Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica e della regolazione genica, come ad esempio il modo in cui più regioni regolatorie geniche, note anche come potenziatori, lavorano insieme per controllare la trascrizione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che più enhancer vicino a più geni diversi possono essere testati contemporaneamente al fine di identificare rapidamente le regioni coinvolte nella regolazione genica. Per iniziare la progettazione dell'RNA guida, generare prima le sequenze di DNA come descritto nel protocollo di testo.

Utilizzare un programma come E-CRISP sulle sequenze di DNA generate per trovare RNA guida con bassi off-target. Gli RNA guida sono costituiti da 20 nucleotidi a monte di un motivo adiacente al protospaziatore, che assume la forma di NGG per il dCas9 di S.pyogenes. Sul sito web di E-CRISP, selezionare l'organismo di interesse utilizzando il menu a discesa.

L'assemblaggio del genoma appare a destra del nome della specie. Selezionare il pulsante di opzione L'ingresso è la sequenza FASTA. Copia le sequenze FASTA dall'alto e incollale nella finestra di dialogo.

Assicurati che sia inclusa un'intestazione FASTA per ogni sequenza. Seleziona il pulsante di opzione medio e Design singolo nel menu a discesa. Fare clic sul pulsante Avvia ricerca di un singolo gRNA.

Si aprirà una nuova scheda del browser e verranno visualizzati i risultati. Scarica le sequenze candidate facendo clic sul pulsante Scarica un report tabellare formulato in Excel per tutte le sequenze di query insieme. Successivamente, utilizzare il browser del genoma UCSC per guidare le sequenze di RNA del candidato BLAT al genoma.

In un browser, accedere al sito Web del browser del genoma UCSC. Nella sezione I nostri strumenti, individua la parola BLAT e fai clic su di essa. Si aprirà lo strumento di ricerca BLAT.

Utilizza i menu a discesa situati sotto il testo del genoma di ricerca BLAT per selezionare l'organismo e l'assemblaggio del genoma di interesse. Copiare le sequenze di RNA guida dal report tabellare generato da E-CRISP e incollarle nella finestra di dialogo. Assicurati che ogni sequenza abbia un'intestazione FASTA univoca, quindi fai clic su Invia nella parte inferiore della finestra di dialogo.

Nella pagina dei risultati di ricerca BLAT, appariranno gli allineamenti di ciascuna sequenza di RNA guida, con ogni linea che rappresenta un allineamento. Idealmente, dovrebbe esserci un allineamento per ogni RNA guida, che indichi l'unicità di quell'RNA guida. Se possibile, evita le guide che mappano più posizioni nel genoma.

Per esaminare la localizzazione e la distribuzione dell'RNA guida all'interno della regione di interesse, fare clic sul collegamento del browser nella sezione Azioni per uno degli RNA guida interrogati. Apparirà il browser del genoma e sarà centrato sull'RNA guida selezionato. Utilizzare i pulsanti di riduzione nella parte superiore della pagina per visualizzare la distribuzione di altri RNA guida identificati da E-CRISP all'interno della regione di interesse.

Selezionare quattro RNA guida, preferibilmente non sovrapposti, distribuiti in tutta la regione di interesse. Se l'area di interesse supera le 600 coppie di basi, è consigliabile aggiungere una o due guide aggiuntive. Evitare gli RNA guida con allungamenti omopolimerici e contenuto di GC estremo, poiché queste caratteristiche possono ostacolare il processo di clonazione dell'RNA guida e ridurre l'efficienza del targeting dell'RNA guida.

Ricostituire gli oligo di RNA guida a una concentrazione finale di 100 micromolari in acqua ultrapura. Dovrebbero esserci almeno quattro oligo di RNA guida separati per ogni regione di interesse. Per ogni regione regolatoria di interesse, creare un pool di tutti gli oligo corrispondenti alla regione di interesse.

In una provetta Eppendorf, combinare cinque microlitri di ogni singolo oligo di RNA guida ricostituito per ogni regione. Mescola bene la piscina a vortice, quindi rimuovi un microlitro e diluisci questo eloquat da 1 a 200 in acqua ultrapura. Eseguire una breve PCR con i primer USICS per collegare le regioni di omologia agli oligo come descritto nel protocollo di testo.

Circa 40 basi saranno aggiunte a ciascun oligo, producendo un prodotto di circa 100 coppie di basi che contiene un'omologia sufficiente con lo spettro USIC su entrambe le estremità. Quindi, imposta le reazioni dell'assemblaggio Gibson sul ghiaccio. Utilizzare 50 nanogrammi del vettore digerito e sette nanogrammi dell'inserto in una reazione di 20 microlitri.

