Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci
October 29th, 2018
Questa carta segnala il protocollo per l'analisi di una rapida identificazione per Bemisia tabaci basato sulla tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop (lampada). Il protocollo richiede un addestramento minimo laboratorio e può, pertanto, essere implementato in loco nei punti di ingresso per l'importazione di vegetali quali porti ed aeroporti.
Questo metodo fornisce uno strumento diagnostico veloce e affidabile per l'identificazione di Bemisia tabaci, un parassita invasivo degli insetti che influisce sulla produzione di verdure e colture ornamentali in molti paesi del mondo. Grazie alla sua facilità, il metodo può essere eseguito in loco direttamente nei punti di ingresso per i prodotti di importazione degli impianti, come porti e aeroporti, e ha quindi il potenziale per ridurre la dispersione di Bemisia tabaci lungo le reti di trading. Per iniziare, utilizzare le forbici per tagliare una striscia LAMP a otto tubi in due strisce LAMP a quattro tubi.
Quindi, etichettare i tubi in base allo schema delineato nella figura uno del protocollo di testo. Dopo questo, preparare abbastanza B.tabaci LAMP reaction master mix per 80 reazioni. Quindi, erogare 22,5 microlitri del master mix in ciascuno dei tubi delle strisce LAMP a quattro tubi.
Centrifuga a impulsi e mettili sul ghiaccio. Rapida centrifuga a vortice e impulso B.tabaci LAMP PAC. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri nel tubo etichettato PAC in ciascuna delle strisce LAMP a quattro tubi.
Quindi, chiudere i coperchi e conservare le unità kit B.tabaci LAMP pronte all'uso a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare l'estrazione del DNA, utilizzare stuzzicadenti sterili per trasferire i campioni di insetti in tubi di microcentrifugo da 0,5 millilitri con 30 microlitri di soluzione di estrazione del DNA. Quindi, incubare i campioni per cinque minuti a 95 gradi Celsius in un ThermoMixer impostato su 300 giri/min.
Centrifugare brevemente i campioni con vortice e impulsi. Scongelare uno dei kit B.tabaci LAMP pronti all'uso. Quindi, vortice il kit rapidamente, e impulso centrifugarlo.
Aggiungere 2,5 microlitri di estratto di DNA campione ai tubi S-one e S-two. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri di pura soluzione di estrazione del DNA alcalino al tubo NAC. Dopo aver vorticato e centrifugato l'impulso, inserire il kit in un dispositivo di analisi LAMP ed eseguire analisi di amplificazione del DNA isotermico a 65 gradi Celsius per 60 minuti.
Nella stessa corsa, eseguire un'analisi della temperatura di fusione dei prodotti di amplificazione del DNA riscaldando prima il kit a 98 gradi Celsius e raffreddandolo a 75 gradi Celsius. Convalidare la lettura LAMP utilizzando l'applicazione di convalida LAMP automatizzata. Definire innanzitutto le specie di destinazione e il numero di campioni testati prima di fare clic sul pulsante Genera report.
Infine, trasferire la lettura nei campi di input appropriati dell'applicazione di convalida. Immediatamente dopo l'immissione dei dati, verrà visualizzato il risultato della convalida. In questo protocollo, i campioni di insetti B.tabaci intercettati nel corso del regolare processo di controllo delle importazioni svizzere sono stati analizzati tramite test LAMP.
Su un totale di 80 esemplari analizzati, 75 esemplari sono stati correttamente identificati come veri positivi e due campioni sono stati correttamente identificati come veri negativi. Tre esemplari, tuttavia, erano falsi negativi e sono stati erroneamente identificati come non essere B.tabaci. Un sottoinsieme dei test è stato eseguito in loco da ispettori fitosanitari all'aeroporto di Zurigo.
Nei risultati rappresentativi, i campioni uno e due sono stati correttamente identificati come B.tabaci tramite amplificazione del DNA dopo circa 30 minuti nella temperatura di ricottura prevista di circa 82 gradi Celsius. Dopo il suo sviluppo, questo metodo ha spianato la strada a un'identificazione in loco rapida e facile da eseguire di Bemisia tabaci. Il protocollo è progettato in modo tale che possa essere eseguito da ispettori fitosanitari con una formazione di laboratorio limitata.
Dopo aver convalidato con successo il metodo in un punto di ingresso svizzero per i prodotti di importazione vegetale, il metodo potrebbe essere adattato ad altri agenti patogeni vegetali ma anche, se necessario, ad altri agenti patogeni umani o veterinari.
Panoramica
Questo documento presenta un saggio di identificazione rapida per Bemisia tabaci utilizzando la tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). Il metodo è progettato per l'implementazione in loco nei punti di entrata per le importazioni di piante, richiedendo una formazione minima in laboratorio.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Patologia vegetale
- Gestione delle specie invasive
- Tecnologia diagnostica
Contesto
- Bemisia tabaci è un parassita insetticida invasivo che colpisce le colture in tutto il mondo.
- La rilevazione precoce è cruciale per prevenirne la diffusione.
- I metodi attuali potrebbero non essere adatti per test rapidi in loco.
- La tecnologia LAMP offre una soluzione promettente per una diagnostica rapida.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un saggio rapido e affidabile per l'identificazione di Bemisia tabaci.
- Consentire test in loco nei punti di importazione come aeroporti e porti marittimi.
- Ridurre il rischio di dispersione dei parassiti attraverso il commercio.
Metodi utilizzati
- Preparazione del mix master per la reazione LAMP ed estrazione del DNA.
- Amplificazione isotermica del DNA a 65 gradi Celsius.
- Analisi della temperatura di fusione dei prodotti di amplificazione.
- Validazione dei risultati utilizzando un'applicazione automatizzata.
Risultati principali
- 75 su 80 campioni sono stati correttamente identificati come veri positivi.
- Due campioni sono stati correttamente identificati come veri negativi.
- Tre campioni erano falsi negativi.
- Il metodo è stato con successo validato in loco dagli ispettori.
Conclusioni
- Il saggio LAMP fornisce un metodo rapido ed efficace per l'identificazione dei parassiti.
- Può essere eseguito da individui con limitata formazione in laboratorio.
- Il metodo ha il potenziale per l'adattamento ad altri patogeni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Rapid molecular identification of invasive pests like Bemisia tabaci is critical for preventing agricultural losses and protecting global supply chains. The LAMP assay enables on-site detection at points of entry, reducing reliance on centralized laboratories and accelerating response times. This supports proactive risk management in agricultural biotechnology and international trade compliance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables specific detection of Bemisia tabaci species complex, supporting hypothesis testing in vector-pathogen interaction studies.
- Operational Value: Provides a standardized molecular target for validating insect vector competence in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative amplification signals within 60 minutes, enabling high-throughput screening of insect specimens.
- Operational Value: Uses minimal sample input and stable lyophilized reagents, supporting assay scalability and field deployment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates correlation between vector presence and virus transmission risk in disease-relevant systems.
- Operational Value: Supports longitudinal monitoring of pest populations in controlled environment studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows by providing rapid vector identification prior to pathogen transmission studies, enabling informed sample selection for downstream assays.
- Discovery Biology: Confirms vector identity to reduce false associations in vector-virus interaction experiments.
- Screening: Delivers binary readout (positive/negative) with internal controls, ensuring assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Integrates with automated validation software for standardized data interpretation and cross-laboratory consistency.
- Translational Research: Enables tracking of vector prevalence in geographic regions relevant to emerging plant virus threats.
- Enterprise Reuse: Kit-based design allows reuse across multiple inspection sites and adaptation to other vector species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target confidence by reducing misidentification of insect vectors in biological studies.
- Operational Value: Eliminates need for DNA purification and thermocycling, lowering technical barriers and training requirements.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in pest risk assessments, reducing potential crop loss and economic impact.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of surveillance resources based on validated vector detection data.
Implementation Considerations
- Basic molecular biology training for reagent handling and sample preparation.
- Access to LAMP-capable fluorescence or turbidity detection device.
- Standard operating procedures for sample transport and contamination control.
- Adaptation considerations for different insect species or developmental stages.
- Environmental stability of reagents during field deployment and storage.
