Name: Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Scopri come dissezionare la funzione degli enhancer usando l'interferenza multiplex basata su CRISPR nelle linee cellulari. Questo metodo consente di identificare rapidamente le regioni regolatorie coinvolte nella regolazione dell'espressione genica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da NIH/NHGRI R00 HG006922 e NIH/NHGRI R01 HG008974 a J.G. e il Huntsman Cancer Institute. J.B.C. è stato sostenuto dal programma di formazione di NIH in genetica T32GM007464.

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadow+enhancers+foster+robustness+of+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation.</a> Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).</li>
<li>Lam, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+redundant+enhancers+cooperatively+maintain+Mammalian+pomc+expression+above+a+critical+functional+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold.</a> PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Savic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-distal+RNA+polymerase+II+binding+discriminates+active+from+inactive+CCAAT%2F+enhancer-binding+protein+beta+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites.</a> Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Hilton, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+editing+by+a+CRISPR-Cas9-based+acetyltransferase+activates+genes+from+promoters+and+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.</a> Nat Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Kearns, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+native+enhancers+with+a+Cas9-histone+demethylase+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion.</a> Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Groner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAB-zinc+finger+proteins+and+KAP1+can+mediate+long-range+transcriptional+repression+through+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading.</a> PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Fulco, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+functional+enhancer-promoter+connections+with+CRISPR+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference.</a> Science. 354 (6313), 769-773 (2016).</li>
<li>Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li>
<li>Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Engineering+and+Analysis+of+Combinatorial+Enhancer+Activity+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells.</a> Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).</li>
<li>Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Enhancer+Interference+Reveals+Collaborative+Control+of+Gene+Regulation+by+Estrogen+Receptor+alpha-Bound+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers.</a> Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad+proteins+contain+a+dominant+transcription+repression+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mad proteins contain a dominant transcription repression domain.</a> Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).</li>
<li>Alland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+N-CoR+and+histone+deacetylase+in+Sin3-mediated+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression.</a> Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li>
<li>Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+repression+of+AXIN2+and+MYC+gene+expression+using+designer+TALEs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).</li>
<li>Stampfel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+form+diverse+groups+with+context-dependent+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions.</a> Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li>
<li>Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Inducible+CRISPR-dCas9-KRAB+Effector+System+to+Dissect+Transcriptional+Regulation+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).</li>
<li>Romanienko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vector+with+a+Single+Promoter+for+In+Vitro+Transcription+and+Mammalian+Cell+Expression+of+CRISPR+gRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs.</a> PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).</li>
<li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+RNAi+and+CRISPR+technologies+by+large-scale+gene+expression+profiling+in+the+Connectivity+Map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map.</a> PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>O'Geen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCas9-based+epigenome+editing+suggests+acquisition+of+histone+methylation+is+not+sufficient+for+target+gene+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression.</a> Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo semplice e flessibile per la dissezione funzione enhancer del locus genomico endogeno senza alterare fisicamente la sequenza del DNA. Mentre simile nel concetto a protocolli di interferenza CRISPR precedentemente pubblicati utilizzando dCas9-KRAB27, Enhancer-i differisce da questi protocolli in 3 modi principali. In primo luogo, Enhancer-i utilizza il dominio interagente SIN3A di MAD120 per raggiungere disattivazione enhancer. Disattivazione di Enhancer possa essere recuperati utilizzando inibitori HDAC, suggerendo che il meccanismo primario di disattivazione è dipendente di HDAC. A differenza di interferenza CRISPR con dCas9-KRAB, Enhancer-i non porta alla deposizione di H3K9me3. Questo è probabilmente dovuto al fatto che Enhancer-i si basa sull'introduzione transitoria della Guida RNAs, con le cellule essendo raccolte alle 3 giorni post transfezione. In interferenza CRISPR, è osservato un aumento H3K9me3 a 7 giorni post trasduzione12. Infine, il protocollo di Enhancer-i fornisce una strategia per indirizzare più siti contemporaneamente e monitorare l'efficienza di targeting. Mosaico-seq17, dCas9-KRAB è utilizzato per indirizzare rinforzatori multipli simultaneamente, ma questa tecnica si basa sul sequenziamento di RNA di singola cellula per identificare i cambiamenti di espressione, e molti geni (quali geni estrogeno-rispondente) passano inosservati a causa della bassa sensibilità di singole cellule RNA-seq. Enhancer-i fornisce un metodo affidabile per studiare rinforzatori individualmente e in associazione per qualsiasi gene.
