Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici
6 gennaio 2013
Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.
Ciao, mi chiamo Dorte del Thea Hands Institute presso l'Università di Tecnologia, Reen Laser. La microdissezione è una tecnica che consente di ottenere una speciale popolazione cellulare da piccolissime quantità di tumore parentale. Le cellule sezionate possono essere utilizzate per studi trascrittomici e proteomici, valutazione del DNA o analisi cromosomica.
Qui forniamo il nostro protocollo per l'acquisizione di metacellule pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per studi trascrittomici. Tagliare il tessuto pancreatico in piccoli pezzi. Metti un pezzo al centro di uno stampo criogenico e coprilo con un composto di inclusione refrigerato.
Congelare immediatamente il fazzoletto con due materiali Bhutan raffreddati e conservati a meno 80 gradi Celsius. Sezionare etichettare 40 vetrini adesivi e pre-raffreddarli all'interno della Camera Cristica. Fissare il tessuto congelato sul portacampioni con il composto OCT dopo aver tagliato il blocco criogenico.
Tagliare 40 sezioni spesse 10 micrometri. Trasferire una sezione su un vetrino toccando il retro del vetrino con il dito per riscaldare solo la posizione per posizionare la sezione su di esso. Provare le sezioni due o tre minuti all'interno del crio morto e conservarle in seguito a meno 80 gradi Celsius, preparare i reagenti Ation e raffreddare tutti i liquidi tranne la seline su ghiaccio. Ciò aumenterà l'autofluorescenza intrinseca delle cellule animali domestici prima della micro dissezione.
Quattro sezioni saranno declassate ogni volta. Gestisci due sezioni contemporaneamente. Fissali prima in etanolo al 70% per 30 secondi.
Quindi lavare le sezioni con cinque o sei tuffi veloci. In seguito in acqua trattata DPC. Disidratare il tessuto per un minuto in etanolo al 100% e ripetere questo passaggio, incubare i vetrini in seline per quattro minuti.
Nel frattempo, inizia la disidratazione di un altro paio di sezioni. Infine, asciugare all'aria i vetrini per tre o cinque minuti al buio. Proteggere il tessuto dall'umidità e l'autofluorescenza dallo sbiancamento posizionando i due vetrini uno dietro l'altro in un foglio di alluminio Avvolgere la provetta da 50 ml Prima della sezione, pulire il microscopio con gli RNA e bloccare il cappuccio adesivo nel robo Mover.
Inserire il vetrino nel tavolino e spostare il cappuccio sulla sezione senza toccarlo. Localizzare gli occhielli identificando le aree cellulari migliori dell'autofluorescenza. L'autofluorescenza intrinseca delle cellule umane migliori appare gialla nella configurazione, mentre i dotti pancreatici mostrano un'autofluorescenza verde brillante.
Seleziona le aree cellulari migliori con lo strumento di selezione a mano libera e sezionale micro avviando il laser. Sezionare gli occhielli di quattro sezioni criogeniche declassate in un cappuccio adesivo entro 40-60 minuti. Se lo si desidera, controllare il tessuto catturato spostando il cappuccio sul punto di controllo del microscopio.
Rimuovere il tappo dal robo mover e convogliarlo. 10 microlitri di tampone di estrazione nel coperchio del tappo per la disgregazione cellulare. Incubare il tappo capovolto a 42 gradi Celsius per 30 minuti.
Centrifugare il lisato, etichettare la provetta e conservarla a meno 80 gradi Celsius in meno fino a quando non può avvenire l'estrazione dell'RNA. Eseguire il laser Ation, la micro dissezione e la lisi con tutte le 40 criodissezioni. Successivamente, unire i 10 lisati e continuare con l'isolamento dell'RNA utilizzando il kit di isolamento dell'UR PU RNA seguendo il protocollo fornito per ottenere 11 microlitri di RNA.
In generale, non abbiamo trovato una relazione diretta tra la quantità di tessuto microdisetto e la resa dell'RNA. Le differenze nell'intervallo di tempo tra il prelievo da parte dei chirurghi e il congelamento del campione pancreatico dopo il suo esame da parte del patologo, potrebbero spiegare in parte la qualità teriale e la quantità di RNA recuperato. Altri fattori chiave da considerare sono l'energia laser applicata per la microdissezione con l'energia più bassa, utilizzando la maggiore integrità dell'RNA, nonché la messa a fuoco del laser e la distanza dei punti di puntamento della taglierina a pressione laser. Inoltre, la quantità di RNA può essere ottimizzata mantenendo la distanza tra il cappuccio adesivo e il più bassa possibile.
Evitare la perdita di tessuto microsezionato durante il processo di cattura, a condizione che sia disponibile il microscopio laser per microdissezione. Questa procedura potrebbe essere implementata in qualsiasi istituto di ricerca che esegua cectomie parziali del pancreas, aumentando così l'accesso al materiale palpebrale umano sia da soggetti non diabetici che diabetici.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la microdissezione laser per recuperare isolotti pancreatici umani da campioni chirurgici. La tecnica migliora il recupero di cellule beta per studi trascrittomici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Trascrittomica
Sfondo
- La microdissezione laser permette l'isolamento di popolazioni cellulari specifiche.
