Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura

Questo metodo LAMP per la Salmonella è stato incorporato nel Manuale Analitico Batteriologico della FDA, sia come metodo di screening negli alimenti per animali che come metodo di conferma per eventuali isolati di Salmonella presunti. Il metodo è rapido, affidabile e robusto. Rispetto alla PCR, i suoi principali vantaggi includono test rapidi, strumentazione semplice, un basso tasso di falsi negativi e un flusso di lavoro flessibile.

Lo screening rapido di agenti patogeni come la salmonella svolge un ruolo importante nel rilevare rapidamente un prodotto potenzialmente contaminato e può prevenire malattie o focolai nell'uomo e negli animali. Iniziare preparando i modelli di DNA per il test LAMP. Esistono due tipi di campioni utilizzati per creare modelli di DNA.

Per preparare i modelli da campioni di alimenti per animali, pesare asetticamente 25 grammi di campione di cibo in un sacchetto filtrante sterile. Aggiungere 225 millilitri di acqua peptone tamponata sterile alla sacca e incubarla a 35 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, trasferire un millilitro dal lato filtrato della sacca a una provetta da microcentrifuga.

Centrifugare la provetta a 900 volte G per un minuto. Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga. Centrifugare il campione a 16.000 volte G per due minuti.

E per scartare il surnatante, risospendere il pellet in 100 microlitri del reagente per la preparazione del campione e riscaldarlo a 100 gradi Celsius per 10 minuti in un blocco di calore secco. Quindi, raffreddare il campione a temperatura ambiente e conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Il secondo tipo di campione per questo test LAMP proviene direttamente da presunte colture di salmonella.

Per preparare i modelli di DNA, trasferire 500 microlitri di una coltura di salmonella durante la notte in una provetta da microcentrifuga e riscaldarla in un blocco termico a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, raffreddare il campione a temperatura ambiente e conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Per evitare la contaminazione incrociata, separare fisicamente le aree utilizzate per la preparazione del LAMP Master Mix e l'aggiunta dei modelli di DNA.

Pulire le superfici di lavoro con isopropanolo e una soluzione degradante del DNA e del DNA. Quindi, pulire le pipette e i supporti delle strisce per provette. Scongelare il Master Mix isotermico, il 10X Primer Mix, l'acqua di grado molecolare, il DNA a controllo positivo e i modelli di DNA a temperatura ambiente.

Accendere lo strumento LAMP e inserire le informazioni sul campione pertinenti. Preparare il Master Mix LAMP secondo le indicazioni del manoscritto, agitarlo e centrifugarlo brevemente e distribuire 23 microlitri di Master Mix in ogni pozzetto di una striscia di provetta. Agitare tutti i modelli di DNA e centrifugarli brevemente.

Quindi, aggiungere due microlitri di modello di DNA al pozzetto appropriato e tappare bene il pozzetto. Rimuovere la striscia di provetta dal supporto e muoverla per assicurarsi che tutti i reagenti si siano accumulati sul fondo della provetta. Caricare la striscia di tubi nello strumento LAMP e avviare la corsa LAMP.

Mentre la reazione LAMP è in corso, toccare le schede Temperatura, Amplificazione e Ricottura per vedere le modifiche dinamiche di vari parametri durante l'esecuzione LAMP. I risultati LAMP possono essere visualizzati sul quadro strumenti LAMP in tempo reale o utilizzando il software LAMP. Per interpretare i risultati sul quadro strumenti, aprire la corsa LAMP di interesse.

Osservare le cinque schede associate a ogni corsa. Le schede Profilo e Temperatura mostrano le temperature programmate ed effettive nei pozzetti del campione mentre la reazione LAMP procede. Le schede Amplificazione e Ricottura mostrano le letture della fluorescenza e le variazioni della fluorescenza rispettivamente durante le fasi di amplificazione e ricottura.

La scheda Risultati mostra la vista tabellare dei risultati LAMP che possono essere interpretati secondo le indicazioni del manoscritto. Il secondo modo per visualizzare i risultati LAMP è utilizzare il software LAMP. Per interpretare i risultati con il software, fare clic sull'icona Computer nel pannello di sinistra e navigare fino alla posizione del file per caricare l'esecuzione LAMP di interesse.

Osservare le sette schede associate a ogni corsa. Le schede Profilo e Temperatura mostrano le temperature programmate ed effettive nei pozzetti del campione mentre la reazione LAMP procede. Le schede Amplificazione e Velocità di amplificazione mostrano le letture della fluorescenza e le variazioni della fluorescenza durante la fase di amplificazione.

Le schede Ricottura e Derivato della ricottura mostrano le letture della fluorescenza e le variazioni della fluorescenza durante la fase di ricottura. La scheda Risultati mostra una vista tabulare dei risultati LAMP. Sono disponibili quattro colonne intitolate Nome grafico, Numero pozzetto, Nome pozzo e Valore di picco.

Vengono mostrati i derivati del tempo di amplificazione e della ricottura di tutti gli otto campioni. I risultati possono essere interpretati secondo le indicazioni del manoscritto. Il pannello strumenti LAMP e il software LAMP possono essere utilizzati per visualizzare i risultati del test.

In questa corsa LAMP, i campioni da S1 a S6 sono diluizioni seriali di dieci volte del sierotipo di Salmonella enterica Infantis ATCC 51741, che vanno da 1,1 milioni a 11 unità formanti colonie per reazione. Il controllo positivo, o PC, è Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 a 17.000 unità formanti colonie per reazione, e il controllo senza stampo, o NTC, è l'acqua di grado molecolare. Il pozzetto NTC ha un Tmax in bianco e una temperatura Aneal di circa 81 gradi Celsius sul pannello strumenti LAMP, e un Tmax in bianco e una temperatura in bianco Anneal nel software LAMP.

Il pozzetto di controllo positivo ha un Tmax di sette minuti e 45 secondi e una temperatura di ricottura di circa 90 gradi Celsius su entrambe le piattaforme. I campioni da S1 a S6 hanno un Tmax compreso tra sei minuti e 30 secondi e 12 minuti e 15 secondi e una temperatura di ricottura di circa 90 gradi Celsius, tutti elementi che indicano un rilevamento positivo. La LAMP è molto efficace e genera una grande quantità di DNA.

Pertanto, è fondamentale che vengano utilizzate le migliori pratiche di laboratorio per prevenire la contaminazione incrociata. Usa pratiche simili quando crei i tuoi modelli di DNA, poiché gli arricchimenti da cibo animale contaminato possono avere alti livelli di salmonella. Lo screening dei campioni di alimenti per animali positivi con LAMP deve essere confermato mediante isolamento della coltura seguendo le procedure del Manuale analitico batteriologico della FDA.

I campioni negativi possono essere segnalati come tali. L'incorporazione di questo metodo LAMP nel Manuale analitico batteriologico della FDA apre la strada a una più ampia applicazione di questa tecnologia rapida, robusta e facile da usare nei test di sicurezza alimentare.