La fase più critica di Enhancer-i è transfezione, che dovrebbe essere ottimizzata per la linea cellulare di interesse. Questo protocollo si basa su un trattamento con puromicina arricchire per cellule trasfettate, ma è possibile che guida co-trasfettando RNAs con una proteina fluorescente e l'ordinamento per cellule fluorescenti mediante citometria a flusso può rivelarsi un metodo migliore di arricchimento per alcuni cellulari tipi. Si consiglia di monitorare il livello di espressione della Guida RNAs e SID4x-dCas9-KRAB di qPCR per risolvere i problemi e confermare la transfezione. Se i livelli guida RNA sono bassi (ciclo soglia > 30), gli utenti possono anche considerare alternative guida strategie di produzione di RNA come in vitro trascrizione28. È anche possibile che, malgrado i livelli elevati gRNA, guida targeting RNA della proteina SID4x-dCas9-KRAB è inefficiente, nel qual caso selezionando diversi guida sequenze di RNA può essere necessario. Eseguendo ChIP-seq la proteina di fusione con cromatina dalle cellule Enhancer-i trattati, l'efficienza di targeting può essere monitorato. Se c'è segnale alto di SID4x-dCas9-KRAB presso la regione di interesse e viene rilevata alcuna modifica di espressione nel suo gene bersaglio putativo, quindi la regione probabile non contribuisce all'espressione di tale gene sotto le condizioni studiato.
Una potenziale limitazione di Enhancer-i è che gli effetti fuori bersaglio possono accumularsi se troppi siti sono destinate allo stesso tempo. Tuttavia, CRISPR interferenza strategie per atterramento hanno meno effetti di destinazione oltre RNAi29, particolarmente quando viene utilizzata una linea di policlonale delle cellule che esprimono dCas9-KRAB. Mentre abbiamo visto fuori bersaglio genomic associazione di SID4X-dCas9-KRAB quando la destinazione 10 siti contemporaneamente, non abbiamo individuato i cambiamenti di espressione genica a seguito di quegli eventi di associazione. Come alcuni rinforzatori possono contattare promotori multipli e/o altri esaltatori, è possibile che molti geni possono cambiare espressione al momento di targeting di un enhancer singolo, anche se non è chiaro se questa forma di regolazione genica è comune. Per confermare che i cambiamenti di espressione osservati sono dovuti a un rinforzatore specifico di targeting e non gli effetti fuori bersaglio, gli utenti possono eseguire Enhancer-i con due insiemi distinti di guida non sovrapposte RNAs targeting della stessa regione. Inoltre, la delezione genetica della regione utilizzando Cas9 nucleasi-competente può confermare ulteriormente suoi effetti sull'espressione genica.
Come funzioni Enhancer-i attraverso deacetilazione, è possibile che le sue abilità di disattivazione sono limitate ai rinforzatori che hanno livelli apprezzabili di acetilazione dell'istone. Ci sono una varietà di fusioni repressive alternative che può essere più efficace alle specifiche esaltatori di targeting. Fusioni di methyltransferase del DNA di dCas9 possono essere utilizzate per ridurre l'espressione genica quando mirati a rinforzatori distale30, ma questa repressione spesso non è temporanea. Un'altra fusione repressivo utilizza il dominio di amico di GATA1 (FOG1), che porta a istone H3 lisina 27 trimethylation e reprime l'espressione genica a livelli simili a dCas9-KRAB attraverso una varietà di cellula linee e promotori31. È interessante notare che, aggiunta di ulteriori copie di FOG1 a dCas9 ridotto il potenziale repressivo a promotori, suggerendo che una singola copia del dominio SID può fornire ulteriori disattivazione potenziatore delle 4 copie attualmente utilizzato in Enhancer-i. È possibile che alcuni loci possono trarre vantaggio dal targeting dual da diverse combinazioni delle fusioni dCas9 sopra. Ad esempio, stabile a lungo termine repressione può avvenire attraverso la trasduzione simultanea di dCas9-DNMT3a e dCas9-KRAB32. La maggior parte di queste fusioni repressive sono stata indirizzata solo a un singolo locus in un momento, e rimane poco chiaro che è più efficace nel manipolare rinforzatori multipli contemporaneamente.
Enhancer-i, mentre un metodo adatto per lo studio di combinazioni di rinforzatori per una manciata di geni, è ancora un po ' limitato nella velocità effettiva se l'utente desidera studiare putativi rinforzatori per centinaia di geni. Future applicazioni di questa tecnica di integrare tecnologie basate su formazione immagine per quantificare i geni multipli in campioni multipli contemporaneamente. D'importanza, queste tecnologie sono compatibili con rilevamento diretto di molecole di RNA da lisato, eliminando la necessità di isolamento del RNA che richiede tempo. Questi adattamenti faciliterà l'interrogatorio del set più grandi dei rinforzatori.

