con la costruzione di un vettore di espressione T7 contenente il gene ottimizzato per i codoni della proteina di membrana esterna bersaglio, o gene OMP, per l'espressione in vivo nella membrana come descritto nel protocollo testuale.

Introdurre il costrutto in una ceppa batterica da espressione aggiungendo con una pipetta un microlitro di plasmide in 50 microlitri di cellule chimicamente competenti BL21(DE3) e mescolare delicatamente aspirando e riemettendo con la pipetta. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, esporre a un impulso termico di 30 secondi a 42 gradi Celsius utilizzando un bagnomaria, quindi riposizionare sul ghiaccio per un minuto.

Aggiungere un millilitro di mezzo SOC preriscaldato e agitare a 37 gradi Celsius per un'ora a 1000 giri al minuto utilizzando un incubatore agitatore da banco. Al termine dell'incubazione, piastrare 100 microlitri di cellule su piastre di Agar LB contenenti un antibiotico appropriato e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius, capovolte. Successivamente, eseguire test di espressione su piccola scala inoculando cinque millilitri di LB contenente antibiotico con una singola colonia.

Ripetere per cinque-dieci colonie. Far crescere a 37 gradi Celsius con agitazione fino a una densità ottica a 600 nanometri di circa zero virgola sei. Indurre l'espressione della OMP bersaglio aggiungendo cinque microlitri di IPTG uno molare a ogni provetta di coltura e far crescere ancora da uno a due ore.

Per confrontare i livelli di espressione di tutte le colonie, centrifugare un millilitro di ciascuna coltura per un minuto a 15.000 ×g, utilizzando una microcentrifuga. Rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer di caricamento 1X per SDS-PAGE. Incubare a 100 gradi Celsius per cinque minuti, quindi centrifugare nuovamente a 15.000 ×g per cinque minuti.

Analizzare i campioni utilizzando l'elettroforesi SDS-PAGE, pipettando 20 microlitri in ciascun pozzetto di un gel al dieci per cento. Far correre il gel per 35 minuti a 200 volt costanti. Infine, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6000 ×g per dieci minuti.

Risospendere le cellule nel buffer di lisi in un rapporto di cinque millilitri per grammo di pasta cellulare. Lisiare le cellule utilizzando un pressa francese o un omogeneizzatore cellulare. Successivamente, centrifugare le cellule lisate a 15.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere le cellule non lisate e i detriti cellulari.

Trasferire il surnatante in un tubo pulito e centrifugare nuovamente ad alta velocità per un'ora a quattro gradi Celsius. Il pellet risultante è la frazione membranare che contiene la proteina di interesse. Utilizzando un omogenizzatore Dounce, risospendere la frazione membranare.

Per prima cosa, trasferire le membrane e quindi aggiungere il buffer di solubilizzazione a concentrazione 2X senza detergente. Versare le membrane risospese in un cilindro graduato e aggiungere acqua fino a raggiungere una concentrazione finale di buffer di solubilizzazione 1X. Trasferire il campione in un becher e aggiungere lentamente il detergente fino a una concentrazione finale di circa 10 volte la concentrazione critica di micelle.

Quindi, agitare da 0,5 a 16 ore a quattro gradi Celsius, a seconda della facilità con cui la proteina bersaglio viene estratta dalle membrane. Infine, centrifugare il campione solubilizzato a 300.000 ×g per un'ora a quattro gradi Celsius. Preparare una colonna IMAC da uno a cinque millilitri oppure utilizzare una colonna pre-impacchettata.

Eseguire i successivi passaggi di cromatografia a quattro gradi Celsius. Lavare con acqua per rimuovere eventuali tracce di conservanti. Se si utilizza un sistema automatico di purificazione, installare la colonna seguendo le istruzioni del produttore.

