Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere quantità di milligrammi di proteine beta-barrel della membrana esterna che cristallizzano e si deframmentano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ripiegamento e del trasporto delle proteine di membrana, come ad esempio il modo in cui le proteine beta-barrel vengono inserite nelle membrane cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è robusta per le proteine beta-barrel.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, perché la scelta dei detergenti per la purificazione, la cristallizzazione e la defrazione è impegnativa. Jeremy Guerin, un postdoc del laboratorio di Susan Buchanan, dimostrerà la procedura, oltre a me e ai colleghi del laboratorio. Iniziare questa procedura con la costruzione di un vettore di espressione T7 contenente la proteina bersaglio della membrana esterna ottimizzata per il codone, o gene OMP, per l'espressione in vivo alla membrana come descritto nel protocollo di testo.

Trasformare il costrutto in un ceppo di batteri di espressione per l'espressione pipettando un microlitro di plasmide in 50 microlitri di cellule BL21(DE3) chimicamente competenti e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare con ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, riscaldare a 42 gradi Celsius per 30 secondi a bagnomaria, quindi rimettere in ghiaccio per un minuto.

Aggiungere un millilitro di SOC preriscaldato e agitare a 37 gradi Celsius per un'ora a 1000 giri/min utilizzando un incubatore con agitatore da banco. Dopo l'incubazione, impiattare 100 microlitri di cellule su piastre LB Agar contenenti un antibiotico appropriato e incubare per una notte a 37 gradi Celsius, capovolto. Successivamente, eseguire test di espressione su piccola scala inoculando cinque millilitri di coltura antibiotica contenente LB con una singola colonia.

Ripeti da cinque a 10 colonie. Crescere a 37 gradi Celsius con agitazione a una densità ottica di 600 nanometri di circa zero virgola sei. Indurre l'espressione dell'OMP target aggiungendo cinque microlitri di IPTG molare a ciascuna provetta di coltura e lasciare crescere per altre una o due ore.

Per confrontare i livelli di espressione di tutte le colonie, centrifugare un millilitro di ciascuna coltura per un minuto a 15.000 volte G, utilizzando una microcentrifuga. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone di caricamento 1X SDS-PAGE. Scaldare a 100 gradi Celsius per cinque minuti, quindi centrifugare di nuovo a 15.000 volte G per cinque minuti.

Analizzare i campioni utilizzando SDS-PAGE pipettando 20 microlitri in ciascun pozzetto di un gel al dieci per cento. Far funzionare il gel per 35 minuti a 200 volt costanti. Infine, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6000 volte G per dieci minuti.

Risospendere le cellule nel tampone di lisi ad un rapporto di cinque millilitri per grammo di pasta cellulare. Lisi le cellule utilizzando una pressa francese o un omogeneizzatore cellulare. Quindi, centrifugare le cellule lisate a 15.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere le cellule non lisate e i detriti cellulari.

Trasferire il surnatante in una provetta pulita e centrifugare nuovamente ad alta velocità per un'ora a quattro gradi Celsius. Il pellet risultante è la frazione di membrana che contiene la proteina di interesse. Utilizzando un omogeneizzatore Dounce, risospendere la frazione di membrana.

Per prima cosa, trasferire le membrane e poi aggiungere il tampone di solubilizzazione a concentrazione 2X senza detergente. Versare le membrane risospese in un cilindro graduato e aggiungere acqua fino a raggiungere una concentrazione finale di tampone di solubilizzazione 1X. Trasferire il campione in un becher e aggiungere lentamente il detergente fino a una concentrazione finale di circa 10 volte la concentrazione micellare critica.

Quindi, mescola per 0,5-16 ore a quattro gradi Celsius, a seconda della facilità con cui la proteina bersaglio viene estratta dalle membrane. Infine, centrifugare il campione solubilizzato a 300.000 volte G per un'ora a quattro gradi Celsius. Preparare una colonna IMAC da uno a cinque millilitri o utilizzare una colonna preconfezionata.

Eseguire le fasi successive della cromatografia a quattro gradi Celsius. Sciacquare con acqua per eliminare eventuali tracce di conservanti. Se si utilizza un sistema di purificazione automatizzato, installare la colonna secondo le istruzioni del produttore.

