Un approccio di mutagenesi romanzo saturazione: Unico passaggio caratterizzazione della proteina regolatrice siti in RNA usando fosforotioati di legame

L'obiettivo generale di questo approccio al fosforotioato nell'RNA è quello di eseguire la mutagenesi di saturazione in un unico passaggio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare come la regolazione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che in un unico passaggio si può realizzare la mutagenesi di saturazione di un sito di legame proteico nell'RNA.

Un passaggio chiave in questo protocollo di mutagenesi di saturazione in un unico passaggio consiste nel drogare il modello di DNA con nucleotidi non wild type all'interno del sito di legame della proteina. Per prima cosa sintetizzare un primer T7 mediante sintesi chimica su un sintetizzatore di DNA. Successivamente, sintetizzare un oligonucleotide drogato corrispondente al sito di legame della proteina.

In questo esempio, la sequenza sottolineata contiene il complemento inverso del sito di legame della proteina letale sessuale di drosophilas, con ogni sito di drogaggio rappresentato da un X.Utilizzare un rapporto tra il 90% di nucleotide di tipo selvatico e il 10% di nucleotide di tipo non selvatico per ciascun sito di doping. La sequenza in verde è complementare alla sequenza primer T7 ed è il promotore T7 per la trascrizione in vitro. Il passo successivo in questo protocollo è la sintesi di RNA separati con ciascun nucleotide fosforotioato, seguita dalla radiomarcatura dell'RNA con 5-prime-end.

Sintetizzare gli RNA per ogni fosforotioato in una reazione di trascrizione da 20 microlitri. A ciascuna provetta per microcentrifuga, aggiungere quanto segue: tampone di trascrizione T7, un oligonucleotide T7 micromolare, un oligonucleotide drogato micromolare, 10 millimolari DTT, due millimolari GTP, un millimolare ciascuno di ATP, CTP e UTP e due unità per microlitro di RNA polimerasi T7. Aggiungere 0,167 millimolari di alfa-tio ATP a una provetta e 0,05 millimolari di alfa-tio UTP all'altra provetta.

Incubare le miscele di reazione di sintesi dell'RNA a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, aggiungere 2,5 microlitri di alfa fosfatasi termolabile e 2,5 microlitri di tampone fosfatasi 10X a ciascun campione di RNA. Incubare a 37 gradi Celsius per 10-30 minuti per rimuovere i fosfati 5-prime.

Inattivare l'enzima fosfatasi alcalina riscaldandolo a 80 gradi Celsius per due o cinque minuti. I passaggi rimanenti prevedono l'uso della radioattività e devono essere eseguiti utilizzando precauzioni appropriate e uno schermo in plexiglass per proteggere dalla radioattività. Per radiomarcare l'estremità 5-prime dell'RNA defosforilato, utilizzare un microlitro di polinucleotide chinasi T4 e un microlitro di Gamma P32 ATP in un volume di reazione di 10 microlitri.

Incubare le miscele di reazione a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti. Inattivare l'enzima polinucleotide chinasi T4 riscaldandolo a 65 gradi Celsius per 20-30 minuti. Esegui le reazioni in un gel di poliacrilammide denaturante al 10%.

Localizzare l'RNA sul gel mediante autoradiografia e asportare la fetta di gel contenente RNA radiomarcato. Schiacciare la fetta di gel in una provetta da microcentrifuga premendola contro il lato con la punta di una pipetta, quindi aggiungere il tampone proteinasi K. Ruotare i tubi a temperatura ambiente da due ore a tutta la notte.

Quindi centrifugare l'impasto gel, raccogliere la soluzione tampone e scartare il gel. Estrarre ogni soluzione due volte con un volume uguale di cloroformio fenolico. Successivamente, estrarre la soluzione una volta con il cloroformio.

Raccogliere la fase acquosa e aggiungervi 0,1 volumi di acetato di sodio a tre molari pH 5,2, tRNA trasportatore o glicogeno e 2,5 volumi di etanolo. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius per un'ora. Centrifugare i campioni in una microcentrifuga ad alta velocità a 16, 873 volte g per 5-10 minuti.

Rimuovere con cura la soluzione tampone di etanolo senza disturbare il pellet di RNA. Lavare i pellet con etanolo al 70% e centrifugare per due-cinque minuti. Rimuovere con cura l'etanolo e asciugare i pellet all'aria.

Risospendere ogni pellet in 20-50 microlitri di acqua trattata con DEPC. Conservare a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Qui viene illustrato il concetto di partizionamento dovuto all'interferenza.

Durante il processo di legame proteico, le molecole di RNA si dividono tra la frazione legata alla proteina e la frazione non legata. Se un nucleotide specifico in una data posizione interferisce con il legame proteico, sarà preferenzialmente escluso dalla frazione legata alla proteina. Successivamente, lo iodio viene utilizzato per scindere gli RNA nei siti di incorporazione del fosforotioato.

