Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Questo metodo può aiutare gli scienziati a massimizzare l'uso produttivo delle isole pancreatiche per valutare più risultati su ciascun campione nella sua architettura tissutale nativa. Il vantaggio principale di questo nuovo metodo di inclusione è che gli isolotti sono distribuiti uniformemente su un'area ben definita, posizionando molti isolotti nel piano di sezione che ottimizza la resa sperimentale di questo materiale a bassa abbondanza. A dimostrare la procedura sarà il dottor Yahui Kong, un ricercatore associato nel mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, utilizzare un puntale per pipetta p200 a basso legame e una griglia calibrata sotto uno stereomicroscopio per prelevare manualmente 250 isolotti equivalenti. Trasferendoli in ogni tubo per microfuge a basso legame da 1,5 millilitri. Lascia che le isole si depositino sul fondo del tubo di microfuga.

Quindi, utilizzare una pipetta con una punta p200 fresca per rimuovere con cura la maggior parte del surnatante. Facendo attenzione a non rimuovere alcuna isola. Aggiungere un millilitro di PBS e centrifugare in una centrifuga a secchio oscillante fino a quando la velocità raggiunge 200 volte la gravità e quindi arrestare la centrifuga.

Rimuovere il surnatante. Ripetere l'intero processo di lavaggio PBS per un totale di due cicli di lavaggio. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di soluzione di formalina al 10% o paraformaldeide al 4% appena preparata.

Lasciare riposare il campione a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta con una punta p200 per rimuovere il fissativo. Aggiungere un millilitro di PBS e centrifugare fino a quando la velocità raggiunge i 200 tempi di gravità e poi fermare la centrifuga.

Rimuovere il surnatante e ripetere ancora una volta l'intero processo di lavaggio PBS per un totale di due cicli di lavaggio. Preparare il gel desiderato in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri come indicato nel protocollo di testo. Quindi, posiziona queste provette da microcentrifuga in un blocco termico a 70 gradi Celsius per riscaldare il gel.

Utilizzare una punta per micropipetta tagliata per trasferire 10 microlitri di perle di blu di agarosio per campione in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di PBS alle perline, quindi centrifugare a 800 volte la gravità per un minuto. Rimuovere il PBS e ripetere il lavaggio ancora una volta.

Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perline in una quantità adeguata di PBS. Centrifugare le provette contenenti le isole fino a quando la velocità raggiunge 200 volte la gravità e poi interrompere la centrifuga. Rimuovere la maggior parte del surnatante.

Usando un paio di forbici, tagliare l'estremità di un puntale per micropipetta da 10 microlitri per ogni campione. Aggiungere 10 microlitri di perline a ciascun tubo dell'isolotto utilizzando una punta tagliata in modo netto per ogni campione. Quindi centrifugare fino a quando la velocità raggiunge 200 volte la gravità.

Successivamente, utilizzare un 200 microlitro non tagliato seguito da una punta da 10 microlitri per rimuovere quanto più PBS possibile. Etichettare i vetrini del microscopio per l'identificazione del campione e posizionarli sul banco vicino al blocco termico con il gel riscaldato. Usando un paio di forbici, tagliare le estremità di alcuni puntali per micropipette a basso legame per campione.

Utilizzando una micropipetta dotata di punta tagliata, aggiungere gel caldo a una provetta contenente isole e perline. Mescolate subito evitando la creazione di bolle. Applicare questa miscela su un vetrino formando un disco vicino al bordo del vetrino lasciando spazio per l'anello esterno in gel.

Quindi, picchiettare delicatamente lo scivolo alcune volte per sistemare le isolette e le perline. Aggiungere 20 microlitri di gel caldo alla provetta del campione e mescolare il nuovo gel con eventuali isole e perline rimanenti. Applicare questa miscela sullo stesso vetrino che circonda il disco originale.

Ripetere se necessario utilizzando punte fresche pretagliate per ogni applicazione fino a quando il disco non raggiunge la dimensione e lo spessore desiderati. Assicurati di preparare ogni disco singolarmente e di tenere traccia dell'ordine dei campioni se posizioni più dischi su ciascun lato. Quindi, posiziona i vetrini su una superficie piana di ghiaccio bagnato e coprili.

