Name: Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Impara a caratterizzare le isole pancreatiche umane con colorazione H&E e immunistochimica. Questo metodo consente di valutare la composizione endocrina, la replicazione cellulare e gli infiltrati infiammatori per studi sul diabete.

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Gli autori ringraziano le famiglie dei donatori e le Organizzazioni Organ Procurement coinvolti in questa ricerca e Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, Roshan e Agarwal per la loro assistenza di un esperto. Questo lavoro è stato finanziato dalla Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) a sostegno della rete per i donatori di organi del pancreas con diabete.

1. Microtomia per sezioni non macchiate <ol><li> Impostare bagnomaria e microtomo come per microtomia paraffina standard. Utilizzare vetrini con carica positiva e pre-etichetta con il numero di casi, regione pancreas (campione) e il numero di diapositiva. Posto blocco di paraffina nel mandrino microtomo con l&#39;etichetta cassetta sul lato sinistro. </li><li> Seguire le procedure Microtomia normali, sezione nel blocco finché il tessuto è uniformemente incontrato. Produrre un nastro di sezioni seriali (4 micron di spessore, 3-6 a seconda del numero di macchie iniziali richiesti (vedi Modulo per l&#39;invio Case, appendice 1)). Sezioni distinte nella barra multifunzione, pick up in ogni ordine e posto su vetrini con ordine numerata a matita. Indicare se una sezione è inutilizzato da numerazione sezioni in ordine esatto. Mantenere lo stesso orientamento sul vetrino come si trova nella cassetta con l&#39;etichetta slitta orientata verso sinistra. Secco per una notte a temperatura ambiente quindi procedere con colorazione o distribuzione investigatori. </li><li> Reseal superficie del blocco di paraffina con uno strato sottile di paraffina per preservare il tessuto e archivio a temperatura ambiente oa -20 ° C. </li><li> Per microtomia successiva, mantenere la numerazione per le sezioni seriali ad ogni livello come sopra. Ottenere uno scivolo aggiuntivo e macchia da slitta H &amp; E per ogni livello di ~ 100 uM all&#39;interno di ogni blocco. </li></ol> 2. H &amp; E di colorazione <ol><li> Posizionare la prima diapositiva di serie sezionato da ciascun blocco in un rack scorrevole poi nel primo cassetto del Autostainer. </li><li> Selezionare lo standard H &amp; E del programma macchia e procedere come al solito. </li><li> Al termine della colorazione, rimuovere i vetrini da Autostainer e il luogo in cappa per coprioggetto. </li><li> Coprioggetto usando la tecnica standard. Asciugare a fondo e etichetta con un&#39;etichetta stampata (vedere la sezione 12). </li></ol> 3. IHC Set-up <ol><li> Selezionare il programma Dako per le macchie doppi ei numeri di ingresso di diapositive. Preparare buffer TBST e citrato, anticorpi, e Reag altrigenitori in base ai volumi specificati (Tabella 1). Caricare il vassoio dei reagenti e diapositive. Rotazione di pulito e linee di scarico sono programmati secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Se l&#39;esecuzione di questi test manualmente, preparare volumi stimati. Incubare i vetrini in una camera umidificata per evitare vetrini di essiccazione in qualsiasi fase. Seguire la stessa procedura per ogni reagenti esempio per l&#39;Autostainer. </li></ol> 4. IHC Deparaffinizzazione e recupero Antigen <ol><li> Mettere vetrini in xilene per 5 minuti. Ripetere una volta. Non lasciare che i vetrini si asciughino in qualsiasi momento successivo fino indicati come questo si tradurrà in background colorazione eccessiva e poveri. </li><li> Trasferire vetrini al 100% di etanolo per 2 minuti. Ripetere una volta. </li><li> Mettere in vetrini appena preparata 3% H 2 O 2 in metanolo per 10 minuti. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 90% e quindi inserire nel 90% di etanolo per 3 minuti. </li><li> Trasferimento scorre versoEtanolo 70% per 1 minuto. </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata. </li><li> Preriscaldare il piroscafo e tampone citrato in vapore per 5 minuti. </li><li> Aggiungere diapositive a citrato buffer nel vapore e il vapore per 30 minuti. </li><li> Trasferire immediatamente scivoli ad acqua e tenere premuto fino a quando scorre raffreddare a temperatura ambiente (~ 20 minuti). </li><li> Trasferire i vetrini con i rack Dako Autostainer secondo macchiare sequenza (Figura 1) ed eseguire il programma di doppia colorazione. Le fasi principali del programma Autostainer sono elencati in modo che piste manuali possono duplicare. </li></ol> 5. Primi Anticorpi primari (Ki-67, CD3, polipeptide pancreatico) <ol><li> Blocca vetrini con la soluzione di Sniper per 15 minuti. Lavare due volte con TBST. </li><li> Incubare i vetrini in anticorpo primario per 30 minuti. Lavare due volte con TBST. </li><li> Incubare con Mach2 capra anti-topo (Ki-67) o anti-coniglio (CD3, polipeptide pancreatico) rafano perossidasi (HRP) polimero per 30 minuti. Lavare due volte con TBST. </li><li> Applicare 3,3-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) per i vetrini per 4 minuti. Lavare due volte con acqua. </li><li> Vetrini incubati con il polipeptide pancreatico si svolgono sul Dako quando viene saggiato contemporaneamente e TBST utilizzato per tutti i passi successivi, mentre i vetrini vengono incubati con la seconda serie di anticorpi primari. In alternativa, per le prove manuali, passare alla sezione 6. </li></ol> 6. Secondo Anticorpi Primari (insulina, glucagone) <ol><li> Incubare i vetrini in Deeb per 20 minuti. Lavare due volte con TBST. </li><li> Blocco con 10% siero di capra normale in bloccante avidina 20% in TBST (insulina) o Sniper (glucagone) in TBST per 20 minuti. Lavare due volte con TBST. </li><li> Incubare con insulina o glucagone anticorpo primario per 15 minuti. Lavare due volte con TBST. </li><li> Insulina: vetrini Incubare in biotinilato di capra anti-cavia a 1:300 diluizione per 30 minuti. Lavare due volte con TBST. Incubare con standard di vector ABC-AP reagente per 30 minuti. Lavare due volte con TBST. </li><li> Glucagone: vetrini Incubare in tampone durante per 30 minuti seguiti da capra anti-topo fosfatasi alcalina (AP) polimero per 30 minuti. Lavare due volte con TBST. </li><li> Mentre vetrini vengono incubati in coniugati, riscaldare il buffer LPR a temperatura ambiente. Aggiungere 1 goccia di liquido rosso permanente (LPR) per 3 mL di tampone immediate prima dell&#39;uso e del luogo in rack reagente Dako. Incubare i vetrini in LPC per 4 minuti. Lavare due volte con acqua. </li><li> Incubare i vetrini in ematossilina per 1 minuto. Sciacquare due volte con acqua. </li><li> Incubare i vetrini in TBS pH 7,6 per 1 minuto. Sciacquare due volte con acqua. </li><li> Scaricare diapositive da DAKO Autostainer. </li><li> Immediatamente disidratare vetrini colorati per il polipeptide pancreatico. Per tutte le diapositive doppie colorate, asciutto per almeno 1 ora, quindi disidratano. </li></ol> 7. Disidratazione <ol><li> Posto scorre in 80% etanolo per 1 minuto. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 95%. </li&gt; <li> Tenere i vetrini in etanolo al 95% per 30 secondi. </li><li> Trasferire i vetrini al 100% di etanolo e tenere premuto 1 minuto. Ripeti. </li><li> Immergere i vetrini in xilene. </li><li> Tenere vetrini in xilene per 1 minuto. Ripeti. </li><li> Immediatamente montare su vetrini coprioggetti usando cytoseal. </li></ol> 8. Diapositiva Labeling <ol><li> Immettere le informazioni di identificazione caso compreso il numero di organi e di blocco, macchia, e la data e la stampa. Numero della sezione di serie è facoltativa per le macchie prima diapositiva di ciascun blocco. I livelli successivi sono indicati con numerazione. </li><li> Posizionare le etichette sulle diapositive. </li></ol> 9. Scansione diapositive <ol><li> Mettere vetrini colorati nel vassoio scanner e la scansione in base alla strumentazione. </li><li> Organizzare le diapositive per tipo di donatore e dei tessuti (testa del pancreas, corpo, coda, milza). </li><li> Vetrini colorati archivio a temperatura ambiente e le diapositive rimanenti non colorati a -20 ° C fino all&#39;uso. </li></ol> 10. RAPPRESERisultati ntative Queste procedure di colorazione sono stati sviluppati per la Rete JDRF per i donatori di organi del pancreas con diabete (nPOD) per fornire la caratterizzazione di base di paraffina e freschi blocchi congelati. Ogni donatore ha una caratterizzazione di base eseguita composto di colorazione a 2 isolati da ogni regione del pancreas (testa, corpo e coda) e la milza (Figura 1, vedi anche modulo di invio caso, appendice 1). La colorazione H &amp; E è condotta utilizzando un Autostainer programmato come per una struttura clinico-clinica con soluzioni di qualità utilizzati in tutto. Come blocchi donatori supplementari sezionate, ognuna ha una diapositiva preso per H &amp; E per mostrare la morfologia dei tessuti. Quando i blocchi sono sezionate volta, come per la distribuzione agli investigatori, i livelli più profondi avrà anche diapositive riprese il rappresentante H &amp; slides E per documentare la morfologia del tessuto l&#39;intero blocco così come numerazione sezioni seriali ad ogni livello. Vetrini colorati sono etichettati condell&#39;individuazione dei casi, regione pancreas, numero di blocco, macchia e la data (Figura 2) e nel sistema di scansione on-line patologia gestione delle informazioni. Immagini rappresentative di un donatore di controllo sono mostrati nella Figura 3 sia a basso ingrandimento e alta per mostrare i risultati attesi seguendo questa procedura. Il tinto diapositiva con il polipeptide pancreatico (D, H) è stato analizzato in un giorno diverso con il test eseguito manualmente e mostra ridotta intensità di colorazione del contrasto ematossilina. Le differenze di intensità di colorazione anticorpi primari o di contrasto tra saggi deve essere evitato soprattutto se utilizzando l&#39;analisi dell&#39;immagine scorre altrimenti con richiedono correzione del colore individuale per ottenere le aree stessa cella o conteggi. Ogni laboratorio deve aspettarsi di ottimizzare le concentrazioni anticorpali da lotto a lotto variazione e altri reagenti e le condizioni possono influenzare l&#39;intensità di colorazione e specificità. Con l&#39;acquisizione di nuove REAsignori, le procedure di colorazione vengono convalidati con noti campioni di controllo positivi e negativi per raggiungere lo stesso grado di intensità macchia con reagenti precedenti. Gli anticorpi ottimizzati nel nucleo nPOD patologia sono riportati nella Tabella 2 come fonte di riferimento e sono stati utilizzati per multilabeling saggi di immunofluorescenza per microscopia confocale. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Griglia di colorazione Dako. Questo schema raffigura una analisi di routine da un donatore di pancreas nPOD eseguita su un Autostainer Dako. I donatori nPOD sono codificati con un numero a 4 cifre di identificazione. Due vassoi di diapositive vengono visualizzati con diapositive organizzate dalla macchia. Configurazioni di scorrimento alternativi sono previsti a seconda del numero di diapositive donatori. I controlli positivi comprendono l&#39;inclusione di un donatore nota positiva per le due macchie doppie e milza dei donatori per la Ki-67 e CD3. I controlli negativi sono di due tipi e comprendono due slides da un blocco donatore pancreas incubati con immunoglobuline (Ig) dalle specie ospite degli anticorpi primari e due scivoli dalla milza dei donatori per l&#39;insulina e il glucagone. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Rappresentante doppio slide colorate. Una diapositiva finito tipica è mostrata con i parametri di etichettatura di diapositive e di collocamento dei tessuti prima della scansione digitale viene eseguita. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Rappresentante H &amp; E e le macchie IHC nelle sezioni pancreatiche. Sezioni da parte del pancreas di un donatore adulto organo femminile (6096-04 Panhead) erano macchiati e scansioni digitali eseguite come descritto nel protocollo. Le immagini sono state ottenute utilizzando il programma ImageScope visualizzazione della intera sezione (AD) e da un isolotto (EH). Le intensità delle isole attesi macchia di insulina, glucagone e polipeptide pancreatico sonoosservati per sezioni BD come sezione D che delimita il blocco testa pancreas contiene una piccola porzione della regione uncinato o lobo ventrale pancreatico come tutte le isole pancreatiche contengono principalmente polipeptide cellule positive. Si noti che il contrasto in ematossilina pannello D è troppo leggero, mentre l&#39;intensità di contrasto in ematossilina B e C sono ottimali. Pannelli EH mostrano un isolotto dal lobo dorsale con la distribuzione prevista dei beta-cellule e α-cellule. A cellule pancreatiche pochi polipeptidiche si trovano nella parte inferiore sinistra della isolotto (H). A, E-H &amp;E; B, F-Ki67 + Insulina, C, G-CD3 + glucagone, D, H-polipeptide pancreatico. AD, 0.2x, EH-12.8x.

<ol><li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li>
<li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).</li>
<li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex%2C+obesity%2C+and+presence+of+type-2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Anat%22%5BJournal%5D)">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li>
<li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+intraepithelial+neoplasia%3A+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells%2C+without+alterations+in+fractional+insulin+area%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li>
<li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li>
<li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreas+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li>
<li>Veld, I. n't, P, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulitis+in+human+type+1+diabetes%3A+The+quest+for+an+elusive+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Standardizzazione delle procedure IHC è fondamentale per l&#39;analisi delle immagini, in particolare quando si utilizzano computer basati su algoritmi in un gran numero di diapositive nel corso del tempo. La procedura di colorazione IHC descritto nella presente relazione permetterà un&#39;analisi lotto di campioni di un donatore data, utilizzando uno Autostainer all&#39;interno di una giornata di 8 ore di lavoro e vengono modificati da una relazione precedente 5. Immagini delle diapositive digitalizzate inte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> 30% perossido di idrogeno (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> Perossidasi endogena blocco </td></tr><tr><td> ABC-fosfatasi alcalina (AP) </td><td> Vettore </td><td> AK-5000 </td><td> AP coniugato </td></tr><tr><td> Anticorpo Diluente </td><td> Invitrogen </td><td> 003218 </td><td> Anticorpo primario </td></tr><tr><td> Avidina blocker </td><td> Vettore </td><td> SP-2001 </td><td> Blocca biotina endogena </td></tr><tr><td> Biotinilato di capra anti-cavia </td><td> Vettore </td><td> BA-7000 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Reagente blu </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Tampone citrato, pH 6,0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> Antigen recupero </td></tr><tr><td> Chiarificatore 1 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Coverslip mezzo di montaggio </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Vettore </td><td> SK-4100 </td><td> HRP cromogeno </td></tr><tr><td> Deeb </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td> Endogena AP blocco reattivo </td></tr><tr><td> Eosina alcolica Y </td><td> FisherScientific </td><td> 71204 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Etanoli-100%, 95%, 90%, 70% </td><td> FisherScientific </td><td> Vario </td><td> Deparaffinizzazione e coprioggetto </td></tr><tr><td> Ematossilina </td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako Autostainer </td></tr><tr><td> Ematossilina 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> IgG (tutte le specie di accoglienza per gli anticorpi primari) </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> I controlli negativi per le primarie </td></tr><tr><td> Liquid Permanent Red (LPR) </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP cromogeno </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare Medical </td><td> MALP521L </td><td> Capra anti-topo coniugato AP </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Medical </td><td> MHRP520L </td><td> Capra anti-topo coniugato HRP </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Medical </td><td> RHRP520L </td><td> Capra anti-topo coniugato HRP </td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> FisherScientific </td><td> Vario </td><td> H 2 O 2 diluente </td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Vettore </td><td> S-1000 </td><td> IHC blocco reattivo </td></tr><tr><td> Cecchino </td><td> Biocare Medical </td><td> BS966M </td><td> IHC blocco reattivo </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHC tampone </td></tr><tr><td> Triology 20x </td><td> Cella Marque </td><td> 920P-06 </td><td> Antigen Retrieval </td></tr><tr><td> Xilene </td><td> FisherScientific </td><td> Vario </td><td> Deparaffinizzazione e coprioggetto </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti specifici. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo primario </td><td> Host specie </td><td> Venditore </td><td> Cat. # </td><td> Commenti e recupero Antigen </td></tr><tr><td> Paraffina </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amilasi </td><td> Mouse </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-46657 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Amylin </td><td> Mouse </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> L&#39;anidrasi carbonica 19,9 </td><td> Mouse </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Caspasi-3, scisso </td><td> Coniglio </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 9961 </td><td> Citrato o Trilogy </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td> Citrato o Trilogy </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> Coniglio </td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Mouse </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 3569 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td> Citrato </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> CD45 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Cromogranina A </td><td> Coniglio </td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> C-peptide </td><td> Coniglio </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 4593 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Foxp3 </td><td> Ratto </td><td> e Bioscience </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> Citrato </td></tr><tr><td> Grelina </td><td> Capra </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td> Grelina </td><td> Coniglio </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> Glucagone </td><td> Coniglio </td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> Glucagone </td><td> Mouse </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Glucagone </td><td> Cavia </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> GLUT-1 </td><td> Mouse </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> Trilogia </td></tr><tr><td> GLUT-2 </td><td> Coniglio </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-9117 </td><td> Non espresso in isole umane </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Cavia </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Ki-67 </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CFP </td><td> Coniglio </td><td> Novus biologica </td><td> NB400-137A </td><td> Trilogia </td></tr><tr><td> Polipeptide pancreatico </td><td> Coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> PDX-1 </td><td> Cavia </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> Citrato o Trilogy </td></tr><tr><td> Proinsulina </td><td> Mouse </td><td> Novocastra </td><td> NCL-proin-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> Proinsulina </td><td> Mouse </td><td> Developmental Studies ibridoma Bank </td><td> GS-9A8 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> Coniglio </td><td> Sigma </td><td> HPA 006641 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Actina del muscolo liscio </td><td> Coniglio </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Somatostatina </td><td> Coniglio </td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Sinaptofisina </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Freschi congelati </td><td> Host specie </td><td> Venditore </td><td> Cat. # </td><td> Comments </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> Ratto </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> Fissare con il 4% PF </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> Coniglio </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> Mouse </td><td> Novus biologica </td><td> NB 600-564 </td><td> Utilizzare una notte di incubazione per le sezioni di paraffina </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> Mouse </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> Fissare con acetone </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> Mouse </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-130569 </td><td> Fissare con il 4% PF </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> Mouse </td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td> Fissare con acetone o 4% PF </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Anticorpi primari. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Aperio Scanscope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> Diapositive scanner digitale </td></tr><tr><td> DAKO Autostainer Plus </td><td> DAKO </td><td></td><td> IHC macchie </td></tr><tr><td> Label Matrix software di stampa </td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td> Presentazione dell&#39;etichetta del software </td></tr><tr><td> Leica XL Autostainer </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E le macchie </td></tr><tr><td> Premium vetrino </td><td> FisherScientific </td><td> 12-548-5J </td><td> Coverslip </td></tr><tr><td> Spectrum Information Manager </td><td> Aperio </td><td></td><td> Scanner software </td></tr><tr><td> SuperFrost Plus scivola </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> Vetrini con carica positiva </td></tr><tr><td> Verdure a vapore </td><td> Black and Decker </td><td> Vario </td><td> Antigen recupero </td></tr><tr><td> Zebra TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> Diapositiva stampante di etichette </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Forniture e attrezzature specifiche.

protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Le stime di superficie delle isole e dei numeri e la composizione delle cellule endocrine nel pancreas umano adulto varia da alcune centinaia di migliaia di intervalli di massa diversi milioni di beta e da 500 a 1-3 mg 1500. Con questa eterogeneità noto, un trattamento standard e procedura di colorazione è stato sviluppato in modo che le regioni del pancreas sono stati chiaramente definiti e isolotti caratterizzate con rigorosa istopatologia ed esami immunolocalizzazione. Procedure standardizzate per l&#39;elaborazione di pancreas umano recuperati da donatori di organi sono descritte nella parte 1 di questa serie. Il pancreas è trasformato in 3 regioni principali (testa, corpo, coda) seguiti da sezioni trasversali. Sezioni trasversali della testa del pancreas sono ulteriormente suddivise, come indicato in base alle dimensioni, e numerati in ordine alfabetico per indicare sottosezioni. Questa standardizzazione permette una completa analisi sezione trasversale della regione della testa, compresa la regione uncinato che contiene composti isolottiprincipalmente da cellule pancreatiche polipeptide regione della coda. La presente relazione comprende parte 2 di questa serie e descrive le procedure utilizzate per il sezionamento seriale e caratterizzazione istopatologica delle sezioni di paraffina del pancreas con un&#39;enfasi sulle cellule endocrine insulari, la replica e T-cellule si infiltra. Patologia delle sezioni pancreatiche è destinata a caratterizzare sia esocrina, dei dotti, e componenti endocrine. Il vano esocrina viene valutato per la presenza di pancreatite (attivo o cronica), atrofia, fibrosi, e grasso, così come il sistema di condotto, in particolare in relazione alla presenza di neoplasia pancreatica intraduttale 4. Le isole vengono valutati per la morfologia, le dimensioni e densità, cellule endocrine, infiammazione, fibrosi, amiloide, e la presenza di cellule replica o apoptotici con H &amp; E e le macchie IHC. Il componente finale descritta nella parte 2 è la fornitura della diapositiva macchiatas come immagini delle diapositive digitalizzate intere. Le diapositive digitalizzate sono organizzati per caso e regione pancreas in un database online patologia la creazione di una biobanca virtuale. L&#39;accesso a questa raccolta online è attualmente previsto a oltre 200 medici e scienziati coinvolti nella ricerca sul diabete di tipo 1. Il database online fornisce un mezzo per la rapida e completa condivisione dei dati e per i ricercatori per selezionare i blocchi di paraffina o congelati sezioni seriali.

Questo video mostra le procedure per la caratterizzazione di isole pancreatiche umane utilizzando ematossilina ed eosina (H &amp; E) e di immunoistochimica (IHC). Sezioni del pancreas di testa, corpo, e le regioni di coda sono macchiati sia da H &amp; E e IHC per determinare la composizione delle isole endocrine (insulina, glucagone e polipeptide pancreatico), la replicazione cellulare (Ki67), e infiltrati infiammatori (H &amp; E, CD3). La regione uncinato è localizzato usando IHC per il polipeptide pancreatico.

Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

Le stime dell'area e del numero delle isole, nonché della composizione delle cellule endocrine nel pancreas umano adulto, variano da diverse centinaia di migliaia a diversi milioni e...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare gli isolotti pancreatici umani mediante colorazione con ematossilina ed eosina e immunohistochimica. Questo viene ottenuto creando sezioni seriali da un campione di pancreas incluso in un blocco di paraffina. Le sezioni vengono quindi posizionate su vetrini mantenendo la loro orientazione originale.Una parte dei vetrini viene colorata con ematina ed eosina, mentre i vetrini rimanenti vengono colorati mediante immunohistochemia; l'ultimo passaggio consiste nello scansionare i vetrini colorati e organizzarli per caso. Infine, queste immagini possono essere caricate su un database online di anatomia patologica, dove possono essere visualizzate da altri ricercatori del settore. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i vetrini vengono colorati in serie mantenendo la loro orientazione originale.La procedura sarà dimostrata da Linda Snyder, istotecnologa, Emily Montgomery, scienziata biologa, e Tiffany Hippo, tecnico di laboratorio nel mio laboratorio. Per iniziare, preparare il bagnomaria e il microtomo seguendo le procedure standard per la microtomia in paraffina. Successivamente, etichettare

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Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Qui, presentiamo la metodologia per generare e somministrare composti di microsfere di acido poli(lattico-co-glicolico) caricate con interessi (PLGA) a isole di topo intatte in coltura con successiva analisi di immunofluorescenza della proliferazione delle cellule β. Questo metodo è adatto per determinare l'efficacia dei mitogeni a cellule β candidate.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Questo protocollo delinea un metodo per l'analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l'analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione diretta e l'analisi funzionale di cellule simili a cellule β. Descriviamo le condizioni e i passaggi di coltura ottimali per le cellule staminali pluripotenti umane prima di generare cellule pancreatiche produttrici di insulina. La differenziazione a sei stadi progredisce dalla formazione definitiva dell'endoderma alle cellule funzionali simili a cellule β che secernono insulina in risposta al glucosio.

Protocollo ottimizzato per la generazione di cellule pancreatiche funzionali secernenti insulina da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo fornisce una guida passo passo per l'approvvigionamento di un pancreas suino per l'isolamento e la purificazione delle isole.

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Questo studio utilizza marcatori di morte cellulare e apoptosi basati sulla fluorescenza multi-colorazione combinati con la microscopia confocale per valutare l'apoptosi indotta da citochine e la morte specifica delle cellule β nelle isole pancreatiche. Rivela cambiamenti spaziali e temporali nella morte cellulare e nell'apoptosi in risposta a stimoli extracellulari.

Trattamento isolato delle isole pancreatiche e misurazione dell'apoptosi

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Impara a caratterizzare le isole pancreatiche umane con colorazione H&E e immunistochimica. Questo metodo consente di valutare la composizione endocrina, la replicazione cellulare e gli infiltrati infiammatori per studi sul diabete.

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