- È particolarmente utile per campioni di tessuto di piccole dimensioni.
- La tecnica può essere applicata a diversi tipi di studio, inclusi analisi trascrittomique e proteomiche.
- Migliorare l'autofluorescenza facilita il recupero delle cellule bersaglio.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per l'acquisizione di isolotti pancreatici umani.
- Facilitare lo studio delle cellule beta nella ricerca transcriptomica.
- Migliorare l'efficienza del recupero cellulare da campioni chirurgici.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di microdissezione laser applicata al tessuto pancreatico.
- Preparazione dei campioni di tessuto mediante taglio in piccoli pezzi.
- Inclusione del tessuto in un composto refrigerato per una microdissezione ottimale.
- Raccolta delle cellule beta per ulteriori analisi.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di isolotti pancreatici umani.
- Migliorata autofluorescenza delle cellule beta osservata.
- Il protocollo ha dimostrato efficacia per studi transcriptomici.
- Agevolata la raccolta di popolazioni cellulari mirate da campioni di piccole dimensioni.
Conclusioni
- Il protocollo migliora il recupero delle isole pancreatiche umane.
- La microdissezione laser è uno strumento prezioso per l'analisi cellulare.
- Metodi migliorati possono portare a migliori approfondimenti nella ricerca transcriptomica.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microdissezione laser consente l'isolamento preciso di cellule beta pancreatiche umane da campioni chirurgici limitati, affrontando un collo di bottiglia fondamentale negli studi trascrittomici su tessuti rilevanti per il diabete. Migliorando l'autofluorescenza intrinseca attraverso un trattamento con reagenti a freddo, il protocollo riduce il tempo di manipolazione del tessuto e migliora la conservazione dell'RNA, sostenendo direttamente la validazione degli obiettivi nella ricerca sulle malattie metaboliche. Questo approccio rafforza la riduzione del rischio meccanicistica fornendo popolazioni cellulari purificate per applicazioni "omics" a valle nei flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando popolazioni pure di cellule beta per l'analisi dei percorsi nei modelli di diabete di tipo 2.
- Valore operativo: Facilita la riduzione del rischio biologico mediante l'identificazione rapida e accurata delle cellule bersaglio attraverso un'autofluorescenza potenziata, riducendo i falsi positivi nella selezione dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per la standardizzazione dei saggi fornendo input di RNA coerenti e ad alta integrità da isolotti microdissecati.
- Valore operativo: Supporta output quantitativi riproducibili, essenziali per la prontezza allo screening e il riutilizzo della piattaforma nei percorsi di scoperta di biomarcatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza clinica consentendo l'analisi trascrittomica di isolotti pancreatici umani direttamente collegati alla patofisiologia del diabete.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo popolazioni cellulari definite per studi meccanicistici di follow-up.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso della scoperta consentendo la verifica di ipotesi nella biologia iniziale, supportando lo sviluppo di saggi mediante input standardizzati e informando le decisioni traslazionali attraverso un profilo molecolare quantitativo.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico isolando le cellule beta per la validazione funzionale dei bersagli in modelli di malattie metaboliche.
- Screening: Fornisce campioni pronti per saggi con rese di RNA riproducibili, fondamentali per valutare gli effetti dei composti sugli isolati isolati.
- Analisi: Genera letture trascrittomique quantitative che permettono il confronto tra stati diabetici e non diabetici al fine di guidare l'identificazione di composti promettenti.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità preclinica fornendo campioni pertinenti all'uomo che collegano i risultati in vitro ai meccanismi della malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'accesso agli isolati primari umani in più progetti, riducendo la dipendenza da fonti donatrici variabili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di segnalazione specifici per le cellule beta.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità attraverso un processo controllato dei tessuti e parametri di dissezione definiti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto consentendo una valutazione precoce dell'interazione con il bersaglio in cellule rilevanti per l'uomo, riducendo il rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli per il diabete in base a profili trascrittomici validati delle isole pancreatiche umane, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia, criosezionamento e utilizzo di strumentazione per microdissezione laser.
- Presuppone l'accesso a un sistema PALM MicroBeam o a una piattaforma LMD equivalente dotata di capacità AutoLPC.
- Necessita di protocolli standardizzati per la manipolazione dei reagenti al fine di mantenere l'autofluorescenza e l'integrità dell'RNA tra diversi utilizzatori.
- Comporta la necessità di adattamenti in base alla qualità variabile dei campioni pancreatici e al tempo ischemico intercorso tra il prelievo e il congelamento.
- È limitato dalla resa di RNA, che richiede l'unione di più campioni microdissecati per ottenere un quantitativo sufficiente in ingresso per i kit successivi.