Su larga scala di sequenziamento progetti come codifica1e tabella di marcia epigenomica2FANTOM3 sono identificati milioni di esaltatori di presunti all'interno del genoma umano attraverso centinaia di tipi di cellule. Si stima che ogni promotore si associa con una media di 4,9 esaltatori e ogni enhancer contatti una media di 2,4 geni3, suggerendo che l'espressione genica è spesso il risultato dell'integrazione di molteplici interazioni di regolamentazione distribuite. Una sfida significativa restante è quello di definire non solo come singoli rinforzatori contribuiscono all'espressione genica, ma come essi si combinano per colpire espressione. Approcci genetici sono comunemente usati per identificare le relazioni tra esaltatori in organismi modello da drosofila4 a topi5. Tuttavia, questi esperimenti sono basso-rendimento per lo studio di esaltatori di più geni multipli e che richiede tempo.
Un approccio per lo studio della funzione enhancer su larga scala prevede saggi reporter parallelismo massivo. Queste analisi consentono la selezione simultanea di migliaia di sequenze di DNA per la loro capacità di guidare l'espressione di un reporter gene6. Mentre queste analisi hanno indicato che sequenza di DNA da solo può essere sufficiente per trasmettere il gene regolamento informazioni7, tornano con i caveat di viene eseguita all'esterno del contesto di cromatina nativo e con un promotore eterologo. Inoltre, la dimensione della sequenza di DNA analizzato nelle analisi di parallelismo massivo reporter è di solito meno di 200 basi, che possono escludere la sequenza rilevante circostante. Cosa importante, come reporter saggi solo misurano l'attività di una sequenza in un momento, non tengono conto le relazioni complesse che possono esistere tra rinforzatori. Così, mentre saggi reporter massicciamente parallela possono essere informativi circa l'attività intrinseca di una sequenza di DNA, essi non necessariamente ci informa della funzione di quella sequenza di DNA nel contesto del genoma.
Recentemente sviluppati strumenti di CRISPR/Cas98 hanno facilitato lo studio della regolazione genica poiché consentono l'eliminazione di esaltatori del locus endogeno. Tuttavia, l'eliminazione di esaltatori di multipli simultaneamente può portare a instabilità genomica ed è molto tempo per generare le eliminazioni successive del rinforzatore in una linea singola cella. Inoltre, nuova sequenza genomica è creato presso il sito dell'eliminazione dopo la riparazione, e questa sequenza può avere funzione regolatrice. Una versione alternativa di Cas9 è stata sviluppata specificamente per la modulazione dell'espressione genica, basandosi su fusioni di attivazione9,10 o reprimere11,12 domini alla forma di nucleasi-carenti di Cas9 (dCas9). Queste proteine di fusione sono ideali per studiare i luoghi multipli simultaneamente come fisicamente non alterano la sequenza del DNA e invece modulare epigenetica per interrogare una regione regolatrice. La fusione repressiva più ampiamente usata è KRAB, che recluta il complesso co-repressore KAP1, promuovendo la deposizione di repressione-collegata istone H3 lisina 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, noto anche come CRISPR interferenza14, è stato usato per destinazione e schermo rinforzatori individuali per i loro contributi a gene espressione15,16; Tuttavia, esso non è stato ottimizzato per il targeting più aree contemporaneamente. Una versione di interferenza di CRISPR multiplex per rinforzatori, mosaico-seq17, utilizza singola cella RNA-seq come una lettura, ma questa tecnologia è costoso e adatto solo per lo studio dei geni altamente espressi a causa della bassa sensibilità della singola cella RNA-seq.
Abbiamo cercato di sviluppare un metodo di base di interferenza di CRISPR per la dissezione funzione combinatoria enhancer nel contesto di una risposta trascrizionale ad estrogeno. Circa la metà dei geni estrogeno-rispondente contengono esaltatori di 2 o più vincolati dal recettore degli estrogeni (ER) è vicino a18, suggerendo che esaltatori di più possono essere partecipanti nella risposta dell'estrogeno e comprendere che la logica di regolamentazione richiederebbe targeting rinforzatori multipli contemporaneamente. Come gli studi di iniziale con interferenza CRISPR a promotori ha suggerito che non tutti i promotori sono ugualmente reattivi KRAB-mediata repressione19, abbiamo ragionato che l'aggiunta di un dominio repressivo distinto per dCas9 può facilitare la disattivazione della esaltatori di diversi. Abbiamo scelto il Sin3a interagendo dominio di Mad1 (in SID)20 come conduce al reclutamento di istone deacetilasi21, che rimuovono i gruppi acetile sugli istoni che sono associati con l'attività trascrizionale. D'importanza, il dominio SID è stato efficace nel ridurre l'espressione genica quando fusa a dCas922 e TALEs23e Sin3a ha dimostrato di essere un co-fattore potente di repressivo in una varietà di contesti di enhancer sequenza24. Abbiamo usato SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) a 10 diversi rinforzatori vincolati al pronto soccorso di destinazione e identificare siti di legame di ER (erbe) che sono necessari per la risposta trascrizionale dell'estrogeno alle 4 geni18. Siamo presi di mira anche le combinazioni di rinforzatori per identificare i siti che collaborano nella produzione della risposta trascrizionale dell'estrogeno. Abbiamo trovato che fino a 50 siti possono potenzialmente essere mirate simultaneamente con cambiamenti di espressione di gene rilevabile. Utilizzando ChIP-seq e RNA-seq, abbiamo dimostrato che Enhancer-i è una tecnica altamente specifica per studiare rinforzatori multipli contemporaneamente.
In questo protocollo, descriviamo i passaggi coinvolti nell'esecuzione di Enhancer-i, una tecnica flessibile che consente lo studio funzionale di esaltatori di multipli simultaneamente in un ambiente di coltura del tessuto. Enhancer-i è altamente correlato con delezione genetica ma fornisce disattivazione transitoria che dipende dell'istone deacetilasi (HDAC). Fornendo guida RNAs tramite trasfezione transiente al contrario stabile integrazione tramite vettori virali, questo protocollo evita la deposizione e la potenziale diffusione del H3K9me3. Questo protocollo Dettagli Guida RNA design e clonazione tramite Assemblea di Gibson, la transfezione di guida RNAs utilizzando lipofezione, e l'analisi dell'espressione genica risultante cambia da qPCR. Includiamo anche i metodi per valutare la specificità di Enhancer-i targeting a livello del genoma e del trascrittoma. Mentre questa tecnica è stata sviluppata per studiare regolamento del gene di ER associato rinforzatori in linee cellulari tumorali umane, è applicabile per la dissezione di qualsiasi mammifero enhancer.

<table><tbody><tr><td>Kit ZR a 96 pozzetti Quick-RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step</td><td>Applied Biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>enzima di restrizione AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR ad alta fedeltà Master Mix con tampone HF NEB</td><td></td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA Pulito & Kit concentratore</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-estradiolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>Umano: cellule Ishikawa</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac coniglio policlonale</td><td>Motivo attivo</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 coniglio policlonale</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>FLAG monoclonale di topo</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ER alfa coniglio policlonale</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro plasmide</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen et al., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector plasmide</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali et al., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 plasmide puromicina</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB plasmide</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, con perle di cattura dell'mRNA KAPA</td><td>Kapa Biosytems</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Proteasi e Inibitore della Fosfatasi Mini Compresse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin Antibiotico selettivo (G418 solfato) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>ThermoFisher Scientific 10855001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA a 2 log viola a caricamento rapido</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione della funzione enhancer usando multiplex basati su crispr enhancer interferenze nelle linee cellulari

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Rinforzatori più spesso regolano un dato gene, ma per la maggior parte dei geni, rimane poco chiaro quali stimolatori sono necessari per l'espressione genica, e come questi rinforzatori si combinano per produrre una risposta trascrizionale. Come milioni di rinforzatori sono stati identificati, ad alta produttività strumenti sono necessari per determinare la funzione enhancer su scala genomica. Attuali metodi per lo studio della funzione enhancer includono fare genetiche eliminazioni utilizzando Cas9 nucleasi-competente, ma è difficile studiare gli effetti combinatoriali di esaltatori di più utilizzando questa tecnica, come più righe successive clonale delle cellule devono essere generati. Qui, presentiamo Enhancer-i, un metodo basato su interferenza di CRISPR che permette per l'interrogatorio funzionale di esaltatori di multipli contemporaneamente ai loro loci endogeni. Enhancer-i fa uso di due domini repressivi fuse a nucleasi-carenti Cas9, SID e KRAB, raggiungere disattivazione enhancer tramite deacetilazione ai loci mirati. Questo protocollo utilizza trasfezione transiente di guida RNAs per abilitare inattivazione transitoria delle regioni mirate ed è particolarmente efficace nel bloccare trascrizionali inducibili risposte agli stimoli nelle impostazioni di coltura del tessuto. Enhancer-i è altamente specifico sia nella sua targeting genomica e suoi effetti sull'espressione genica globale. Risultati ottenuti da questo protocollo aiutano a capire se un rinforzatore contribuisca all'espressione genica, l'entità del contributo, e come il contributo è influenzato da altri esaltatori di nelle vicinanze.

