Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Ciao, mi chiamo Dorte del Thea Hands Institute presso l'Università di Tecnologia, Reen Laser. La microdissezione è una tecnica che consente di ottenere una speciale popolazione cellulare da piccolissime quantità di tumore parentale. Le cellule sezionate possono essere utilizzate per studi trascrittomici e proteomici, valutazione del DNA o analisi cromosomica.

Qui forniamo il nostro protocollo per l'acquisizione di metacellule pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per studi trascrittomici. Tagliare il tessuto pancreatico in piccoli pezzi. Metti un pezzo al centro di uno stampo criogenico e coprilo con un composto di inclusione refrigerato.

Congelare immediatamente il fazzoletto con due materiali Bhutan raffreddati e conservati a meno 80 gradi Celsius. Sezionare etichettare 40 vetrini adesivi e pre-raffreddarli all'interno della Camera Cristica. Fissare il tessuto congelato sul portacampioni con il composto OCT dopo aver tagliato il blocco criogenico.

Tagliare 40 sezioni spesse 10 micrometri. Trasferire una sezione su un vetrino toccando il retro del vetrino con il dito per riscaldare solo la posizione per posizionare la sezione su di esso. Provare le sezioni due o tre minuti all'interno del crio morto e conservarle in seguito a meno 80 gradi Celsius, preparare i reagenti Ation e raffreddare tutti i liquidi tranne la seline su ghiaccio. Ciò aumenterà l'autofluorescenza intrinseca delle cellule animali domestici prima della micro dissezione.

Quattro sezioni saranno declassate ogni volta. Gestisci due sezioni contemporaneamente. Fissali prima in etanolo al 70% per 30 secondi.

Quindi lavare le sezioni con cinque o sei tuffi veloci. In seguito in acqua trattata DPC. Disidratare il tessuto per un minuto in etanolo al 100% e ripetere questo passaggio, incubare i vetrini in seline per quattro minuti.

Nel frattempo, inizia la disidratazione di un altro paio di sezioni. Infine, asciugare all'aria i vetrini per tre o cinque minuti al buio. Proteggere il tessuto dall'umidità e l'autofluorescenza dallo sbiancamento posizionando i due vetrini uno dietro l'altro in un foglio di alluminio Avvolgere la provetta da 50 ml Prima della sezione, pulire il microscopio con gli RNA e bloccare il cappuccio adesivo nel robo Mover.

Inserire il vetrino nel tavolino e spostare il cappuccio sulla sezione senza toccarlo. Localizzare gli occhielli identificando le aree cellulari migliori dell'autofluorescenza. L'autofluorescenza intrinseca delle cellule umane migliori appare gialla nella configurazione, mentre i dotti pancreatici mostrano un'autofluorescenza verde brillante.

Seleziona le aree cellulari migliori con lo strumento di selezione a mano libera e sezionale micro avviando il laser. Sezionare gli occhielli di quattro sezioni criogeniche declassate in un cappuccio adesivo entro 40-60 minuti. Se lo si desidera, controllare il tessuto catturato spostando il cappuccio sul punto di controllo del microscopio.

Rimuovere il tappo dal robo mover e convogliarlo. 10 microlitri di tampone di estrazione nel coperchio del tappo per la disgregazione cellulare. Incubare il tappo capovolto a 42 gradi Celsius per 30 minuti.

Centrifugare il lisato, etichettare la provetta e conservarla a meno 80 gradi Celsius in meno fino a quando non può avvenire l'estrazione dell'RNA. Eseguire il laser Ation, la micro dissezione e la lisi con tutte le 40 criodissezioni. Successivamente, unire i 10 lisati e continuare con l'isolamento dell'RNA utilizzando il kit di isolamento dell'UR PU RNA seguendo il protocollo fornito per ottenere 11 microlitri di RNA.

In generale, non abbiamo trovato una relazione diretta tra la quantità di tessuto microdisetto e la resa dell'RNA. Le differenze nell'intervallo di tempo tra il prelievo da parte dei chirurghi e il congelamento del campione pancreatico dopo il suo esame da parte del patologo, potrebbero spiegare in parte la qualità teriale e la quantità di RNA recuperato. Altri fattori chiave da considerare sono l'energia laser applicata per la microdissezione con l'energia più bassa, utilizzando la maggiore integrità dell'RNA, nonché la messa a fuoco del laser e la distanza dei punti di puntamento della taglierina a pressione laser. Inoltre, la quantità di RNA può essere ottimizzata mantenendo la distanza tra il cappuccio adesivo e il più bassa possibile.

Evitare la perdita di tessuto microsezionato durante il processo di cattura, a condizione che sia disponibile il microscopio laser per microdissezione. Questa procedura potrebbe essere implementata in qualsiasi istituto di ricerca che esegua cectomie parziali del pancreas, aumentando così l'accesso al materiale palpebrale umano sia da soggetti non diabetici che diabetici.