Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi
August 5th, 2022
Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.
Un robusto test per lettori di piastre come il nostro è molto utile per lo screening iniziale di potenziali inibitori della metiltransferasi. La capacità di raccogliere dati in tempo reale è un grande vantaggio del test continuo accoppiato all'endonucleasi. Iniziare preparando 600 microlitri delle condizioni di analisi contenenti 20 composti micromolari e 50 micromolari separatamente nelle provette della microcentrifuga su ghiaccio.
Per fare ciò, aggiungere acqua distillata doppia e tampone di metilazione 5X a ciascun tubo per ottenere una concentrazione finale di tampone di metilazione 1X. Quindi, aggiungere 3,15 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di albume sierico bovino, o BSA, a ciascun campione. Quindi, aggiungere due microlitri di substrato di DNA a forcina 3,15 micromolare e 1,33 microlitri di S-adenosilmetionina 4,75 micromolare, o SAM, a ciascun campione.
Aggiungere l'inibitore ai campioni appropriati per ottenere una concentrazione finale di 21 micromolari o 52,5 micromolari e una quantità equivalente di dimetilsolfossido, o DMSO, a un campione di controllo prima di miscelare le soluzioni mediante vortice a 3.000 rotazioni al minuto per tre secondi. Quindi, ruotare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo a 1.200 volte G per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo. Aliquot 95 microlitri di ciascuna soluzione di analisi in sei pozzetti consecutivi in una piastra nera a metà area 96.
Preparare 75 microlitri di soluzione enzimatica Gla I o DNMT1 più Gla I nelle provette della microcentrifuga come descritto in precedenza ad una concentrazione finale di tampone una tantum. Quindi, aggiungere 1,2 microlitri di 10 unità per microlitro Gla I a ciascuna soluzione per ottenere una concentrazione finale di 0,16 unità per microlitro. Aggiungere 0,6 microlitri di cinque micromolari RFTS-privi di DNMT1 alla soluzione DNMT1 più Gla I per una concentrazione finale di 40 nanomolari.
Dopo una delicata miscelazione, ruotare i campioni per alcuni secondi in una mini centrifuga da tavolo a 1.200 G per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo del tubo. Quindi, aliquote 12 microlitri di ciascuna soluzione enzimatica in sei pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico. Per il test di metilazione del campione di DNA, preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius.
Quindi, inserire la piastra nera contenente le soluzioni di analisi nel lettore di piastre. Dopo aver agitato la piastra a 425 CPM, misurare la fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 528 nanometri. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Rimuovere la piastra di analisi dal lettore di piastre e aggiungere cinque microlitri della soluzione enzimatica a ciascun pozzetto, quindi mescolando la soluzione mediante pipettaggio su e giù. Inserire la piastra nel lettore di piastre e agitare la piastra prima di registrare la fluorescenza ogni 53 secondi per 30 minuti. Ottenere la fluorescenza media dei saggi di controllo Gla I triplicati per ciascuna condizione e sottrarre il Gla I medio contenente vassoi di reazione di controllo dalle tracce triplicate ottenute in presenza di DNMT1 privo di RFTS.
Quindi, determinare l'errore medio e standard della media per le repliche corrette. Tracciare la traccia di reazione corretta media e adattare la porzione lineare iniziale a una linea per determinare la velocità iniziale. Determinare la percentuale di attività dividendo la velocità osservata in presenza di un composto per la velocità osservata nella reazione di controllo contenente DMSO e moltiplicando per 100.
I risultati di un test discontinuo accoppiato a endonucleasi hanno mostrato che il DNA del prodotto completamente metilato è protetto dalla scissione, confermando che il DNMT1 privo di RFTS è attivo e in grado di metilare il DNA del substrato emimetilato. Nel test basato sulla fluorescenza, in assenza di Gla I, l'aggiunta di DNMT1 o tampone da sola non ha influenzato la fluorescenza di fondo. La successiva aggiunta di Gla I a tutti i test ha portato alla generazione di fluorescenza solo nei saggi che contenevano DNMT1.
L'aggiunta simultanea di DNMT1 e Gla I privi di RFTS a tre saggi ha portato alla generazione di una robusta fluorescenza. L'aggiunta di Gla I da sola non ha prodotto fluorescenza. Per lo screening di potenziali inibitori, l'attività di metilazione del DNA di DNMT1 privo di RFTS è stata esaminata in presenza di DMSO, composto uno, composto due o composto tre a concentrazioni micromolari 20 e 50.