La figura 1 Mostra uno schema del flusso di lavoro descritto nel protocollo. Per determinare i contributi di esaltatori di ER associato vicino al gene estrogeno-regolate MMP17, che ha 3 siti di legame nelle vicinanze come definito dal ChIP-seq (Figura 2A), guidano di RNA sono stati progettati per ogni regione. Per progettare guida RNAs, una finestra di bp di 600-900 di sequenza che circonda ogni ER sito di legame di interesse è stato selezionato e messo in un programma di progettazione del RNA di guida. RNA sequenze risultanti guida con 0-2 preveduto fuori target siti sono stati allineati al genoma umano utilizzando BLAT. Quattro non sovrapposte guida RNAs che attraversava l'area definita da ChIP-seq e ipersensibilità di DNaseI sono stati scelti per il targeting (Figura 2B). Ulteriore sequenza (tabella 1) è stato aggiunto a ciascuna estremità per facilitare la clonazione a valle e la conseguente 59 frammenti del nucleotide sono state ordinate. All'arrivo, guida RNAs erano diluiti e riuniti dal sito e un breve PCR è stata effettuata per aggiungere aree di omologia prima del montaggio di Gibson. Figura 2 Mostra il prodotto di RNA Guida previsto dopo un breve PCR utilizzando i primer di "U6_internal" (tabella 1), che aggiungeranno 20 basi di sequenza a ogni estremità della del basepair 59 guida frammento di RNA, risultanti in una sequenza del basepair ~ 100. A seguito di Assemblea Gibson, queste piscine guida RNA sono state trasformate in batteri e plasmide minipreps sono stati preparati il giorno seguente. Figura 2D Mostra i risultati da un esperimento di dissezione di enhancer, dove più rinforzatori è vicino a MMP17 sono mirati da solo e in combinazione con Enhancer-i. Siti mirati da Enhancer-io sono indicati con un esagono nero. Guida RNA plasmidi targeting i siti indicati sono stati trasfettati in una linea cellulare Ishikawa estrogeno-sfavoriti che esprimono stabilmente SID4X-dCas9-KRAB. Due giorni dopo, i media è stato cambiato e con puromicina è stato aggiunto per arricchire per cellule trasfettate. Il giorno seguente, le cellule sono state raccolte dopo un trattamento di estradiolo di 8 h 10 nM. RNA è stato isolato, e una qPCR One-Step è stato effettuato. In questo esempio, siti 1 e 2 sono necessari per una risposta estrogenica completa di MMP17, mentre sito 3 non contribuisce in queste condizioni (Figura 2D, corsie ii-iv). Quando sono attivi solo i siti 2 o 3 (vi e vii), la risposta di estrogeno è simile a quando nessun sito è attivo (viii), suggerendo che questi siti non possono contribuire in modo indipendente. Sito 1 può contribuire qualche espressione di sé (v), ma la più grande attività è visto quando siti 1 e 2 sono attivi (iv).
Per manipolare simultaneamente 10 rinforzatori vicino a 4 diversi geni (Figura 3A), complesse piscine di guidano RNAs è stato generato contenente 42 enhancer guide e 16 promotore. Guida RNA oligos sono stati riuniti prima della Guida iniziale estensione RNA PCR (punto 3.3), e i prodotti PCR ottenuti sono stati purificati e combinati con il vettore di clonazione U6 con puromicina vuoto utilizzando assembly di Gibson. A seguito dell'Assemblea di Gibson, più trasformazioni indipendenti erano eseguite e placcate. Le piastre sono state raschiate in LB e ha permesso di crescere fuori per 2-4 h prima del maxiprep. Figura 3B Mostra rappresentative riduzioni nell'espressione del gene di qPCR quando questi pool di RNA di guida sono stati trasfettati in una linea cellulare Ishikawa estrogeno-sfavoriti che esprimono stabilmente SID4X-dCas9-KRAB e trattati come descritto in precedenza (Figura 2D). Riduzioni da Enhancer-i sono simili a quelli ottenuti prendendo di mira il promotore del gene bersaglio putativo. Figura 3 illustra gli effetti di diluizione della Guida RNAs su riduzione della risposta dell'estrogeno utilizzando Enhancer-i. Un 01:50 diluizione di un pool di guida RNA targeting il rinforzatore vicino G0S2 ancora produce una riduzione significativa nell'espressione genica, suggerendo che Enhancer-i può essere utilizzato per indirizzare fino a 50 siti in una volta. Tuttavia, la disattivazione può essere diluita, che indica che centinaia di siti non può essere destinati allo stesso tempo a meno che non sono impiegati metodi di rilevazione più sensibili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> Figura 1. Protocollo schematico per dissezione enhancer multiplex utilizzando Enhancer-i. Guida RNAs (rosso e blu) sono progettati utilizzando e-croccante e selezionato utilizzando il browser del genoma UCSC. Guida quattro RNAs sono scelti che coprono le regioni di interesse (trascrizione fattore associazione siti come definito da ChIP-seq). Oligonucleotidi da RNA guida che hanno messo in comune dalla regione di interesse (rosso e blu) sono sottoposti a una PCR per aggiungere regioni di omologia (arancione) prima della Assemblea di Gibson e trasformazione. Risultante piscine plasmide transfected via lipofezione in linee cellulari che esprimono stabilmente SID4X-dCas9-KRAB o in cellule wild-type in combinazione con il plasmide SID4X-dCas9-KRAB. Guida RNA plasmide piscine possono essere transfected individualmente per un sito di destinazione in un momento, o in combinazione per indirizzare più siti contemporaneamente. Cellule transfettate sono trattate con antibiotici per arricchire per celle contenenti guida RNAs. A transfezione di post ~ 72 h, le cellule vengono raccolte. Acidi nucleici può essere estratta per qPCR, RNA-seq o ChIP-seq <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> Nella figura 2. Guida di dissezione di design e rinforzatore di RNA per MMP17. (A) Genome browser screenshot di esaltatori di alfa-associazione di ER (grigio) ad essere bersaglio vicino MMP17. Questa figura è stata modificata da Carleton, et al. 18. (B) guida RNA progetta per i 3 siti18di associazione. Il sito di legame per ER come definito da ChIP-seq è il target e la piastrella di RNAs 4 Guida in tutta questa regione. Il segnale di sensibilità di DNaseI, che si estende per il sito di legame, è utilizzabile anche per definire la sequenza di destinazione per guida design di RNA. ChIP-seq sia dati di DNaseI HS sono stati ottenuti da cellule di Ishikawa trattate con 10 estradiolo nM per 1 h. (C) rappresentante guida sequenze di RNA sono pronti per il montaggio di Gibson, avendo subito un breve PCR per aggiungere regioni di omologia. (D) l'espressione relativa di MMP17 misurato via qPCR seguendo il targeting di specifiche regioni con Enhancer-i e un trattamento di estradiolo nM 8-h10. Espressione è relativo livello CTCF ed espressione di MMP17 in cellule non trattate con estradiolo. Guida di controllo RNA bersaglio il promotore di IL1RN. Tutte le barre di errore rappresentano SEM, doppi asterischi indicano p &lt; 0.01 e singoli asterischi indicano p &lt; 0.05 in un t-test accoppiato. Questa figura è stata modificata da Carleton, et al. 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> Figura 3. Esaltatori di più vicino a geni differenti simultaneamente con il targeting in pool Enhancer-i. (A) schema dei siti di legame e promotori di essere mirati in pool Enhancer-i. (B) gli effetti sull'espressione come misurato da qPCR dopo trattamento E2 su Ishikawa cellule transfected con piscina di plasmide Enhancer-i (verde), promotore-i plasmidi piscina (blu) o controllo gRNAs (bianco)18. Una riduzione significativa a tutti i geni è osservata con Enhancer-i. Questa figura è stata modificata da Carleton, et al. 18. (C) gli effetti sui livelli di espressione di G0S2 dopo il trattamento E2 in Ishikawa cellule trasfettati con diverse quantità di guida RNAs G0S2di targeting. Una riduzione significativa può essere visto anche con piccole quantità di guida RNA (01:50 diluizione), suggerendo che fino a 50 siti possono mirati contemporaneamente. Tutte le barre di errore rappresentano SEM, doppi asterischi indicano p &lt; 0.01 e singoli asterischi indicano p &lt; 0.05 in un t-test accoppiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Sequenza</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Primer usati per estensione della guida della RNA e sequenziamento, qPCR e rilevazione della proteina di fusione.

