Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci
29 ottobre 2018
Questa carta segnala il protocollo per l'analisi di una rapida identificazione per Bemisia tabaci basato sulla tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop (lampada). Il protocollo richiede un addestramento minimo laboratorio e può, pertanto, essere implementato in loco nei punti di ingresso per l'importazione di vegetali quali porti ed aeroporti.
Questo metodo fornisce uno strumento diagnostico veloce e affidabile per l'identificazione di Bemisia tabaci, un parassita invasivo degli insetti che influisce sulla produzione di verdure e colture ornamentali in molti paesi del mondo. Grazie alla sua facilità, il metodo può essere eseguito in loco direttamente nei punti di ingresso per i prodotti di importazione degli impianti, come porti e aeroporti, e ha quindi il potenziale per ridurre la dispersione di Bemisia tabaci lungo le reti di trading. Per iniziare, utilizzare le forbici per tagliare una striscia LAMP a otto tubi in due strisce LAMP a quattro tubi.
Quindi, etichettare i tubi in base allo schema delineato nella figura uno del protocollo di testo. Dopo questo, preparare abbastanza B.tabaci LAMP reaction master mix per 80 reazioni. Quindi, erogare 22,5 microlitri del master mix in ciascuno dei tubi delle strisce LAMP a quattro tubi.
Centrifuga a impulsi e mettili sul ghiaccio. Rapida centrifuga a vortice e impulso B.tabaci LAMP PAC. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri nel tubo etichettato PAC in ciascuna delle strisce LAMP a quattro tubi.
Quindi, chiudere i coperchi e conservare le unità kit B.tabaci LAMP pronte all'uso a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare l'estrazione del DNA, utilizzare stuzzicadenti sterili per trasferire i campioni di insetti in tubi di microcentrifugo da 0,5 millilitri con 30 microlitri di soluzione di estrazione del DNA. Quindi, incubare i campioni per cinque minuti a 95 gradi Celsius in un ThermoMixer impostato su 300 giri/min.
Centrifugare brevemente i campioni con vortice e impulsi. Scongelare uno dei kit B.tabaci LAMP pronti all'uso. Quindi, vortice il kit rapidamente, e impulso centrifugarlo.
Aggiungere 2,5 microlitri di estratto di DNA campione ai tubi S-one e S-two. Quindi, aggiungere 2,5 microlitri di pura soluzione di estrazione del DNA alcalino al tubo NAC. Dopo aver vorticato e centrifugato l'impulso, inserire il kit in un dispositivo di analisi LAMP ed eseguire analisi di amplificazione del DNA isotermico a 65 gradi Celsius per 60 minuti.
Nella stessa corsa, eseguire un'analisi della temperatura di fusione dei prodotti di amplificazione del DNA riscaldando prima il kit a 98 gradi Celsius e raffreddandolo a 75 gradi Celsius. Convalidare la lettura LAMP utilizzando l'applicazione di convalida LAMP automatizzata. Definire innanzitutto le specie di destinazione e il numero di campioni testati prima di fare clic sul pulsante Genera report.
Infine, trasferire la lettura nei campi di input appropriati dell'applicazione di convalida. Immediatamente dopo l'immissione dei dati, verrà visualizzato il risultato della convalida. In questo protocollo, i campioni di insetti B.tabaci intercettati nel corso del regolare processo di controllo delle importazioni svizzere sono stati analizzati tramite test LAMP.
Su un totale di 80 esemplari analizzati, 75 esemplari sono stati correttamente identificati come veri positivi e due campioni sono stati correttamente identificati come veri negativi. Tre esemplari, tuttavia, erano falsi negativi e sono stati erroneamente identificati come non essere B.tabaci. Un sottoinsieme dei test è stato eseguito in loco da ispettori fitosanitari all'aeroporto di Zurigo.
Nei risultati rappresentativi, i campioni uno e due sono stati correttamente identificati come B.tabaci tramite amplificazione del DNA dopo circa 30 minuti nella temperatura di ricottura prevista di circa 82 gradi Celsius. Dopo il suo sviluppo, questo metodo ha spianato la strada a un'identificazione in loco rapida e facile da eseguire di Bemisia tabaci. Il protocollo è progettato in modo tale che possa essere eseguito da ispettori fitosanitari con una formazione di laboratorio limitata.
Dopo aver convalidato con successo il metodo in un punto di ingresso svizzero per i prodotti di importazione vegetale, il metodo potrebbe essere adattato ad altri agenti patogeni vegetali ma anche, se necessario, ad altri agenti patogeni umani o veterinari.
