Name: Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine di membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Scopri come produrre quantità milligrammo di proteine di membrana esterna β-barrel per studi strutturali. Questo metodo robusto facilita la cristallizzazione e la diffrazione di queste proteine essenziali.

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Vorremmo ringraziare Herve Celia del CNRS per aver fornito le immagini UV e Chris Dettmar e Garth Simpson del Dipartimento di Chimica della Purdue University per aver fornito le immagini SONICC. Vorremmo ringraziare il finanziamento del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases e del Programma di ricerca intramurale presso il National Institutes of Health. Inoltre, vorremmo riconoscere ulteriori finanziamenti da parte del National Institute of General Medical Sciences (AMS e CJ), del National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01) e del Dipartimento di Scienze Biologiche della Purdue University (N.N.).

<ol><li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes%3A+evolutionary+conservation+and+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li>
<li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bam+machine%3A+A+molecular+cooper%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li>
<li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li>
<li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+YaeT%3A+conformational+flexibility+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li>
<li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li>
<li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li>
<li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li>
<li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins%3A+a+summary+of+recent+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
<li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+transferrin+bound+iron%3A+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
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<li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia%3A+implications+for+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li>
<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li>
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<li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?</a> BMC Genomics. 13, 510(2012).</li>
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<li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li>
<li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li>
<li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

β-barile OMP servono ruoli essenziali nel batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti e sono obiettivi importanti per l&#39;analisi strutturale che offrono una ricchezza di informazioni sui meccanismi molecolari essenziali a membrane esterne di queste rispettive organelli. Tuttavia, producendo abbastanza campione per l&#39;analisi strutturale non è sempre agevole e, pertanto, una condotta generale è presentato per la produzione di quantità sufficienti di bersaglio OMP β-barile per la determinazione della struttura, ...

β-barile OMP si possono trovare solo nelle membrane esterne di mitocondri, cloroplasti, e batteri Gram-negativi 1-3. Mentre servono ruoli simili come proteine ​​alfa-elica, hanno una piega molto diversa costituito da un dominio β-barrel membrana incorporato centrale vanno da 8-26 anti-paralleli beta trefoli con ciascun trefolo essendo intimamente collegato ai due fili adiacenti (figure 1 e 2). Il primo e l&#39;ultimo fili di dominio β-barile poi interagiscono tra loro, quasi esclusivamente in modo antiparallelo (eccetto VDAC mitocondriale), per chiudere e sigillare il dominio β-barile dalla membrana circostante. Tutti OMP β-barile hanno loop extracellulari di diversa sequenza e lunghezza che svolgono un ruolo importante nelle interazioni ligando e / o contatti proteina-proteina, con questi loop talvolta essere grande come 75 residui, come trovato in Neisserial transferrina vincolante proTEIN A (TBPA) 4. β-barile OMP possono avere anche le estensioni periplasmatiche N-terminale o C-terminale che servono domini come ulteriori per scopo funzionale della proteina (ad esempio, Bama 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Mentre esistono molti tipi di OMP β-botte 11, due dei tipi più comuni sono descritti di seguito come esempi per quelli meno familiarità con il campo, (1) trasportatori TonB-dipendente e (2) automezzi. Trasportatori TonB-dipendenti (ad esempio, FEPA, TBPA, BTub, Cir, etc.) sono essenziali per l&#39;importazione di nutrienti e contengono un dominio spina N-terminale costituito da ~ 150 residui che si trova nascosto all&#39;interno di un C-terminale di 22-bloccati β- dominio barilotto incorporato nella membrana esterna 12 (figura 3). Anche se questo dominio spina impedisce supporto a partire da liberamente passando per il dominio barile, legame del substrato induce un cambiamento conformazionale all&#39;interno del dominio spina °in porta a poro formazione (sia per spina riarrangiamento o parziale / totale espulsione del tappo), che possono poi facilitare il trasporto del substrato attraverso la membrana esterna in periplasma. Trasportatori TonB-dipendenti sono particolarmente importanti per la sopravvivenza di alcuni ceppi patogeni di batteri Gram-negativi, come Neisseria meningitidis che si sono evoluti trasportatori specializzati che si impadroniscono nutrienti come il ferro direttamente da proteine ​​ospite umani 4,13,14. Automezzi appartengono al tipo di sistema di secrezione V di batteri Gram-negativi e sono OMP beta-barile che consistono di un dominio β-barile (tipicamente 12-fili, come con ESTA e ESPP) e un dominio del passeggero che è o secreti o presentati al superficie della cellula 15,16 (figura 3). Questi OMP β-barile servono spesso ruoli importanti nella sopravvivenza cellulare e virulenza con il dominio passeggero che serve sia come proteasi, adhesin, e / o altri effector che media patogenesi. metodi strutturali come la cristallografia a raggi X, la spettroscopia NMR, e la microscopia elettronica (EM) ci permettono di determinare modelli per le OMP a risoluzione atomica, che può a sua volta essere utilizzati per decifrare esattamente come funzionano all&#39;interno della membrana esterna. Queste informazioni preziose può quindi essere utilizzato per lo sviluppo di farmaci e vaccini, se applicabile. Per esempio, il legame transferrina proteina A (TBPA) si trova sulla superficie del Neisseria ed è necessario per la patogenesi perché si lega direttamente transferrina umana e poi estrae ed importa il ferro per la propria sopravvivenza. Senza TBPA, Neisseria non può pulire il ferro da ospite umano e sono resi non patogeni. Dopo che la struttura cristallina della transferrina umana legato al TBPA 4 è stato risolto, è diventato molto più chiaro come le due proteine ​​associate, quali regioni della TBPA mediata interazione, ciò residui erano importanti per l&#39;estrazione ferro TBPA, ecome si potrebbe sviluppare terapie contro Neisseria di targeting TBPA. Pertanto, data l&#39;importanza di OMP β-barile nei batteri Gram-negativi per la sopravvivenza e la patogenesi, nonché nei mitocondri e funzione cloroplasti, e la necessità di informazioni strutturali aggiuntive su questa classe unica di proteine ​​di membrana e sistemi in cui funzionano , protocolli generali vengono presentati con l&#39;obiettivo generale di esprimere e purificare OMP bersaglio ad alti livelli per la caratterizzazione con metodi strutturali.