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per progettare e realizzare targeting multiplex di esaltatori con la proteina di fusione disattivazione SID4X-dCas9-KRAB, noto anche come interferenza di enhancer (Enhancer-i). Questo protocollo consente l'identificazione dei rinforzatori che regolano l'espressione genica e facilita la dissezione delle relazioni tra esaltatori di un gene bersaglio comune di regolazione.

Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica e della regolazione genica, come ad esempio il modo in cui più regioni regolatorie geniche, note anche come potenziatori, lavorano insieme per controllare la trascrizione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che più enhancer vicino a più geni diversi possono essere testati contemporaneamente al fine di identificare rapidamente le regioni coinvolte nella regolazione genica. Per iniziare la progettazione dell'RNA guida, generare prima le sequenze di DNA come descritto nel protocollo di testo.Utilizzare un programma come E-CRISP sulle sequenze di DNA generate per trovare RNA guida con bassi off-target. Gli RNA guida sono costituiti da 20 nucleotidi a monte di un motivo adiacente al protospaziatore, che assume la forma di NGG per il dCas9 di S.pyogenes. Sul sito web di E-CRISP, selezionare l'organismo di interesse utilizzando il menu a discesa.L'assemblaggio del genoma appare a destra del nome della specie. Selezionare il pulsante di opzione L'ingresso è la sequenza FASTA. Copia le sequenze FASTA dall'alto e incollale nella finestra di dialogo.Assicurati che sia inclusa un'intestazione FASTA per ogni sequenza. Seleziona il pulsante di opzione medio e Design singolo nel menu a discesa. Fare clic sul pulsante Avvia ricerca di un singolo gRNA.Si aprirà una nuova scheda del browser e verranno visualizzati i risultati. Scarica le sequenze candidate facendo clic sul pulsante Scarica un report tabellare formulato in Excel per tutte le sequenze di query insieme. Successivamente, utilizzare il browser del genoma UCSC per guidare le sequenze di RNA del candidato BLAT al genoma.In un browser, accedere al sito Web del browser del genoma UCSC. Nella sezione I nostri strumenti, individua la parola BLAT e fai clic su di essa. Si aprirà lo strumento di ricerca BLAT.Utilizza i menu a discesa situati sotto il testo del genoma di ricerca BLAT per selezionare l'organismo e l'assemblaggio del genoma di interesse. Copiare le sequenze di RNA guida dal report tabellare generato da E-CRISP e incollarle nella finestra di dialogo. Assicurati che ogni sequenza abbia un'intestazione FASTA univoca, quindi fai clic su Invia nella parte inferiore della finestra di dialogo.Nella pagina dei risultati di ricerca BLAT, appariranno gli allineamenti di ciascuna sequenza di RNA guida, con ogni linea che rappresenta un allineamento. Idealmente, dovrebbe esserci un allineamento per ogni RNA guida, che indichi l'unicità di quell'RNA guida. Se possibile, evita le guide che mappano più posizioni nel genoma.Per esaminare la localizzazione e la distribuzione dell'RNA guida all'interno della regione di interesse, fare clic sul collegamento del browser nella sezione Azioni per uno degli RNA guida interrogati. Apparirà il browser del genoma e sarà centrato sull'RNA guida selezionato. Utilizzare i pulsanti di riduzione nella parte superiore della pagina per visualizzare la distribuzione di altri RNA guida identificati da E-CRISP all'interno della regione di interesse.Selezionare quattro RNA guida, preferibilmente non sovrapposti, distribuiti in tutta la regione di interesse. Se l'area di interesse supera le 600 coppie di basi, è consigliabile aggiungere una o due guide aggiuntive. Evitare gli RNA guida con allungamenti omopolimerici e contenuto di GC estremo, poiché queste caratteristiche possono ostacolare il processo di clonazione dell'RNA guida e ridurre l'efficienza del targeting dell'RNA guida.Ricostituire gli oligo di RNA guida a una concentrazione finale di 100 micromolari in acqua ultrapura. Dovrebbero esserci almeno quattro oligo di RNA guida separati per ogni regione di interesse. Per ogni regione regolatoria di interesse, creare un pool di tutti gli oligo corrispondenti alla regione di interesse.In una provetta Eppendorf, combinare cinque microlitri di ogni singolo oligo di RNA guida ricostituito per ogni regione. Mescola bene la piscina a vortice, quindi rimuovi un microlitro e diluisci questo eloquat da 1 a 200 in acqua ultrapura. Eseguire una breve PCR con i primer USICS per collegare le regioni di omologia agli oligo come descritto nel protocollo di testo.Circa 40 basi saranno aggiunte a ciascun oligo, producendo un prodotto di circa 100 coppie di basi che contiene un'omologia sufficiente con lo spettro USIC su entrambe le estremità. Quindi, imposta le reazioni dell'assemblaggio Gibson sul ghiaccio. Utilizzare 50 nanogrammi del vettore digerito e sette nanogrammi dell'inserto in una reazione di 20 microlitri.Inoltre, impostare una reazione di assemblaggio di Gibson solo vettoriale digerito