Per iniziare queste procedure, impostare le reazioni di legame proteina-RNA con ciascuna reazione contenente 10 millimolari di Tris-HCl, un millimolare di DTT, 50 millimolari di cloruro di potassio, 0,5 unità per microlitro di inibitore della RNasi, 0,09 microgrammi per microlitro di albumina sierica bovina acetilata, un millimolare di EDTA, 0,15 microgrammi per microlitro di tRNA, 5-prime-end radiomarcato RNA e sei microlitri di una concentrazione appropriata della proteina. Incubare le reazioni di legame delle proteine a 25 gradi Celsius per 20-30 minuti. Separare la frazione di RNA legata alla proteina dalla frazione non legata legando il filtro alla nitrocellulosa.

Applicare la reazione di legame su un filtro di nitrocellulosa collegato a un collettore a vuoto a temperatura ambiente. Solo il complesso proteico dell'RNA verrà trattenuto sul filtro mentre l'RNA non legato scorre attraverso il filtro. Tagliare la parte del filtro nitrocellulosico contenente l'RNA radioattivo trattenuto in pezzi più piccoli per inserirli in una provetta da microcentrifuga e aggiungere una quantità sufficiente di tampone K per immergere i pezzi del filtro.

Eluire l'RNA dai pezzi del filtro per due o tre ore o durante la notte. Successivamente, trasferire la soluzione da ciascuna provetta in una nuova provetta ed estrarre con fenolo cloroformio e cloroformio come dimostrato in precedenza. Raccogliere la fase acquosa e aggiungervi 0,1 volumi di acetato di sodio a tre molari, pH 5,2 e 2,5 volumi di etanolo e incubare in congelatore.

Dopo aver centrifugato, lavato e asciugato l'RNA come mostrato in precedenza, risospendere l'RNA in acqua trattata con DEPC. Tutte le fasi che coinvolgono lo iodio devono essere eseguite in una cappa di aspirazione. Per scindere gli RNA nei siti di incorporazione del fosforotioato, aggiungere a ciascun campione di RNA un millimolare di iodio in 20 microlitri di acqua trattata con DEPC contenente fino a 10 microgrammi di tRNA vettore.

Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Precipitare l'RNA scisso aggiungendo acetato di sodio ed etanolo come mostrato in precedenza. Risospendere l'RNA scisso in un colorante di caricamento per gel denaturanti.

Dopo il riscaldamento, caricare i campioni in un gel di poliacrilammide denaturante al 15-20% e separare i frammenti di RNA mediante elettroforesi. Esporre il gel di poliacrilammide a una pellicola radiografica e rilevare le bande nella frazione legata rispetto al pool totale utilizzando l'autoradiografia. Questo schema illustra il concetto di partizionamento dovuto a interferenze.

Nella corsia T, la frazione totale di RNA, l'intensità della banda è approssimativamente uguale per tutte le posizioni drogate. Nella frazione di RNA legata alla proteina, nelle posizioni 1, 4 e 7, il nucleotide non ha alcun effetto sul legame. Tuttavia, nelle posizioni 3 e 6, interferisce con il legame ed è escluso dalla frazione limitata.

In posizione 5, l'interferenza è parziale. Il confronto delle corsie appaiate per ciascun nucleotide consente l'analisi di tutti e quattro i nucleotidi. Questa autoradiografia mostra due paia di corsie da un gel denaturante.

La corsia T è l'RNA totale e la corsia B è l'RNA legato alle proteine. La linea verticale segna il sito di legame letale per il sesso. Per la coppia alfa-tio alina, le bande 1, 2, 3 e 5 sono presenti nella frazione di RNA totale, ma assenti o significativamente ridotte nella frazione di RNA legata.

Per la coppia alfa-tio-ulina, le bande 7 e 8 sono relativamente meno intense nella frazione legata. I residui che sono preferenzialmente esclusi dalla frazione legata sono importanti per il legame proteico. Una volta sintetizzato l'RNA e marcato con l'estremità 5-prime, questa tecnica può essere eseguita in 12 ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il livello appropriato di incorporazione del fosforotioato e la determinazione della concentrazione proteica appropriata per il legame sono considerazioni importanti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come opportuni saggi funzionali o test in vivo, per convalidare l'esito dell'approccio della mutagenesi e comprenderne la rilevanza biologica. Questa tecnica fornisce un'alternativa ad altri metodi più costosi o più laboriosi o entrambi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e sintetizzare la libreria mutante, eseguire reazioni di legame, identificare i nucleotidi mutanti in ciascun pool e analizzare quantitativamente l'effetto dei nucleotidi di tipo non selvatico in ogni posizione testata. Non dimenticare che lavorare con la poliacrilammide e la radioattività può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come l'uso di guanti, uno scarico adeguato e schermi radioattivi.