Inoltre, impostare una reazione di assemblaggio di Gibson solo vettoriale digerito utilizzando 50 nanogrammi del vettore e sostituendo l'inserto con acqua. Incubare le reazioni dell'Assemblea di Gibson per 15 minuti a 50 gradi Celsius, quindi tenere premuto a 4 gradi Celsius. Dopo aver trasferito i prodotti assemblati nel ghiaccio, diluirli da 1 a 4 in acqua ultrapura su ghiaccio.

Ad esempio, aggiungi cinque microlitri di prodotto Gibson Assembly a 15 microlitri di acqua ultrapura. Successivamente, trasforma i prodotti Gibson Assembly diluiti. Fate cadere cellule competenti ad alta efficienza sul ghiaccio e fate 25 microlitri di eloquat per ogni trasformazione.

Se si desidera un pool complesso che si rivolge a più siti, far cadere un numero sufficiente di cellule in provette diverse per eseguire più trasformazioni indipendenti. Piastra 50 microlitri delle cellule trasformate e posiziona le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per una notte. Per le mini-preparazioni delle piscine mirate ai singoli siti, posizionare le cellule direttamente in tre-cinque millilitri di brodo LB contenente ampicillina o carbenicillina.

Incubare le cellule durante la notte agitando a 250 giri/min e 37 gradi Celsius. Per le biblioteche di grandi dimensioni, usa un raschietto per raccogliere tutte le colonie di ogni singola piastra in un'unica maxi-preparazione. Ciò può essere facilitato versando circa cinque millilitri di LB con l'antibiotico appropriato in un tubo Falcon da 15 millilitri e raschiando le colonie nel tubo.

Il giorno prima della trasfezione, placcare le cellule in una piastra a 24 pozzetti, con una confluenza del 30-50%. Piastra un numero sufficiente di cellule in modo che le trasfezioni possano essere eseguite in duplicato e includi pozzetti da trasfettare con RNA guida di controllo. Assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente sul pozzetto, scuotendo delicatamente la piastra dopo la placcatura delle cellule.

Agitare ogni cinque minuti nei primi 15 minuti. Il giorno seguente, preparare le trasfezioni secondo le istruzioni del reagente di trasfezione scelto. Per le celle di Ishikawa, utilizzare 550 nanogrammi di plasmide totale per ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.

Diluire i plasmidi a una concentrazione finale di 020 microgrammi per millilitro in terreni privi di siero. Utilizzare tre microlitri di reagente di trasfezione per ogni microgrammo di DNA, agitare delicatamente e incubare per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 25 microlitri della miscela finale in ogni pozzetto.

Preparare un volume sufficiente di tampone di lisi con beta-mercaptoetanolo all'1%. Aspirare il fluido utilizzando un aspiratore a vuoto. Lavare le cellule una volta con un volume uguale di 1x PBS e aspirare per rimuovere la maggior quantità possibile di PBS.

Aggiungere 300 microlitri della soluzione BME di lisi in ciascun pozzetto, utilizzando una pipetta multicanale. Pipettare la soluzione di lisi su e giù da otto a dieci volte e trasferirla in una piastra a pozzetti profondi o in provette Eppendorf da 1,7 millilitri su ghiaccio. L'RNA può essere estratto immediatamente o i lisati possono essere congelati a meno 80 gradi Celsius per l'elaborazione futura.

I disegni dell'RNA guida sono mostrati per i tre siti di legame del fattore di trascrizione vicino a MMP17. La regione bersaglio è il sito di legame per l'ER alfa come definito da ChiP-seq, e i quattro RNA guida si trovano in questa regione. Qui è mostrato il prodotto di RNA guida atteso dopo una breve PCR, utilizzando i primer interni dell'USIC.

La reazione aggiungerà 20 coppie di basi di sequenza a ciascuna estremità del frammento di RNA guida da 59 coppie di basi, ottenendo una sequenza di circa 100 coppie di basi. Vengono mostrati i risultati qualitativi della PCR da un esperimento Enhancer-I presso MMP17. I siti presi di mira da Enhancer-I sono indicati con un esagono nero.

I siti 1 e 2 sono necessari per la risposta estrogenica completa di MMP17, mentre il sito 3 non contribuisce. Il sito 1 può contribuire da solo a una certa espressione, ma l'attività maggiore si vede quando i siti 1 e 2 sono attivi. Una volta ottimizzata per la linea cellulare di interesse, questa tecnica può essere eseguita in cinque-sette giorni, se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare RNA guida per Enhancer-I, creare e trasfettare pool complessi di RNA guida e raccogliere cellule trasfettate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere un ambiente di coltura tissutale sterile e utilizzare materiali privi di RNasi e DNasi. Seguendo questa procedura, altri metodi, come ChiP-seq e RNA-seq, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio dove nel genoma si lega l'Enhancer-I e come influisce sull'espressione genica globale.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare la regolazione genica indotta dagli estrogeni nei loci endogeni nel genoma umano, invece di utilizzare reporter episomiali. Non dimenticare che lavorare in ambienti di coltura di tessuti di mammiferi può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale.