Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare gli occhielli pancreatici umani utilizzando la colorazione con ematina ed eosina e l'immunoistochimica. Ciò si ottiene creando sezioni seriali da un campione di pancreas incorporato in un blocco di paraffina. Le sezioni vengono quindi posizionate sulle diapositive nel loro orientamento originale.

Una parte dei vetrini viene colorata con ematina ed eoina mentre i restanti vetrini vengono colorati mediante immunoistochimica, il passaggio finale consiste nella scansione dei vetrini colorati e nell'organizzarli per caso. In definitiva, queste immagini possono essere caricate in un database di patologia online dove possono essere visualizzate da altri ricercatori del settore. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i vetrini vengono colorati in serie mantenendo il loro orientamento originale.

A dimostrare la procedura saranno Linda Snyder, istologa, Emily Montgomery, biologa, e Tiffany Hippo, tecnico di laboratorio nel mio laboratorio. Per iniziare, impostare il bagnomaria e il microtomo seguendo le procedure standard per la microtomia con paraffina. Etichettare successivamente i vetrini caricati positivamente con il numero del caso, la regione del pancreas e il numero del vetrino.

Una volta preparato tutto, posizionare il blocco di paraffina nel mandrino del microtomo con l'etichetta della cassetta sul lato sinistro. Dopo le normali procedure di microtomia, sezionare il blocco fino a quando il tessuto non è esposto in modo uniforme. Una volta che il tessuto è stato incontrato in modo uniforme, produrre un nastro di sezioni seriali di circa quattro micron di spessore.

Sono necessarie da tre a sei sezioni a seconda del numero di coloranti iniziali richiesti. Quindi, separare le sezioni della barra multifunzione. Raccogli ogni sezione in ordine e posizionala su uno scivolo.

Annota il numero della sezione con una matita. Se una sezione è inutilizzabile, salta quel numero e continua a numerare le sezioni nell'ordine esatto. Fare attenzione a mantenere sullo scivolo lo stesso orientamento che si trova nel cassetto con l'etichetta dello scivolo orientata a sinistra.

Quindi, posiziona i vetrini in una griglia per vetrini e lasciali asciugare per una notte. A temperatura ambiente, richiudere la superficie del blocco di paraffina con un sottile strato di paraffina per preservare il tessuto e archiviarlo a temperatura ambiente o meno 20 gradi Celsius. Ripetere questa procedura per il campione successivo.

È importante mantenere la numerazione per le sezioni seriali ad ogni livello, come visto sopra per la colorazione per h ed e. Posizionare il primo vetrino di ciascun blocco in un rack per vetrini, quindi posizionare il rack nel primo vassoio del coloratore automatico. Selezionare il programma HE standard e avviare il processo di colorazione.

Al termine della colorazione, rimuovere i vetrini dall'auto stainer e posizionarli nel cofano per lo scivolamento del coperchio. Posizionare un vetrino coprioggetto su ogni vetrino utilizzando tecniche standard. Infine, etichettare i vetrini con un'etichetta stampata e lasciarli asciugare completamente nel cappuccio.

Inizia impostando l'autocoloratore e preparando tutti i reagenti necessari. Scegli il programma Daco per doppie macchie. Inserisci il numero di vetrini e il trattamento che ciascuno riceverà.

Caricare tutti i reagenti nell'auto stainer secondo le raccomandazioni del produttore. Successivamente, preparare TBST e citrato, tamponi, anticorpi e altri reagenti necessari per la procedura. Distribuire i vetrini mettendoli in xilene per cinque minuti.

Non lasciare che i vetrini si asciughino in quanto ciò provocherebbe un'eccessiva colorazione dello sfondo e dei pori mentre i vetrini sono depa. Versare il tampone di citrato in una vaporiera per preriscaldare prima dell'uso. Quindi, sottoponi i vetrini depa a una serie di lavaggi con etanolo.

Sciacquare un'ultima volta i vetrini in acqua deionizzata. Aggiungere i vetrini al tampone citrato preriscaldato e lasciarli cuocere a vapore per 30 minuti. Trascorso questo periodo, trasferire immediatamente i vetrini in un bagnomaria a temperatura ambiente fino a quando non si raffreddano completamente.

Una volta raffreddati, trasferire i vetrini nei rack Dayco auto Stainer, avendo cura di mantenere la corretta sequenza. Infine, eseguire il programma di doppia colorazione caricato in precedenza quando il programma di doppia colorazione è stato completato. Rimuovere i vetrini dall'auto stainer e lasciarli asciugare per almeno un'ora prima di disidratarli.

Per continuare la disidratazione, trasferirli all'80% di etanolo per un minuto. Continuare a disidratare i vetrini immergendoli in etanolo al 95% e poi terminare al 100%. Infine, immergere e tenere i vetrini nello xilene per un minuto.

Montare immediatamente le guide con i vetrini coprioggetto utilizzando la guarnizione cyto Per completare la procedura. Stampa etichette che contengono le informazioni sulla custodia, tra cui il numero dell'organo e del blocco, il tipo di macchia e la data. Posiziona un'etichetta su ogni vetrino per scansionare i vetrini delle macchie.

Posizionarli su un vassoio dello scanner e seguire le procedure standard. Archiviare i vetrini colorati a temperatura ambiente e tutti i vetrini rimanenti non colorati a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro. Infine, organizza le immagini colorate per donatore e tipo di tessuto visto.

Ecco un esempio di colorazione con KI 67 più insulina sia a bassi che ad alti livelli di ingrandimento. Le immagini delle sezioni pancreatiche colorate vengono inviate a un database di patologia online creando una biobanca virtuale. Utilizzando questo database, i ricercatori possono accedere rapidamente alle informazioni necessarie per la ricerca e il diabete di tipo uno.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e colorare vetrini di alta qualità dal pancreas umano.