Panoramica
Questo articolo presenta un saggio di identificazione rapida per Bemisia tabaci basato sulla tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). Il metodo è progettato per essere implementato in loco nei punti di ingresso delle importazioni vegetali e richiede una formazione minima in laboratorio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Patologia vegetale
- Gestione delle specie invasive
- Tecnologia diagnostica
Sfondo
- Bemisia tabaci è un parassita insettivo invasivo che colpisce le colture in tutto il mondo.
- La rilevazione precoce è fondamentale per prevenire la sua diffusione.
- I metodi attuali potrebbero non essere adatti ai test rapidi in loco.
- La tecnologia LAMP offre una soluzione promettente per diagnosi rapide.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio rapido e affidabile per l'identificazione di Bemisia tabaci.
- Consentire test in loco presso punti di importazione come aeroporti e porti.
- Ridurre il rischio di diffusione di parassiti attraverso il commercio.
Metodi Utilizzati
- Preparazione della miscela master per la reazione LAMP ed estrazione del DNA.
- Amplificazione isoterma del DNA a 65 gradi Celsius.
- Analisi della temperatura di fusione dei prodotti di amplificazione.
- Convalida dei risultati mediante un'applicazione automatica.
Risultati principali
- 75 su 80 campioni sono stati correttamente identificati come veri positivi.
- Due campioni sono stati correttamente identificati come veri negativi.
- Tre campioni erano falsi negativi.
- Il metodo è stato convalidato con successo in loco dagli ispettori.
Conclusioni
- Il saggio LAMP fornisce un metodo rapido ed efficace per l'identificazione dei parassiti.
- Può essere eseguito da individui con formazione pratica in laboratorio limitata.
- Il metodo ha un potenziale adattamento ad altri patogeni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione molecolare rapida di parassiti invasivi come Bemisia tabaci è fondamentale per prevenire perdite agricole e proteggere le catene di approvvigionamento globali. Il saggio LAMP consente il rilevamento in loco nei punti di ingresso, riducendo la dipendenza da laboratori centralizzati e accelerando i tempi di risposta. Ciò favorisce una gestione proattiva dei rischi nell'ambito della biotecnologia agricola e della conformità agli scambi internazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente il rilevamento specifico del complesso di specie Bemisia tabaci, supportando la verifica di ipotesi negli studi sulle interazioni tra vettore e patogeno.
- Valore operativo: Fornisce un bersaglio molecolare standardizzato per la validazione della capacità vettoriale negli insetti nei modelli preclinici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera segnali di amplificazione quantitativi entro 60 minuti, consentendo lo screening ad alto rendimento di campioni di insetti.
- Valore operativo: Richiede un quantitativo minimo di campione e reagenti liofilizzati stabili, favorendo la scalabilità del saggio e il suo impiego in campo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la correlazione tra la presenza del vettore e il rischio di trasmissione del virus in sistemi rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Supporta il monitoraggio longitudinale delle popolazioni di parassiti in studi condotti in ambienti controllati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nei flussi di lavoro delle fasi iniziali di scoperta fornendo un'identificazione rapida del vettore prima degli studi sulla trasmissione del patogeno, consentendo una selezione informata dei campioni per i saggi successivi.
- Biologia della scoperta: Conferma l'identità del vettore per ridurre associazioni false negli esperimenti di interazione vettore-virus.
- Screening: Fornisce un risultato binario (positivo/negativo) con controlli interni, garantendo prontezza del saggio e riproducibilità.
- Analisi: Si integra con software di validazione automatizzati per un'interpretazione standardizzata dei dati e coerenza tra laboratori.
- Ricerca traslazionale: Permette il monitoraggio della prevalenza del vettore in aree geografiche rilevanti per minacce emergenti di virus vegetali.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione basata su kit consente il riutilizzo in più siti di ispezione e l'adattamento ad altre specie di vettori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la certezza dell'identificazione riducendo gli errori nell'identificazione degli insetti vettori negli studi biologici.
- Valore operativo: Elimina la necessità di purificazione del DNA e termociclaggio, riducendo le barriere tecniche e i requisiti di formazione.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di tipo "procedere/non procedere" nelle valutazioni del rischio parassitario, riducendo le potenziali perdite di raccolti e l'impatto economico.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei risorse di sorveglianza in base a dati validati di rilevamento dei vettori, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Formazione di base in biologia molecolare per la manipolazione dei reagenti e la preparazione dei campioni.
- Accesso a un dispositivo in grado di rilevare fluorescenza o torbidità adatto alla LAMP.
- Procedure operative standard per il trasporto dei campioni e il controllo della contaminazione.
- Considerazioni sull'adattamento a diverse specie di insetti o stadi di sviluppo.
- Stabilità ambientale dei reagenti durante l'impiego in campo e lo stoccaggio.