Lasciare riposare i vetrini per 10 minuti o fino a quando il gel non si solidifica. Quindi, rimuovere le diapositive assicurandosi di asciugare il retro di ciascuna. Etichettare una cassetta di trattamento della biopsia e di inclusione del tessuto per ogni campione.

Usa il bordo smussato di una lama di rasoio per spingere delicatamente il disco da ogni direzione per liberarlo dal vetro. Quando scorre facilmente, spingere lentamente il disco fuori dalla slitta e posizionare il disco con il lato piatto rivolto verso il basso direttamente sulla carta. Può essere difficile mantenere intatti i dischi distinti mentre lo si fa scorrere dal vetrino alla carta.

Se si verifica una piega nel disco, lasciarlo tornare nella posizione originale, aggiungere altro gel e rigelificare il vetrino. Piegare la carta attorno al disco per evitare che si muova. Trasferiscilo nella cassetta e poi chiudi la cassetta.

Immergere la cassetta in un becher riempito di PBS. In questo studio, viene utilizzato un metodo di inclusione basato su dischi di gel modificati per generare in modo efficiente un'elevata resa di isole per sezione. La morfologia delle isole di roditori è notevolmente più intatta dopo il recupero post-isolamento in isolotto che mostra una superficie liscia e arrotondata e una forma sferica compatta.

Il fatto che la morfologia umana delle isole sia simile, indipendentemente dal fatto che sia incorporata il giorno dell'arrivo o dopo il recupero post-spedizione durante la notte, potrebbe essere dovuto al fatto che le isole si stanno riprendendo dallo stress da isolamento prima della spedizione. In confronto, le sezioni di paraffina ottenute con la vecchia tecnica del microtubo, si vede avere un'area della sezione trasversale del tessuto più piccola con meno isole per sezione e con isole e perle densamente impacchettate. Come mostrato qui, questa tecnica è in grado di produrre sezioni di isole di alta qualità per la colorazione istologica e in immunofluorescenza.

La colorazione con insulina e glucagone mostra la diversa composizione e l'eterogeneità dell'architettura delle isole, dimostrando le differenze architettoniche note tra le isole umane, di topo e di ratto. Queste immagini rappresentano anche sezioni seriali degli stessi isolotti. Dimostrando che questa tecnica è in grado di ottenere più sezioni dagli stessi isolotti.

Una volta padroneggiata, questa tecnica consente di risparmiare tempo rispetto alla tecnica della microcentrifuga. La formatura del disco su una superficie piana piuttosto che in un tubo facilita il trasferimento fisico del disco nella cassetta per la lavorazione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia delle isole, può essere applicato anche ad altri blocchi cellulari o tessuti friabili difficili da sezionare.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un gel di piccolo volume per concentrare il tessuto in una piccola area e formare il disco su una superficie piana. È inoltre fondamentale utilizzare provette per microcentrifuga a basso legame e puntali per pipette per migliorare la resa dei tessuti. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle isole per esplorare la composizione e l'eterogeneità del tipo cellulare, l'interazione cellula-cellula e la regolazione genica in intere isole coltivate nella loro architettura nativa.

La capacità di generare 10 o più sezioni contenenti molte isole da una singola condizione sperimentale consente la quantificazione di più risultati sullo stesso materiale, migliorando l'efficienza sperimentale. L'applicazione di questa tecnica a campioni di tessuto ad abbondanza limitata può offrire vantaggi anche ad altri campi. Potrebbe essere necessario modificare alcuni elementi di questa procedura per soddisfare le esigenze degli utenti.

L'intensità di fissazione e la divisione devono essere ottimizzate. Con questa tecnica è possibile generare dischi più spessi o più grandi. Potrebbe essere necessario annidare semplici passaggi di lavorazione per l'incorporamento e ottimizzarli.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare un blocco di cellule di agarosio di alta qualità per sezioni di paraffina di intere isole pancreatiche in coltura.