<table><tbody><tr><td>Robot di cristallizzazione</td><td>TTP Labtech, Art Robbins-Qualsiasi</td><td></td> <td>dovrebbe funzionare qui, ad eccezione del</td></tr><tr><td>termociclatore PCR</td> di cristallizzazione LCP <td>Eppendorf, BioRad-Media</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick, Infors HT-UV-vis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>spettrometro</td><td></td> Eppendorf-SDS-PAGE <td></td><td></td></tr><tr><td>apparecchio</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE e gel nativi</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE</td> <td>Healthcare-AkTA</td> Purifier GE Healthcare-Microcentrifuge <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf-Centrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(bassa-media velocità)</td><td>Beckman-Coulter-Ultracentrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(alta rotore</td> <td>Beckman-Coulter-SS34</td><td></td><td></td></tr> Rotore <tr><td></td><td>Sorvall-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>45 Ti</td><td>Rotore Beckman-Coulter-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70 Ti</td><td></td><td></td> Omogeneizzatore <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin-Dialysis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tubing</td><td>Strumenti LCP Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamilton, TTP</td> <td>Labtech-VDX</td><td></td></tr> <tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Piastre sandwich</td><td>Hampton Research, dimensioni molecolari</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Fogli di cristallizzazione Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>colonna HiPrep S300 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Q-Sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>Schermi di cristallizzazione</td><td>Hampton Research, Qiagen, Dimensioni molecolari-Siringa</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>a tenuta di gas (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Le proteine di membrana svolgono importanti funzioni nelle cellule come il trasporto dei nutrienti, la motilità, la segnalazione, la sopravvivenza e la virulenza, ma costituiscono solo ~1% per cento delle strutture conosciute. Esistono due tipi di proteine di membrana, α-elicoidali e β-barrel. Mentre le proteine di membrana a α elicoidale possono essere trovate in quasi tutte le membrane cellulari, le proteine di membrana a β cilindri possono essere trovate solo nelle membrane esterne dei mitocondri, dei cloroplasti e dei batteri Gram-negativi. Un collo di bottiglia comune negli studi strutturali delle proteine di membrana in generale è ottenere una quantità sufficiente di campione puro per l'analisi. Nella speranza di aiutare coloro che sono interessati a risolvere la struttura della loro proteina di membrana esterna (OMP) preferita a β-barrel, vengono presentati protocolli generali per la produzione di OMP a β-barrel target a livelli utili per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X e/o spettroscopia NMR. Qui, delineiamo il design del costrutto sia per l'espressione nativa che per l'espressione in corpi di inclusione, la purificazione utilizzando un tag di affinità e la cristallizzazione utilizzando tecniche di screening detergente, bicelle e fase cubica lipidica. Questi protocolli sono stati testati e si sono dimostrati efficaci per la maggior parte degli OMP da batteri Gram-negativi; Tuttavia, ci sono alcuni bersagli, in particolare per i mitocondri e i cloroplasti, che possono richiedere altri metodi per l'espressione e la purificazione. Pertanto, i metodi qui riportati dovrebbero essere applicabili alla maggior parte dei progetti che coinvolgono OMP da batteri Gram-negativi, ma i livelli di espressione e la quantità di campione purificato variano a seconda dell'OMP target.

Yiur è un TonB trasportatore di ferro dipendente che è un bersaglio del vaccino putativo contro Yersinia pestis. E &#39;stato originariamente identificato utilizzando un test di microarray. Qui, i passi che sono state prese per determinare la struttura di yiur mediante cristallografia a raggi X sono delineati (Figura 9). Per la clonazione, la sequenza di DNA di yiur (meno il segnale sequenza N-terminale) è stato amplificato mediante PCR dal DNA genomico e subclo...

β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

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Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

L'obiettivo generale di questo metodo è ottenere quantità dell'ordine del milligrammo di proteine beta-barile della membrana esterna che possano cristallizzare e diffrangere. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ripiegamento e del trasporto delle proteine di membrana, ad esempio in che modo le proteine beta-barile vengono inserite nelle membrane cellulari. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua robustezza per le proteine beta-barile.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la scelta dei detergenti per la purificazione, la cristallizzazione e la defrazione è complessa. Jeremy Guerin, un postdoc del laboratorio di Susan Buchanan, mostrerà la procedura, oltre a me e ai colleghi del laboratorio. Iniziare questa procedura con la costruzione di un vettore di espressione T7 contenente il gene ottimizzato per i codoni della proteina di membrana esterna bersaglio, o gene OMP, per l'espressione in vivo nella membrana come descritto nel protocollo testuale.Introdurre il costrutto in una ceppa batterica da espressione aggiungendo con una pipetta un microlitro di plasmide in 50 microlitri di c

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Chimica

Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l'individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Qui è descritto un approccio robotico per alta produttività cristallizzazione di proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici destinati determinazione della struttura macromolecolare usando cristallografia a raggi X. Tre robot capaci di gestire la viscoso e appiccicoso proteina-carico mesofase solidale al metodo vengono introdotti.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Qui è descritto procedure implementate nella membrana Caffrey Strutturale e Funzionale Biologia Gruppo di cristalli di membrana raccolta e crio-cool proteine ​​coltivate in fasi lipidiche cubi e spugna per l'uso in determinazione della struttura macromolecolare con cristallografia a raggi X.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

Structure-based drug design gioca un ruolo importante nello sviluppo di farmaci. Perseguire obiettivi multipli in parallelo aumenta notevolmente la probabilità di successo per la scoperta di lead. L'articolo che segue mette in evidenza come il Seattle Center Genomica strutturale di Malattie Infettive utilizza un approccio multi-obiettivo per la determinazione del gene-per-struttura della influenza PB2 A subunità.

Multi-target Parallel Processing Approccio per Gene-to-struttura Determinazione della polimerasi Influenza PB2 subunità

Descriviamo un framework che incorpora un'analisi biochimica e computazionale diretta per guidare la caratterizzazione e la cristallizzazione di grandi domini coiled-coil. Questo framework può essere adattato per le proteine globulari o esteso per incorporare una varietà di tecniche ad alto rendimento.

La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

Questo metodo descrive la clonazione, espressione e purificazione di Nsa1 ricombinante per determinazione strutturale di cristallografia a raggi x e small-angle x-ray scattering (SAXS) ed è applicabile per l'analisi strutturale di ibrido di altre proteine che contiene sia ordinato e disordinati domini.

Combinando la cristallografia a raggi x con piccolo angolo x-ray Scattering per modellare le regioni non strutturate di Nsa1 da S. Cerevisiae

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un'amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all'elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l'indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050H60A H307A.

Cristallografia a raggi X per studiare la transizione di stato oligomerica della termotoga maritima M42 Aminopeptidasi TmPep1050

I monostrati lipidici sono stati utilizzati come base per la formazione di cristalli proteici bidimensionali (2D) per studi strutturali per decenni. Sono stabili all'interfaccia aria-acqua e possono fungere da materiale di supporto sottile per l'imaging elettronico. Qui presentiamo i passaggi comprovati sulla preparazione di monostrati lipidici per studi biologici.

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Questo protocollo descrive una configurazione per la cristallizzazione del trasportatore di steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 viene ricostituito in bicelle per la cristallizzazione a goccia sospesa. Il protocollo non richiede materiali o substrati specializzati, il che lo rende accessibile e facile da adattare in qualsiasi laboratorio per determinare la struttura della proteina attraverso la cristallografia a raggi X.

Cristallizzazione ABCG5/G8 in ambiente bicellare lipidico per cristallografia a raggi X

Scopri come produrre quantità milligrammo di proteine di membrana esterna β-barrel per studi strutturali. Questo metodo robusto facilita la cristallizzazione e la diffrazione di queste proteine essenziali.

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

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