utilizzando 50 nanogrammi del vettore e sostituendo l'inserto con acqua. Incubare le reazioni dell'Assemblea di Gibson per 15 minuti a 50 gradi Celsius, quindi tenere premuto a 4 gradi Celsius. Dopo aver trasferito i prodotti assemblati nel ghiaccio, diluirli da 1 a 4 in acqua ultrapura su ghiaccio.Ad esempio, aggiungi cinque microlitri di prodotto Gibson Assembly a 15 microlitri di acqua ultrapura. Successivamente, trasforma i prodotti Gibson Assembly diluiti. Fate cadere cellule competenti ad alta efficienza sul ghiaccio e fate 25 microlitri di eloquat per ogni trasformazione.Se si desidera un pool complesso che si rivolge a più siti, far cadere un numero sufficiente di cellule in provette diverse per eseguire più trasformazioni indipendenti. Piastra 50 microlitri delle cellule trasformate e posiziona le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per una notte. Per le mini-preparazioni delle piscine mirate ai singoli siti, posizionare le cellule direttamente in tre-cinque millilitri di brodo LB contenente ampicillina o carbenicillina.Incubare le cellule durante la notte agitando a 250 giri/min e 37 gradi Celsius. Per le biblioteche di grandi dimensioni, usa un raschietto per raccogliere tutte le colonie di ogni singola piastra in un'unica maxi-preparazione. Ciò può essere facilitato versando circa cinque millilitri di LB con l'antibiotico appropriato in un tubo Falcon da 15 millilitri e raschiando le colonie nel tubo.Il giorno prima della trasfezione, placcare le cellule in una piastra a 24 pozzetti, con una confluenza del 30-50%. Piastra un numero sufficiente di cellule in modo che le trasfezioni possano essere eseguite in duplicato e includi pozzetti da trasfettare con RNA guida di controllo. Assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente sul pozzetto, scuotendo delicatamente la piastra dopo la placcatura delle cellule.Agitare ogni cinque minuti nei primi 15 minuti. Il giorno seguente, preparare le trasfezioni secondo le istruzioni del reagente di trasfezione scelto. Per le celle di Ishikawa, utilizzare 550 nanogrammi di plasmide totale per ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.Diluire i plasmidi a una concentrazione finale di 020 microgrammi per millilitro in terreni privi di siero. Utilizzare tre microlitri di reagente di trasfezione per ogni microgrammo di DNA, agitare delicatamente e incubare per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 25 microlitri della miscela finale in ogni pozzetto.Preparare un volume sufficiente di tampone di lisi con beta-mercaptoetanolo all'1%. Aspirare il fluido utilizzando un aspiratore a vuoto. Lavare le cellule una volta con un volume uguale di 1x PBS e aspirare per rimuovere la maggior quantità possibile di PBS.Aggiungere 300 microlitri della soluzione BME di lisi in ciascun pozzetto, utilizzando una pipetta multicanale. Pipettare la soluzione di lisi su e giù da otto a dieci volte e trasferirla in una piastra a pozzetti profondi o in provette Eppendorf da 1,7 millilitri su ghiaccio. L'RNA può essere estratto immediatamente o i lisati possono essere congelati a meno 80 gradi Celsius per l'elaborazione futura.I disegni dell'RNA guida sono mostrati per i tre siti di legame del fattore di trascrizione vicino a MMP17. La regione bersaglio è il sito di legame per l'ER alfa come definito da ChiP-seq, e i quattro RNA guida si trovano in questa regione. Qui è mostrato il prodotto di RNA guida atteso dopo una breve PCR, utilizzando i primer interni dell'USIC.La reazione aggiungerà 20 coppie di basi di sequenza a ciascuna estremità del frammento di RNA guida da 59 coppie di basi, ottenendo una sequenza di circa 100 coppie di basi. Vengono mostrati i risultati qualitativi della PCR da un esperimento Enhancer-I presso MMP17. I siti presi di mira da Enhancer-I sono indicati con un esagono nero.I siti 1 e 2 sono necessari per la risposta estrogenica completa di MMP17, mentre il sito 3 non contribuisce. Il sito 1 può contribuire da solo a una certa espressione, ma l'attività maggiore si vede quando i siti 1 e 2 sono attivi. Una volta ottimizzata per la linea cellulare di interesse, questa tecnica può essere eseguita in cinque-sette giorni, se eseguita correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare RNA guida per Enhancer-I, creare e trasfettare pool complessi di RNA guida e raccogliere cellule trasfettate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere un ambiente di coltura tissutale sterile e utilizzare materiali privi di RNasi e DNasi. Seguendo questa procedura, altri metodi, come ChiP-seq e RNA-seq, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio dove nel genoma si lega l'Enhancer-I e come influisce sull'espressione genica globale.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare la regolazione genica indotta dagli estrogeni nei loci endogeni nel genoma umano, invece di utilizzare reporter episomiali. Non dimenticare che lavorare in ambienti di coltura di tessuti di mammiferi può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale.