Preparare 500 millilitri di IMAC buffer A senza imidazolo e 250 millilitri di IMAC buffer B con imidazolo 1 M. Equilibrare la colonna IMAC utilizzando 10 volumi di colonna di IMAC buffer A. Aggiungere imidazolo al campione proteico fino a una concentrazione finale di 25 millimoli e mescolare. Successivamente, caricare il campione sulla colonna IMAC equilibrata a una velocità di 2 millilitri al minuto.

Raccogliere il flusso passante. Successivamente, lavare la colonna IMAC con cinque volumi di colonna di concentrazioni crescenti di imidazolo, utilizzando il buffer B. Raccogliere i lavaggi in frazioni di due millilitri. Eluire il campione con una concentrazione finale di 250 millimolari per cinque volumi di colonna e raccogliere il campione eluito in frazioni di due millilitri.

Analizzare il flusso passante, le frazioni di lavaggio e le frazioni di eluizione mediante analisi SDS-PAGE in base all'assorbanza a 280 nanometri. Raccogliere le frazioni contenenti la proteina OMP beta-barile bersaglio, confermata dall'analisi SDS-PAGE. Successivamente, rimuovere il tag 6X istidina aggiungendo la proteasi TEV al campione raccolto e incubando per tutta la notte a quattro gradi Celsius con movimento lento oscillatorio.

Caricare nuovamente la soluzione del campione del proteasi su una colonna IMAC per separare la proteina di membrana esterna beta-barile bersaglio dai tag rimossi e da qualsiasi campione non scisso. Il flusso passante conterrà il campione scisso privo del tag. Per prepararsi alla cristallizzazione, caricare il campione su una colonna di filtrazione su gel in un tampone contenente il detergente che verrà utilizzato per la cristallizzazione.

Raccogliere frazioni da un millilitro e analizzarle mediante analisi SDS-PAGE in base all'assorbanza a 280 nanometri. Riunire le frazioni contenenti la proteina bersaglio, quindi concentrarle fino a circa 10 milligrammi per millilitro. Prima di preparare i campioni, assemblare l'apparato elettroforetico.

Utilizzare un tampone di corsa per gel preraffreddato oppure eseguire l'elettroforesi in una stanza fredda. Filtrare il campione mediante un filtro centrifugo da 0,22 micron per rimuovere particelle e precipitati. Quindi, pipettare 0,25 microlitri del campione in due tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro.

Etichettarne uno come "boiled" e l'altro come "RT". Successivamente, aggiungere 9,75 microlitri di buffer campione in ogni provetta e mescolare mediante pipettaggio. Aggiungere inoltre a entrambi i campioni 10 microlitri di buffer di caricamento 2X SDS e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Incubare il campione "boiled" a 95 gradi Celsius per cinque minuti, lasciando il campione "RT" a temperatura ambiente.

Quindi, centrifugare brevemente il campione bollito. Successivamente, caricare 20 microlitri di entrambi i campioni sul gel nativo preassemblato. Dopo aver fatto correre il gel per 60 minuti a un voltaggio costante di 150 volt, rimuovere il gel e immergerlo nella soluzione di colorazione per visualizzare i risultati.

Procedere con le prove di cristallizzazione in detergente, bi-celle e fase cubica lipidica, utilizzando i metodi JoVE precedentemente pubblicati. Le teste di cristallizzazione vengono visualizzate al microscopio UV per verificare che i cristalli siano effettivamente costituiti da proteine e non da lipidi o detergente risolto. I cristalli promettenti vengono analizzati mediante una sorgente da laboratorio o al sincrotrone per verificare se i cristalli diffrangono.

Dopo la raccolta dei dati di cristalli che diffrangono bene, elaborare i dati utilizzando un software di elaborazione, come HKL2000. Trasferire i file risultanti a un pacchetto software per la determinazione della struttura, come Phoenix Suit, ed eseguire il reimpiego molecolare per la fase iniziale e la determinazione della struttura. La struttura cristallina di YIUR è stata determinata a una risoluzione di 2,6 Ågstrom utilizzando questo metodo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane, se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esprimere e purificare le proteine della membrana esterna batterica per studi strutturali.