Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Un robusto test per lettori di piastre come il nostro è molto utile per lo screening iniziale di potenziali inibitori della metiltransferasi. La capacità di raccogliere dati in tempo reale è un grande vantaggio del test continuo accoppiato all’endonucleasi. Iniziare preparando 600 microlitri delle condizioni di analisi contenenti 20 composti micromolari e 50 micromolari separatamente nelle provette della microcentrifuga su ghiaccio.

Per fare ciò, aggiungere acqua distillata doppia e tampone di metilazione 5X a ciascun tubo per ottenere una concentrazione finale di tampone di metilazione 1X. Quindi, aggiungere 3,15 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di albume sierico bovino, o BSA, a ciascun campione. Quindi, aggiungere due microlitri di substrato di DNA a forcina 3,15 micromolare e 1,33 microlitri di S-adenosilmetionina 4,75 micromolare, o SAM, a ciascun campione.

Aggiungere l’inibitore ai campioni appropriati per ottenere una concentrazione finale di 21 micromolari o 52,5 micromolari e una quantità equivalente di dimetilsolfossido, o DMSO, a un campione di controllo prima di miscelare le soluzioni mediante vortice a 3.000 rotazioni al minuto per tre secondi. Quindi, ruotare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo a 1.200 volte G per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo. Aliquot 95 microlitri di ciascuna soluzione di analisi in sei pozzetti consecutivi in una piastra nera a metà area 96.

Preparare 75 microlitri di soluzione enzimatica Gla I o DNMT1 più Gla I nelle provette della microcentrifuga come descritto in precedenza ad una concentrazione finale di tampone una tantum. Quindi, aggiungere 1,2 microlitri di 10 unità per microlitro Gla I a ciascuna soluzione per ottenere una concentrazione finale di 0,16 unità per microlitro. Aggiungere 0,6 microlitri di cinque micromolari RFTS-privi di DNMT1 alla soluzione DNMT1 più Gla I per una concentrazione finale di 40 nanomolari.

Dopo una delicata miscelazione, ruotare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo a 1.200 G per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo. Quindi, aliquote 12 microlitri di ciascuna soluzione enzimatica in sei pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico. Per il test di metilazione del campione di DNA, preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius.

Quindi, inserire la piastra nera contenente le soluzioni di analisi nel lettore di piastre. Dopo aver agitato la piastra a 425 CPM, misurare la fluorescenza con una lunghezza d’onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d’onda di emissione di 528 nanometri. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Rimuovere la piastra di analisi dal lettore di piastre e aggiungere cinque microlitri della soluzione enzimatica a ciascun pozzetto, quindi mescolando la soluzione mediante pipettaggio su e giù. Inserire la piastra nel lettore di piastre e agitare la piastra prima di registrare la fluorescenza ogni 53 secondi per 30 minuti. Ottenere la fluorescenza media dei saggi di controllo Gla I triplicati per ciascuna condizione e sottrarre il Gla I medio contenente vassoi di reazione di controllo dalle tracce triplicate ottenute in presenza di DNMT1 privo di RFTS.

Quindi, determinare l’errore medio e standard della media per le repliche corrette. Tracciare la traccia di reazione corretta media e adattare la porzione lineare iniziale a una linea per determinare la velocità iniziale. Determinare la percentuale di attività dividendo la velocità osservata in presenza di un composto per la velocità osservata nella reazione di controllo contenente DMSO e moltiplicando per 100.

I risultati di un test discontinuo accoppiato a endonucleasi hanno mostrato che il DNA del prodotto completamente metilato è protetto dalla scissione, confermando che il DNMT1 privo di RFTS è attivo e in grado di metilare il DNA del substrato emimetilato. Nel test basato sulla fluorescenza, in assenza di Gla I, l’aggiunta di DNMT1 o tampone da sola non ha influenzato la fluorescenza di fondo. La successiva aggiunta di Gla I a tutti i test ha portato alla generazione di fluorescenza solo nei saggi che contenevano DNMT1.

L’aggiunta simultanea di DNMT1 e Gla I privi di RFTS a tre saggi ha portato alla generazione di una robusta fluorescenza. L’aggiunta di Gla I da sola non ha prodotto fluorescenza. Per lo screening di potenziali inibitori, l’attività di metilazione del DNA di DNMT1 privo di RFTS è stata esaminata in presenza di DMSO, composto uno, composto due o composto tre a concentrazioni micromolari 20 e 50.

I composti che riducono la generazione di fluorescenza in questo test accoppiato devono essere ulteriormente convalidati. Garantire che i composti non inibiscano l’enzima di accoppiamento è un importante passo successivo.