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Gli strumenti di editing del genoma come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) hanno notevolmente migliorato l'efficienza del targeting genico nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter hiPSC specifici per il lignaggio utilizzando la ricombinazione omologa assistita dal sistema CRISPR/Cas.

Generazione efficiente di reporter knockin specifici per il lignaggio neurale hiPSC utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e Cas9 Double Nickase

La convalida sperimentale dell'attività dell'enhancer è meglio affrontata dall'analisi della perdita di funzione. Viene presentato un protocollo efficiente che utilizza la delezione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule ES F1 che contengono un genoma ibrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l'analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l'efficienza di editing.

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

La somministrazione diretta di complessi preassemblati di ribonucleoproteina di RNA Cas9/guide è un mezzo veloce ed efficiente per l'editing del genoma nelle cellule ematopoietiche. Qui, utilizziamo questo approccio per eliminare un silenziatore intronico RUNX1 ed esaminare le risposte trascrizionali nelle cellule leucemiche OCI-AML3.

Indagine sul ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 di CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein acuta

Segnaliamo l'applicazione della cattura della conformazione quantitativa del cromosoma seguita dal sequenziamento ad alto processo in corpi embrionali generati da cellule staminali embrionali. Questa tecnica consente di identificare e quantificare i contatti tra stimolatori e regioni promotrici di un determinato gene durante la differenziazione delle cellule staminali embrionali.

Identificazione dei contatti Enhancer-Promoter nei corpi embrionali mediante Quantitative Chromosoma Conformation Capture (4C)

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA

La linea cellulare THP-1 è ampiamente utilizzata come modello per studiare le funzioni dei monociti/macrofagi umani in varie aree di ricerca legate alla biologia. Questo articolo descrive un protocollo per l'ingegneria efficiente basata su CRISPR-Cas9 e l'isolamento di cloni di singole cellule, che consente la produzione di dati fenotipici robusti e riproducibili.

Knockout genico mediato da CRISPR-Cas9 basato sull'elettroporazione in cellule THP-1 e isolamento di cloni a singola cellula

Il protocollo descrive i metodi per l'editing dell'epigenoma basato su CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in linee cellulari umane utilizzando la trasfezione del DNA plasmidico e la nucleofecazione dell'mRNA.

Editing dell'epigenoma CRISPR nelle cellule umane mediante trasfezione del DNA plasmidico e consegna della nucleofecazione dell'mRNA

Questo protocollo fornisce una pipeline computazionale semplificata per quantificare le trascrizioni dei potenziatori nascenti. Integrando l'accessibilità della cromatina, le caratteristiche della cromatina e i dati trascrizionali, consente un rilevamento accurato e un'analisi specifica del filamento dell'attività dell'enhancer in regioni intrageniche complesse, pur rimanendo accessibile ai ricercatori senza un'ampia formazione in bioinformatica.

Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

Scopri come dissezionare la funzione degli enhancer usando l'interferenza multiplex basata su CRISPR nelle linee cellulari. Questo metodo consente di identificare rapidamente le regioni regolatorie coinvolte nella regolazione dell'espressione genica.

Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari

Esplora altri video