Preparare 500 millilitri di tampone IMAC A senza imidizolo e 250 millilitri di tampone IMAC B con un molare di imidizolo. Equilibrare la colonna IMAC utilizzando 10 volumi di tampone IMAC A.Aggiungere l'imidizolo al campione proteico fino a una concentrazione finale di 25 millimolari e mescolare. Quindi, caricare il campione sulla colonna IMAC bilanciata a due millilitri al minuto.

Raccogli il flusso. Successivamente, lavare la colonna IMAC con cinque volumi di colonna ciascuno di concentrazioni crescenti di imidizolo, utilizzando il tampone B.Raccogliere i lavaggi in frazioni di due millilitri. Eluire il campione con una concentrazione finale di 250 millimolari per cinque volumi di colonna e raccogliere il campione eluito in frazioni di due millilitri.

Analizza il flusso, le frazioni di lavaggio e le frazioni di eluizione utilizzando l'analisi SDS-PAGE basata sulla loro assorbanza a 280 nanometri. Raggruppare le frazioni contenenti l'OMP beta-barrel target come verificato dall'analisi SDS-PAGE. Quindi, rimuovere l'etichetta di istadina 6X aggiungendo la proteasi TEV al campione raggruppato e incubando per una notte a quattro gradi Celsius con un leggero dondolio.

Caricare nuovamente la soluzione di proteasi del campione su una colonna IMAC per separare l'OMP beta-barrel target dalle etichette tagliate e da qualsiasi campione non scisso. Il flusso conterrà il campione tagliato privo del tag. Per prepararsi alla cristallizzazione, caricare il campione su una colonna di filtrazione su gel in un tampone contenente il detergente da utilizzare per la cristallizzazione.

Raccogli frazioni di un millilitro e analizzale utilizzando l'analisi SDS-PAGE in base alla loro assorbanza a 280 nanometri. Raggruppare le frazioni contenenti la proteina bersaglio e quindi concentrarsi a circa 10 milligrammi per millilitro. Prima di preparare i campioni, assemblare l'apparecchio in gel.

Utilizzare un tampone per la corsa in gel pre-raffreddato o far scorrere il gel nella cella frigorifera. Filtrare il campione utilizzando un filtro centrifugo da 0,22 micron per rimuovere il particolato e le precipitazioni. Quindi, pipettare 0,25 microlitri di campione in due provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Etichettare uno come bollito"e l'altro come RT"Quindi, aggiungere 9,75 microlitri del tampone del campione a ciascuna provetta e mescolare mediante pipettaggio. A entrambi i campioni, aggiungere anche 10 microlitri di tampone di caricamento SDS 2X e miscelare delicatamente mediante pipettaggio. Far bollire il campione bollito a 95 gradi Celsius per cinque minuti, lasciando il campione RT a temperatura ambiente.

Quindi, centrifugare brevemente il campione bollito. Quindi, caricare 20 microlitri di entrambi i campioni sul gel nativo preassemblato. Dopo aver fatto funzionare il gel per 60 minuti a una tensione costante di 150 volt, rimuovere il gel e immergerlo nella soluzione colorante per visualizzare i risultati.

Procedere con prove di cristallizzazione in fase detergente e cubica lipidica, utilizzando i metodi Jove precedentemente pubblicati. Le teste di cristallizzazione vengono visualizzate al microscopio UV per verificare che i cristalli siano, effettivamente, proteici e non risolti, lipidici o detergenti. I cristalli di piombo vengono schermati utilizzando una sorgente domestica o al sincrotrone per vedere se i cristalli si defrattono.

Dopo la raccolta dei dati dei cristalli che si defrattono bene, elaborare i dati utilizzando un software di elaborazione, come HKL2000. Trasferisci i file risultanti in una suite software per la determinazione della struttura, come Phoenix Suit, ed esegui la sostituzione molecolare per la fasatura iniziale e la determinazione della struttura. La struttura cristallina di YIUR è stata determinata con una risoluzione di 2,6 Angstrom utilizzando questo metodo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere e purificare le proteine batteriche della membrana esterna per gli studi strutturali.