I composti che riducono la generazione di fluorescenza in questo test accoppiato devono essere ulteriormente convalidati. Garantire che i composti non inibiscano l'enzima di accoppiamento è un importante passo successivo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per valutare le piccole molecole come potenziali inibitori delle DNA metiltransferasi, che sono importanti bersagli nella terapia del cancro. Il test utilizza un'endonucleasi per collegare la metilazione del DNA alla fluorescenza, consentendo il monitoraggio in tempo reale dell'attività enzimatica.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biochimica
- Ricerca sul cancro
Background
- Le DNA metiltransferasi svolgono un ruolo critico nella regolazione genica e nel cancro.
- L'inibizione di questi enzimi potrebbe fornire benefici terapeutici nel trattamento del cancro.
- I test in tempo reale migliorano il processo di screening per potenziali inibitori.
- I metodi basati sulla fluorescenza consentono una rilevazione sensibile dell'attività enzimatica.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un test robusto per lo screening degli inibitori delle DNA metiltransferasi.
- Utilizzare la raccolta dati in tempo reale per migliorare le prestazioni del test.
- Facilitare l'identificazione di piccole molecole in grado di inibire l'attività delle DNA metiltransferasi.
Metodi utilizzati
- Preparazione delle condizioni di test con concentrazioni specifiche di composti.
- Uso di albumina sierica bovina (BSA) nella configurazione del test.
- Incorporazione di substrato DNA a forcina e S-adenosilmetionina (SAM).
- Monitoraggio dell'attività enzimatica attraverso la generazione di fluorescenza.
Risultati principali
- Il test consente il monitoraggio continuo dell'attività delle DNA metiltransferasi.
- La raccolta dati in tempo reale offre un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali.
- Lo screening iniziale dei composti mostra risultati promettenti nell'identificazione di potenziali inibitori.
- Il metodo è adattabile per varie biblioteche di piccole molecole.
Conclusioni
- Il test sviluppato è efficace per lo screening degli inibitori delle DNA metiltransferasi.
- Il monitoraggio in tempo reale migliora l'affidabilità dei risultati.
- Questo approccio potrebbe accelerare la scoperta di nuove terapie contro il cancro.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This continuous fluorescence-based endonuclease-coupled assay enables real-time monitoring of DNA methyltransferase activity, supporting early-stage screening of small molecule inhibitors. By providing quantitative initial velocity measurements in a microtiter plate format, the method reduces reagent consumption and increases throughput for target validation campaigns. The assay’s ability to detect concentration-dependent inhibition aids in prioritizing compounds with mechanistic relevance to epigenetic dysregulation in cancer.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNMT1 inhibition kinetics to validate epigenetic targets in oncology pipelines.
- Operational Value: Supports rapid assessment of small molecule effects on enzyme activity using fluorescence readouts in a plate-based format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates real-time, continuous data to distinguish true inhibitors from assay artifacts in primary screens.
- Operational Value: Compatible with standard plate readers and microtiter plates, enabling scalable screening of compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links biochemical inhibition of DNMT1 to downstream epigenetic effects, supporting mechanistic de-risking of lead candidates.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for hit-to-lead progression where target engagement is a key decision criterion.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery workflow, positioning after target confirmation and before lead optimization, where biochemical validation of target modulation is essential.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of DNMT1 inhibition as a mechanism for altering DNA methylation patterns in disease models.
- Screening: Enables primary screening of compound libraries with real-time kinetic readouts to identify active molecules.
- Analytics: Delivers initial velocity and percent activity outputs that allow quantitative comparison of inhibitor potency across conditions.
- Translational Research: Supports continuity from enzymatic inhibition to cellular epigenetic outcomes when paired with downstream validation assays.
- Enterprise Reuse: Can be adapted for screening other DNMT isoforms or methyltransferase targets using the same endonuclease-coupled fluorescence principle.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by providing direct, real-time measurement of enzyme activity changes.
- Operational Value: Reduces reagent use and assay time through miniaturized, continuous monitoring in a 96-well format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by distinguishing specific DNMT1 inhibitors from non-specific fluorescence interferents early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds demonstrating concentration-dependent, mechanism-consistent inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and fluorescence-based assay design to interpret kinetic traces and control for background signals.
- Dependent on access to a plate reader capable of temperature control and timed fluorescence excitation at 485 nm and emission at 528 nm.
- Necessitates standardization of reagent preparation, including hemimethylated DNA substrate, SAM, BSA, and Gla I endonuclease, to ensure assay reproducibility.
- Requires validation that test compounds do not inhibit the coupling enzyme Gla I or interfere with fluorescence independently.
- Limited to methyltransferase activity assessment and does not directly report on cellular permeability, metabolic stability, or off-target effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:24
Prepare Assay Solutions for the Screen
1:48
Prepare Enzyme Solutions for the Screen
2:52
Run the Methylation Assay and Analyze the Data
4:29
Results: Determination of Initial Velocities of DNA Methylation in the Presence and Absence of Potential Inhibitors
5:40
Conclusion
